O objetivo deste estudo foi descrever a distribuição dos neurofilamentos (NFs) e da proteína associada ao microtúbulo do tipo 2 (MAP-2) em retinas humanas e murinas. Para isso, usamos camundongos C57BL/6, submetidos à cirurgia estereotáxica para realização de lesão eletrolítica no colículo superior direito provocando degeneração retrógrada de células ganglionares da retina. Utilizamos ensaios de imunohistoquímica e PCR em tempo real (qPCR) para a caracterização dessas proteínas nas duas espécies. Na retina humana, observou-se que NFs e MAP-2 estão presentes nas células ganglionares do tipo M. No modelo animal, houve diminuição dos NFs e aumento de MAP-2, na análise de imuno-histoquímica. Já o ensaio com qPCR mostrou um aumento e diminuição da expressão dos NFs e MAP-2, respectivamente. Assim, concluímos que houve alterações na expressão do RNAm e na marcação dos NFs e do MAP-2 nas retinas murinas, e esses resultados podem ser extrapolados para os seres humanos, uma vez que essas proteínas estão presentes nas células M que são inicialmente afetadas no glaucoma. / This study aimed to describe the distribution of NFs and type 2 protein associated with microtubule (MAP-2) in human retinas of these proteins and evaluate a model of retrograde retinal ganglion cell degeneration in murine retinas. To achieve this, we submitted C57bl/6 to a stereotaxic surgery for superior colliculus electrolytic lesion in the right side. The characterization of these proteins was obtained through immunohistochemical essays and real-time PCR (qPCR). The results revealed that both proteins are present in the ganglion cell M in the human retina. In the experimental animal model the immunohistochemical essays demonstrated decrease of NFs and increased MAP-2. However, the qPCR analysis demonstrated increased NFs and decreased MAP-2 expression. We can conclude that there was variation of mRNA expression and structural protein levels in the experimental retina. And, the results related to NFs and MAP-2 in this animal model can be extrapolated to humans, as these proteins are also present in the human ganglion cell that are affected early in glaucoma.

Résumé:IntroductionLa chirurgie reste le seul traitement à visée curative pour les patients porteurs d’un cancer colorectal (CCR) primitif ou métastatique. L’établissement précis de l’extension de la maladie, au niveau de la tumeur primitive, des ganglions loco-régionaux et des métastases à distance représente un élément essentiel pour la prise en charge thérapeutique. Les ganglions locorégionaux et la technique du ganglion sentinellePour les patients présentant un CCR non métastatique, l’analyse pathologique des ganglions (pN) conditionne la décision d’administrer ou non une chimiothérapie adjuvante. Les patients présentant un envahissement ganglionnaire (pN+) recevront un traitement adjuvant, celui-ci n’étant le plus souvent pas indiqué chez les patients sans envahissement ganglionnaire (pN0). Près de 20 à 30% des patients classés pN0 vont cependant développer des récidives tumorales. Parmi ces patients, il est probable qu’une partie ait été sous-classée au moment du diagnostic. La technique du ganglion sentinelle (GS) permet d’identifier les ganglions les plus susceptibles d’être envahis et de réaliser des analyses anatomopathologiques plus approfondies sur un nombre plus limité d’échantillon. Cette technique est recommandée dans le cancer du sein et dans le mélanome, mais son rôle reste discuté dans le CCR. Le premier volet de cette thèse concerne les résultats d’études cliniques que nous avons menées pour évaluer le rôle de la technique du GS au bleu patenté (BP) et de l’imagerie en fluorescence (IF) au vert d’indocyanine ou indocyanine green (ICG) dans le staging ganglionnaire des patients présentant un CCR. Les principaux objectifs de ces travaux étaient d’évaluer la faisabilité de ces techniques et leur apport dans le staging des patients présentant un CCR.Notre première étude sur la technique du GS au BP, représentant la plus grande cohorte monocentrique européenne, a permis de démontrer la faisabilité de la technique. En outre, cette approche a modifié le geste chirurgical dans 12% des cas (technique in vivo) et a permis de reclasser 10% des patients initialement classés pN0 en pN+ par la réalisation de coupes sériées spécifiquement réalisées sur les ganglions démontrés comme GS. Dans une seconde étude sur la technique du GS comparant l’IF-ICG à la technique au BP, nous avons montré que ces 2 techniques étaient complémentaires, permettant d’augmenter la sensibilité globale pour la détection des métastases ganglionnaires. De plus, l’IF-ICG apparaît comme plus sensible chez les patients présentant une surcharge pondérale. En termes de sensibilité, la recherche du GS par IF est supérieure à la technique BP, ces résultats restant cependant limités, notamment en raison d’un taux élevé de faux négatifs (FN) pour les tumeurs localement avancées (pT3-4). Les métastases ganglionnaires et la carcinose péritonéaleDans le CCR, les patients métastatiques, présentant une carcinose péritonéale (CP) et/ou un envahissement ganglionnaire, ont un pronostic sombre. La chirurgie d’exérèse de la CP associée à une chimiothérapie hyperthermique intrapéritonéale (CHIP) et la réalisation de curages ganglionnaires chez les patients porteurs d’une maladie oligométastatique permettent toutefois d’obtenir des survies prolongées et parfois des guérisons, avec des résultats similaires à ceux observés chez les patients opérés pour métastases hépatiques isolées. Pour la CP, l’étendue de la maladie et la radicalité de la résection sont les principaux facteurs pronostiques de survie. La sensibilité des examens d’imagerie conventionnelle et métabolique reste cependant faible pour déterminer l’extension de la maladie péritonéale. L’évaluation de l’étendue de la CP et son exérèse sont donc essentiellement fondées sur la palpation et l’exploration visuelle réalisée durant l’intervention chirurgicale, représentant un facteur limitant pour la radicalité de la chirurgie. De façon similaire, chez les patients présentant une maladie métastatique ganglionnaire limitée, la détection peropératoire est souvent difficile, nécessitant la réalisation de curages étendus de principe, afin de s’assurer de l’exérèse des ganglions pathologiques.L’utilisation de l’IF après injection iv intra-opératoire d’ICG a été rapportée comme une technique permettant la détection de tissu tumoral tant visible que non visible (infraclinique), pouvant potentiellement aider le chirurgien et guider les gestes de résection. Aucune étude n’avait particulièrement analysé le rôle de l’IF-ICG dans la détection de CP et de métastases ganglionnaires de CCR. Le second volet de cette thèse concerne l’évaluation de l’apport de l’IF après injection iv d’ICG pour la détection de la CP et des métastases ganglionnaires dans le CCR. L’objectif primaire était de vérifier si les métastases péritonéales (MP) et ganglionnaires visibles par le chirurgien étaient effectivement détectées par l’IF-ICG peropératoire. En parallèle, nous avons évalué si l’IF-ICG permettait de détecter une maladie infraclinique, non détectée par le chirurgien dans les conditions habituelles. La première étude de cette seconde partie a permis de montrer que les MP étaient visualisées comme hyperfluorescentes à l’IