Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Titre de l'écran-titre (visionné le 29 juin 2023) / La Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie neuromusculaire héréditaire causée par des mutations dans le gène DMD codant pour la dystrophine, une protéine importante dans le maintien de l'intégrité de la membrane des fibres musculaires. L'absence de la dystrophine se manifeste par la dégénérescence progressive des fibres musculaires à l'effort. La DMD représente un fardeau pour les patients et leurs familles. Elle affecte environ 20 000 nouveaux nés de sexe masculin dans le monde chaque année. Il existe plusieurs approches thérapeutiques allant du ciblage de l'ARNm au remplacement ou substitution de la dystrophine. Cependant, ces traitements sont transitoires et induisent des améliorations phénotypiques limitées. La découverte il y a une dizaine d'années du système CRISPR-Cas a ouvert des possibilités presque illimitées en biologie. Ce système a été modifié et adapté en 2019 pour développer le Prime editing, une technologie dynamique de modification du génome. Cette technologie permet de faire une interconversion de tout nucléotide du génome, des insertions ou des délétions de nucléotides. Le système d'édition est constitué d'un plasmide éditeur (PE2) fait d'une Cas9 nickase fusionnée à une transcriptase inverse et d'un plasmide contenant un ARN guide pour le Prime editing (pegRNA) contenant une séquence espaceur, une séquence d'amorçage et une matrice pour la transcriptase inverse (RTT). Notre étude visait donc à utiliser cette technologie CRISPR-Cas9 Prime editing pour développer une approche de traitement permanent de la DMD. Les deux premiers chapitres de cette thèse présentent de façon approfondie l'état de la littérature actuelle sur les différentes approches thérapeutiques de la DMD. Le premier chapitre décrit les stratégies moléculaires médiant la restauration de la dystrophine. Ces approches incluent la lecture à travers les codons, les sauts d'exons, la modification de l'ADN par la technique CRISPR, la modulation des progéniteurs, le remplacement et la substitution du gène DMD ainsi que la transplantation cellulaire. Le deuxième chapitre apporte plus de détails et de précisions sur les approches CRISPR en développement pour la DMD permettant ainsi de mieux comprendre la pertinence de notre choix technologique (CRISPR-Cas9 Prime editing) pour l'approche que nous avons développé dans cette thèse. Le troisième chapitre de cette thèse vise à démontrer la capacité du Prime editing à introduire ou corriger des mutations ponctuelles dans le gène DMD et permettre l'expression de la protéine dystrophine complète. Initialement, nous avons conçu plusieurs pegRNAs pour introduire les mutations nonsenses présentes dans la population canadienne dans les exons 6, 9, 20, 35, 43, 55 et 61 du gène DMD. Suite à des taux d'édition très faibles variant entre 2 et 10%, plusieurs optimisations dont, les traitements répétés consécutifs, l'usage d'un guide supplémentaire pour induire une autre coupure de l'autre brin d'ADN à distance du site de coupure initial, et l'ajout d'une mutation simultanée dans la séquence adjacente au protoespaceur (PAM) pour préserver la mutation induite, ont permis d'augmenter jusqu'à 5,8 fois le taux d'édition. Ces stratégies ont permis par la suite de corriger la mutation c.428 G>A dans l'exon 6 des myoblastes d'un patient suivi par l'expression de la dystrophine détectée par western blot à partir des protéines provenant de la fusion des myoblastes en myotubes. Le séquençage haut débit analysé par CRISPResso2 a montré un taux d'INDEL inférieur à 1%. Le quatrième chapitre de cette thèse vise à démontrer la capacité du Prime editing à corriger efficacement la mutation c.8713C>T dans l'exon 59 du gène DMD dont la position à +13 nucléotides du site de coupure la rend défavorable pour la correction par Prime editing. Plusieurs variants de PE2 ont été testés et le meilleur variant (SpCas9-NGG) a été choisi pour la suite des expériences. Ajoutées aux optimisations du chapitre 3 précédent, la variation de la longueur du RTT et des mutations synonymes supplémentaires à différentes positions de la cible ont permis d'augmenter jusqu'à 7 fois le taux d'édition. Cette autre stratégie a été utilisée pour la correction de la mutation c.8713C>T dans l'exon 59 des myoblastes d'un patient à un taux de 22% suivi par l'expression de la dystrophine (42%). Le cinquième chapitre de cette thèse a permis de démontrer la capacité du Prime editing à effectuer en plus des substitutions, des délétions et des insertions de nucléotides dans les sites d'épissages afin de médier un saut d'exon et restaurer l'expression de la dystrophine. La stratégie consistait à corriger dans les myoblastes de patients, les mutations causées par les délétions de l'exon 52 et des exons 45-52 en modifiant respectivement les sites donneurs d'épissage des exons 51 et 53 pour les éliminer. Cela a permis la jonction respective de l'exon 50 à l'exon 53 et de l'exon 44 à l'exon 54 pour les délétions 52 et 45-52 respectivement. Ces modifications des sites d'épissage ont permis l'expression de la protéine dystrophine. Ces résultats sont une preuve de principe et démontrent le potentiel de notre approche à modifier efficacement le gène DMD pour médier la restauration de l'expression de la dystrophine chez les patients DMD. Cependant, il sera important de développer un système de livraison efficace en utilisant par exemple un vecteur Dual-AAV ou des particules virales VLPs ayant respectivement des capsides ou des glycoprotéines spécifiques des muscles squelettiques et cardiaques pour un essai in vivo de ces stratégies. Il sera également pertinent de développer une approche Prime editing multiplexe afin de cibler simultanément plusieurs mutations du gène DMD et examiner les effets hors cibles et immunologiques de cette dernière. / Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is an inherited neuromuscular disease caused by mutations in the DMD gene encoding dystrophin, a protein involved in maintaining muscle fibers membrane integrity. The absence of dystrophin leads to a progressive muscle wasting due to muscle contractions. DMD represents a burden for patients and their families. It affects approximately 20,000 newborn males worldwide each year. There are several therapeutic approaches ranging from mRNA targeting to dystrophin replacement or substitution. However, these treatments are transient and induce limited phenotypic improvements. The discovery a decade ago of CRISPR-Cas system opened almost unlimited possibilities in biology. This system was modified and adapted in 2019 to develop the Prime editing, a dynamic genome editing technology. That technology makes possible the interconversion of any nucleotide of the genome, and the insertions or deletions of nucleotides. The editing system consists of a prime editor plasmid (PE2) made of a Cas9 nickase fused to a reverse transcriptase and a plasmid encoding a Prime editing guide RNA (pegRNA) containing a spacer sequence, a primer binding site (PBS) sequence and a reverse transcriptase template (RTT). Our study therefore aimed to use this CRISPR-Cas9 Prime editing technology to develop a permanent treatment approach for DMD. The first and second chapters of this thesis present in depth the state of the current literature on the different DMD therapeutic approaches. The first chapter describes the molecular strategies involved in the dystrophin restoration. These approaches include read through codon, exon skipping, CRISPR DNA editing, progenitor modulation, DMD gene replacement or substitution, and cell transplantation. The second chapter provides more details and precisions on the CRISPR approaches in development for DMD, thus allowing a better understanding of the relevance of our technological choice for the approach that we have developed in this thesis. The third chapter of this thesis aims to demonstrate the ability of Prime editing to introduce or correct point mutations in the DMD gene and restore the expression of the dystrophin protein. We initially designed several pegRNAs to induce the nonsense mutations present in the Canadian population in exons 6, 9, 20, 35, 43, 55 and 61 of the DMD gene. Following very low editing rates varying from 2 to 10%, several optimizations including consecutive repeated treatments, the use of an additional sgRNA to induce a second nick at a distance from the initial nick site, and the simultaneous mutation in the protospacer adjacent motif (PAM) to preserve the induced mutation, permitted to increase by 5.8-fold the editing rate. These strategies subsequently made possible to correct the c.428 G>A mutation in exon 6 of a patient's myoblasts. That was followed by dystrophin expression detected by western blot from proteins coming from the fusion of the myoblasts in myotubes. High-throughput sequencing analyzed by CRISPResso2 showed an INDEL rate less than 1%. The fourth chapter of this thesis aims to demonstrate the ability of Prime editing to efficiently correct the c.8713C>T mutation in exon 59 of the DMD gene whose position at +13 makes it unfavorable to the correction by Prime editing. Several PE2 variants were tested, and the best variant (SpCas9-NGG) was chosen for further experiments. Added to the optimizations of the previous chapter 3, varying the RTT length and additional synonymous mutations at different positions beside the target increased the editing rate by 7-folds. This other strategy was used for the correction of the c.8713C>T mutation in exon 59 of a patient's myoblasts at the editing rate of 22% followed by the dystrophin expression (42%). The fifth chapter of this thesis has demonstrated the ability of Prime editing to perform in addition to substitutions, deletions, and insertions of nucleotides in the splice sites to mediate exon skipping and restore the dystrophin expression. The strategy consisted of correcting in patient myoblasts, the mutations caused by the deletions of exon 52 (Del52) and exons 45-52 (Del45-52) respectively by modifying the splice donor sites of exons 51 and 53 for their skipping. This allowed the binding of exon 50 to exon 53 and exon 44 to exon 54 respectively for Del52 and Del45-52 permitting the expression of the dystrophin protein. These results are a proof of concept and demonstrate the potential of our approach to effectively modify the DMD gene to mediate the dystrophin restoration in DMD patients. However, it will be important to develop an efficient delivery system using for example a Dual-AAV vector or virus like particles (VLPs) with skeletal and cardiac muscle-specific capsids or glycoproteins, respectively, for in vivo experimentation of these strategies. It will also be relevant to develop a multiplex Prime-editing approach to simultaneously target multiple DMD gene mutations and examine the off-target and immunological effects.

L’immaturité pulmonaire caractérisée par un défaut en surfactant est très fréquente chez le nouveau-né prématuré, particulièrement chez les plus jeunes. La sévérité du syndrome de détresse respiratoire (SDR) et le taux de mortalité qui y est associé ont été considérablement réduits par l’administration anténatale de glucocorticoïdes. En plus, les traitements administrant du surfactant exogène, qui compense l’immaturité, et l’amélioration des protocoles de ventilation assistée ont contribué à ces progrès. Toutefois, le SDR reste plus fréquent chez les enfants de sexe masculin que féminin. Le sexe fœtal est alors un facteur déterminant dans les processus de développement et de maturation pulmonaire où la maturation des pneumocytes de type II marque le début de la montée de synthèse et de la sécrétion du surfactant. Chez l’enfant né prématurément, la structure du poumon est simplifiée. Les saccules distales sont indifférenciées, les parois paraissent plus larges et on observe un faible développement microvasculaire. Le poumon verra sa surface alvéolaire augmenter vers la 30e semaine de gestation tandis que la septation alvéolaire des saccules distales commencera vers la 32e semaine de gestation. Durant cette maturation structurale du poumon, des interactions entre le mésenchyme et l’épithélium vont être impliquées dans la régulation de différents processus via des facteurs paracrines. Chez le garçon, la maturation est retardée par les androgènes, conduisant à un délai dans la synthèse du surfactant pulmonaire. Dans le but de développer de nouvelles cibles pharmacologiques, nous avons étudié les différences temporelles et sexuelles dans les transcriptomes des cellules fibroblastiques et épithéliales pulmonaires chez la souris durant les jours de gestation 17 .5, 18.0 et 18.5. Nous avons utilisé une approche de biopuce ADN durant une fenêtre de gestation qui encadre la montée de synthèse du surfactant, qui est asynchrone entre femelles et mâles en défaveur de ces derniers. Différents profils d’expression des gènes du poumon ont été obtenus entre les jours de gestation 17.5, qui correspond au stade canaliculaire, et 18.5, qui correspond au début du stade sacculaire. Les résultats ont montré que 347 gènes présentaient une différence d’expression en fonction du temps dans les cultures de fibroblastes contre 116 gènes dans les cultures épithéliales. Le gène Cox-1, impliqué dans la synthèse des prostaglandines présentait une expression qui diminuait entre les jours de gestation 17.5 et 18.5. Pour le gène Sema3A impliqué dans la différenciation des cellules épithéliales, et le gène Lemd2, un régulateur négatif de la signalisation PI3K/MAP kinase, on observait une augmentation de leur niveau d’expression entre les jours de gestation 17.5 et 18.5. De plus, nos résultats indiquent que le nombre de gènes exprimé avec des différences sexuelles évolue à la hausse en fonction du temps de gestation. Dans les cellules épithéliales, 3276 transcrits présentant une différence sexuelle dans leur niveau d’expression au jour gestationnel 18.5 ont été identifiés. Ils sont principalement impliqués dans la prolifération et la croissance cellulaire, les interactions cellulaires, le métabolisme des lipides et l’apoptose. Plusieurs voies de signalisation, dont celles de TGF, FGF, IGF et WNT présentaient des différences sexuelles. Des modulations temporelles et sexuelles spécifiques aux types cellulaires ont été observées pour plusieurs gènes, ce qui pave la voie au développement de nouvelles cibles pharmaceutiques. / Pulmonary immaturity characterized by the deficiency absence of surfactant is frequent for premature babies, especially for those who born before the 32nd week of gestation. The severity of respiratory distress syndrome of the neonate (RDS) and the related mortality rate have been reduced substantially by antenatal administration of glucocorticoids. Moreover, exogenous surfactant therapy and ventilation strategies also have contributed to this progress. However, RDS is still more frequent for boys than girls. Fœtal sex is thus a critical factor for fœtal lung maturation. For babies born prematurely, lungs structure is simplified. The distal saccules are undifferentiated. Pulmonary walls seem thicker and the microvasculature is underdeveloped compared with normal lungs. Alveolar surface of normal lungs increases from the 30th week of gestation, while saccularization starts around the 32nd week of gestation. During this lung structural maturation, interactions between mesenchymal and epithelial cells involving paracrine factors are involved in the regulation of different processes. For males, maturation is delayed by androgens, leading to a delay in the surge of surfactant synthesis in type II pneumocytes. In order to develop novel pharmaceutical targets, we have studied the effect of sex and gestation time on the transcriptome of cultured mouse pulmonary fibroblasts and epithelial cells isolated on gestation day 17.5, 18.0 and 18.5. We used DNA microarrays during a gestation period overlapping the surge of surfactant synthesis, which occurs later in males. Different expression profiles were obtained on gestation day 17.5, corresponding to the canalicular stage, compared with gestation day 18.5, corresponding to the beginning of the saccular stage. Our data indicated that 347 genes were expressed differently according to gestation time in lung fibroblast cultures, while only 116 genes presented such a variation in epithelial cell cultures. The expression levels of Cox-1, involved in prostaglandin synthesis, decreased from gestation day 17.5 to 18.5. For Sema3A, involved in epithelial cell differentiation, and Lemd2, encoding for a negative regulator of PI3K/MAP kinase signalling, we observed an increase in expression from gestation day 17.5 to GD 18.5. Moreover, our results show that the number of genes expressed with a sex difference increased according to gestation time. In epithelial cells, 3,276 transcripts presenting a sex difference in their expression level on gestation day 18.5 have been identified. They are mainly involved in cell proliferation and growth, cell-cell interaction, lipid metabolism, and apoptosis. Several signalling pathways including those of TGF, FGF, IGF and WNT showed sex differences. Time- and sex-related modulations were observed for various genes in specific cells, which pave the way to the development of novel pharmaceutical targets.

Le potentiel de la thérapie génique pour le traitement de maladies a engendré beaucoup d'espoirs et d'importants efforts ont été réalisés dans ce domaine de recherche. A l'heure actuelle, les vecteurs viraux sont les plus efficaces pour transférer des gènes thérapeutiques dans les cellules humaines. Alors que différents vecteurs viraux sont en développement, les vecteurs rétroviraux dérivés du virus de la leucémie murine de Moloney (MLV) sont actuellement parmi les vecteurs les plus utilisés dans les essais cliniques. Le premier objectif de ce projet était d'étudier l'efficacité d'un nouveau vecteur d'encapsidation dérivé d'un autre retrovirus, le virus RDI 14. Nous avons démontré pour la première fois que des titres élevés pouvaient être obtenus avec des particules rétrovirales RDI 14. Ces vecteurs ont été aussi efficaces que les vecteurs MLV pour transduire des lymphocytes primaires et des cellules souches humaines CD34+. Par conséquent, les vecteurs rétroviraux dérivés du virus RDI 14 sont efficaces pour le transfert de gènes et peuvent être une alternative aux vecteurs MLV. La production de vecteurs rétroviraux pour des applications cliniques est difficile, dispendieuse et peu sécuritaire, car les lignées cellulaires qui les produisent poussent de façon adhérentes et en présence de sérum bovin. Le second objectif était de générer des nouvelles lignées d'encapsidation capables de répondre à ces limitations. Dans cette étude, nous rapportons la construction des premières lignées d'encapsidation produisant des vecteurs rétroviraux en suspension et en milieu sans sérum (MSS). Des cellules 293HEK ont été dans un premier temps modifiées pour exprimer des niveaux élevés de protéines gag-pol. Les gènes codant pour les protéines d'enveloppes Ampho, GALV et RDI 14 ont été par la suite utilisés pour générer trois lignées d'encapsidations différentes (293GP-A2, 293GP-GLV9 et 293GP-RD30). Les titres obtenus avec les clones 293GP-A2, 293GP-GLV9 et 293GP-RD30 en suspension et en MSS étaient respectivement de 4 x IO7, IO6 et 5 x IO6 particules virales infectieuses par ml (PVI/mL). La caractérisation des ces lignées a été réalisée par l'étude des dynamiques de croissance cellulaire, de la stabilité de production, de la stabilité des particules virales et de la capacité de transduction. Les résultats ont montré que les lignées 293GP-A2, 293GP-GLV9 et 293GP-RD30 ont un bon potentiel pour la production à grande échelle de vecteurs rétroviraux. Ces lignées d'encapsidations devraient améliorer l'efficacité des protocoles cliniques de thérapie génique de dernière phase qui font appel à un nombre élevé de patients.

Titre de l'écran-titre (visionné le 12 janvier 2024) / Les protéines sont des machines moléculaires essentielles au fonctionnement des organismes vivants. Malgré plus de 60 ans de recherche en ce sens, notre compréhension des mécanismes qui façonnent leur évolution reste loin d'être complète. Les nouvelles méthodes d'édition de génome offrent de nouvelles possibilités en termes de méthodologie pour l'étude à haut débit de l'effet des mutations sur la fonction des protéines. Les connaissances découlant de ces nouvelles approches ont un potentiel important pour améliorer la santé humaine, animale et végétale. Les travaux effectués dans le cadre de cette thèse ont en premier lieu élaboré une nouvelle méthodologie basée sur l'édition de base pour l'étude à haut débit de l'effet des mutations sur la fonction des protéines. Cette approche a identifié plus de 700 sites ayant une importance fonctionnelle dans les gènes essentiels de levure. Les données générées par cette expérience ont aussi permis d'identifier des propriétés de sgRNA déterminantes pour l'efficacité de l'édition base. Dans le deuxième chapitre, nous avons utilisé une approche de mutagenèse systématique pour caractériser les mutations menant à la résistance à un antifongique, la 5-fluorocytosine, dans le gène FCY1. Nous avons en même temps pu mesurer les compromis résistance-fonction pour les mutants de ce gène, et pu valider la capacité de notre jeu de données à prédire le phénotype de résistance de mutants d'orthologues provenant d'espèces de levures pathogènes. Finalement, nous avons utilisé nos connaissances des propriétés de FCY1 acquises au chapitre précédent pour en faire un modèle d'évolution des protéines. Plus précisément, nous avons exploré le rôle potentiel de l'épistasie en trans entre des mutants de perte de fonction dans la transition d'un complexe homomérique vers hétéromérique suite à une duplication de gène. Nous avons découvert des centaines de paires d'allèles inactifs de FCY1 pouvant se complémenter, et avons pu explorer les propriétés de ces mutants et des complexes hétéromériques résultants. / Proteins are molecular machines essential to the functioning of living organisms. Despite more than 60 years of research in this direction, our understanding of the mechanisms that shape their evolution remains far from complete. Recently developed genome tools methods offer new possibilities in terms of methodology for the high-throughput study of the effect of mutations on protein function. The knowledge resulting from these new approaches has significant potential in human, animal, and plant health. In the first chapter of this thesis, we developed a new methodology based on base editing for the high-throughput study of the effect of mutations on protein function. This approach identified more than 700 sites of functional importance in essential yeast genes. The data generated by this experiment also made it possible to understand sgRNA properties that are decisive for the efficiency of base editing. In the second chapter, we used a systematic mutagenesis approach to characterize the mutations leading to resistance to an antifungal, 5-fluorocytosine, in the FCY1 gene. At the same time, we measured the resistance-function trade-offs for mutants of this gene and validated the ability of our dataset to predict the resistance phenotype of orthologous mutants from pathogenic species. Finally, we used our knowledge of the properties of FCY1 acquired in the previous chapter to use it as a model for protein evolution. Specifically, we explored the potential role of trans epistasis between loss-of-function mutants in the transition from a homomeric to a heteromeric complex following gene duplication. We have discovered hundreds of pairs of inactive FCY1 alleles that can complement each other, and have been able to explore the properties of these mutants and the resulting heteromeric complexes.

Cette thèse de doctorat porte dans l’ensemble une étude approfondie sur une technologie émergente pour l’amplification isotherme des acides nucléiques appelée recombinase polymerase amplification (RPA). L’introduction porte une description détaillée sur la RPA. Cette revue de littérature documente et discute les diverses applications de la RPA en soulignant les connaissances actuelles concernant les applications diagnostiques. Malgré la composition complexe de la RPA (6 à 7 protéines dans le même mélange réactionnel), cette dernière s’avère une technologie rapide (générant des résultats < 20 min), spécifique et sensible (détection de l’ordre de quelques copies de génome), et largement appliquée dans différentes disciplines. Ces avantages nous permettent de croire que la RPA possède la flexibilité nécessaire pour être utilisée comme outil de diagnostic rapide des maladies infectieuses en réduisant le temps d’obtention des résultats à moins d’une heure au lieu de 2 à 3 jours avec les tests de cultures standards. En conséquence, il sera possible d’intégrer la RPA dans des plateformes microfluidiques ou laboratoire sur puce qui permettent la préparation d’échantillons, l’amplification et la détection des acides nucléiques des microbes causant des infections. En premier lieu, les travaux de cette thèse ont généré des lignes directrices additionnelles pour la conception des amorces/sondes RPA. En second lieu, nos travaux ont permis de développer un essai diagnostic RPA pour la détection des streptocoques du groupe B, responsables de la septicémie et la méningite chez les nouveau-nés. Cet essai fut le premier à évaluer la performance de la RPA avec des échantillons cliniques humains. Ce test diagnostic RPA a été comparé à une méthode de référence, la réaction en chaîne par polymérase (PCR). Cette démonstration sur des échantillons cliniques nous à inciter à pousser notre étude pour réaliser le dernier objectif de ce projet qui consistait à automatiser la RPA par intégration dans un système microfluidique miniaturisé centripète. Une collaboration avec des experts en génies et en matériaux a permis de générer un dispositif microfluidique appelé blade ainsi de l’instrument impliqué dans l’opération des différentes tâches mécanistiques. Ces résultats préliminaires suggèrent qu’il sera important d’offrir un système automatisé complet applicable au chevet du patient. Par conséquence, il sera possible d’exécuter une analyse complète des agents infectieux en moins d’une heure sans le besoin des procédures complexes de préparation et de transport des échantillons cliniques ni le recours à du personnel qualifié. / This dissertation consists of an exhaustive study on an emerging technology for isothermal amplification of nucleic acids called recombinase polymerase amplification (RPA). The introduction of this thesis is a detailed description of the RPA. This review documents and discusses the various applications of this technology by pointing to the current knowledge about RPA for diagnostic applications. Despite the complex composition of RPA (6 to 7 proteins in the same reaction mixture), the latter was shown to be rapid (generating results in < 20 min), specific and sensitive (detecting few target genome copies), and applied widely in different fields. Based on these advantages, we assume that RPA has a flexibility allowing it to be used for the rapid diagnosis of infectious diseases thus reducing time-to-result to less than an hour. Consequently, it will be possible to integrate RPA in microfluidic platforms providing a lab-on chip system. The first part of this doctoral project generated additional guidelines for RPA primers/probes design to develop specific RPA diagnostic assays. Second, we developed an RPA diagnostic test for the detection of group B streptococci, responsible for sepsis and meningitis in newborns. This assay was the first to evaluate RPA with human clinical samples. This diagnostic test was compared to a reference method, the polymerase chain reaction (PCR). This demonstration with clinical samples served to carry out the final objective of this project that was to automate RPA in a miniaturized microfluidic centripetal system. Collaboration with engineers and experts in materials has generated the microfluidic device called "blade" and the instrument involved in the operation of various mechanistic tasks. These preliminary results suggested that it will be important to provide an automated system applicable at bedside. Consequently, it will be possible to perform a complete analysis of infectious agents in less than an hour without the need for complex procedures for the preparation and transport of clinical specimens or the assistance of qualified personnel.

L'objectif de cette thèse est de déterminer et d'analyser les gènes les plus exprimés, les gènes domestiques ainsi que les gènes spécifiques dans 15 tissus différents à l'aide de la méthode SAGE. La méthode d'analyse sérielle d'expression génique (SAGE) est une nouvelle technique qui permet de caractériser globalement tous les transcrits qui s'expriment dans une cellule ou dans un organe, et ce, de manière quantitative.

La maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC) se caractérise par une obstruction non complètement réversible des voies aériennes. De récentes études de criblage génomique par association ont identifié quatre régions chromosomiques associées à la MPOC. Par contre, les mécanismes moléculaires responsables de ces associations génétiques demeurent inconnus. Dans le cadre de cette étude, nous avons obtenu les profils d'expression des gènes de tissus pulmonaires non-tumoraux et les génotypes de 1,2 million de variations génétiques pour ces mêmes patients. Les analyses furent effectuées sur 1111 sujets provenant de trois cohortes. Des marqueurs génétiques influençant l'expression des gènes dans les poumons, c.-à-d. « expression Quantitative Trait Loci » (eQTLs) pulmonaires, furent identifiés dans les régions chromosomiques d'intérêts. Les résultats de ce mémoire démontrent que HHIP serait le gène causal dans la région 4q31, alors que les évidences pointent vers les gènes FAM13A et EGLN2 pour les régions 4q22 et 19q13, respectivement. / Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is characterized by airflow obstruction that is not fully reversible. Recent genome-wide association studies have identified four susceptibility loci robustly associated with COPD. However, the genetic mechanisms mediating the risk within these loci remain to be found. In this study, genome-wide gene expression profiles of non-tumor lung specimens and blood-DNA from the same patients were genotyped for 1,2 million SNPs. The analyses were performed on 1111 subjects from three cohorts. Genetics variations influencing gene expression levels in lung samples, i.e. lung expression quantitative trait loci (eQTLs), were identified in the COPD susceptibility regions (4q22, 4q31, 19q13). The results of this thesis demonstrated that HHIP is the most likely causal gene at 4q31, while the evidences supported the contribution of the FAM13A and EGLN2 genes at 4q22 and 19q13, respectively.

Les glioblastomes sont des tumeurs du système nerveux central hautement létaux. Ils se caractérisent par leur grande infiltration dans les tissus avoisinants. Ils modifient les vaisseaux sanguins préexistants et ils migrent d’une façon perivasculaire. Cette cooption vasculaire est un processus entraînant l’expression d’Angiopoietine-2 (Angpt2) par des cellules endothéliales et sa liaison au récepteur Tie2. Le premier objectif de cette étude était d’examiner le potentiel thérapeutique de deux protéines qui pourraient interférer avec Angpt2, à savoir Angpt3 et la partie soluble extracellulaire du récepteur Tie2 (sTie2). Le deuxième objectif était de développer des vecteurs lentiviraux capables d’exprimer ces protéines, tout en offrant la possibilité d’identifier et détruire les cellules génétiquement modifiées. À cette fin, nous avons construit un vecteur contenant une cassette bicistronique qui exprime le marqueur amélioré de la protéine fluorescente verte (EGFP) fusionnée au gène suicide provenant du virus herpès simplex de type I-thymidine kinase (HSVtk). Les cellules du gliome GL261 transduites avec ce vecteur pourraient être suivies et tuées sur demande par l’administration de la prodrogue ganciclovir, soit in vitro, soit après l'implantation dans le cerveau des souris. Malgré l’expression des hauts niveaux d’Angpt3 et de sTie2 obtenus avec ce vecteur, nous avons observé qu’Angpt3 augmente la déstabilisation capillaire et la croissance de gliomes, alors que sTie2 n’exerce aucun effet. Globalement, cette étude a permis de comprendre l’importance de la voie de signalisation de Tie2 dans le développement des gliomes et le rôle d’Angpt3, mais suggère que ni cette molécule ni sTie2 soient des agents efficaces contre les gliomes malins. Cette étude fournit également le prototype d’un vecteur lentiviral pour la thérapie génique plus sécuritaire. / Glioblastomas are highly lethal tumors of the central nervous system characterized by large spread into the surrounding tissues. They modify and migrate along pre-existing blood vessels. This vascular cooption is a process involving the release of angiopoietin-2 (Angpt2) from endothelial cells and binding to the Tie2 receptor. The first goal of this study was to examine the therapeutic potential of two proteins that could interfere with Angpt2, namely Angpt3 and the soluble extracellular domain of Tie2 (sTie2). The second goal was to develop a lentiviral vector capable of delivering such proteins while offering the possibility to identify and destroy the genetically modified cells. To this end, we designed a bicistronic construct expressing the marker enhanced green fluorescent protein (EGFP) fused to the suicide gene herpes simplex virus 1-thymidine kinase (HSVtk). GL261 glioma cells transduced with this vector could be tracked and killed on command by the administration of the prodrug ganciclovir, either in vitro or after implantation into mouse brains. High levels of Angpt3 or sTie2 could be achieved with this vector; however, Angpt3 increased capillary destabilization and glioma growth, whereas sTie2 exerted no effect. Overall, this study helps to understand the importance of the Tie2 signaling pathway in glioma development and the role of Angpt3, but suggests that neither this molecule nor sTie2 are effective agents against malignant gliomas. This study also provides a lentiviral vector design for safer gene therapy.

L’épidermolyse bulleuse dystrophique récessive est une maladie génétique rare causée par des mutations dans COL7A1 codant pour le collagène de type VII. Cette protéine est produite par les kératinocytes de l’épiderme et les fibroblastes du derme et permet la formation des fibrilles d’ancrages dont le rôle est l’adhésion de l’épiderme au derme sous-jacent. Les patients atteints de l'EBDR souffrent de décollements de la peau et des muqueuses et aucun traitement ne permet de guérir cette maladie. Le but de ce projet est de construire un vecteur viral sécuritaire contenant l'ADNc de COL7A1 et de générer un clone de cellules productrices de virus à haut titre permettant de transduire assez de kératinocytes souches pour produire des peaux reconstruites et traiter les patients atteints de l'EBDR. Divers vecteurs rétroviraux "self-inactivated" exprimant l'ADNc de gfp ou de COL7A1 ont été générés. Les vecteurs GFP ont permis de déterminer que le remplacement de la région U3 du LTR 5' par l'enhancer et le promoteur du CMV, l'ajout de la séquence WPRE en 3' UTR du transgène, l'insertion de la séquence de polyadénylation du SV40 dans la région R du LTR 3' et l'ajout de la séquence de polyadénylation de bGH en aval du LTR 3', génèrent les titres viraux les plus élevés. L'ADNc de COL7A1 a été introduit dans un rétrovirus SIN optimisé puis transfecté dans une lignée d’encapsidation exprimant l’enveloppe Amphotropique 4070A. Un clone de cellules productrices produisant 9,8 x 105 particules virales par mL a été isolé. Le virus produit par ce clone est capable de transduire les kératinocytes et fibroblastes de patients atteints de l'EBDR à un taux de transduction de 37 % et 24 % respectivement. En somme, un clone de cellules productrices d’un vecteur rétroviral sécuritaire portant COL7A1 a été généré et a le potentiel d’être utilisé pour la thérapie génique de l’EBDR. / Recessive dystrophic epidermolysis bullosa is a rare genetic disorder caused by mutations in COL7A1 encoding type VII collagen. This protein is produced by the epidermal keratinocytes and dermal fibroblasts and allows the formation of anchor fibrils whose role is the adhesion of the epidermis to the underlying dermis. Patients with EBDR suffer from skin and mucosal detachments and no treatment can cure this disease. The goal of this project is to construct a safe viral vector containing COL7A1 cDNA and to generate a high-titer virus-producing cell clone in order to transduce enough keratinocytes stem cells to produce reconstructed skins to treat patients with EBDR. Various self-inactivated retroviral vectors expressing gfp or COL7A1 cDNA have been generated. The GFP vectors allowed us to determine that the replacement of the U3 region of the 5' LTR by the CMV enhancer and promoter, the addition of the WPRE sequence to the 3 'UTR of the transgene, the insertion of the SV40 polyadenylation sequence into the R region of 3' LTR and the addition of the polyadenylation sequence of the bGH downstream of the 3' LTR generate the highest viral titers. COL7A1 cDNA was introduced into an optimized SIN retrovirus and transfected into a packaging cell line expressing the Amphotropic envelope 4070A. A clone of packaging cells producing 9.8 x 105 viral particles per mL was isolated. The virus produced by this clone is capable of transducing the keratinocytes and fibroblasts of patients with EBDR at a transduction rate of 37 % and 20 % respectively. In sum, a clone of cells producing a safe COL7A1 retroviral vector has been generated and has the potential of being used for gene therapy of EBDR.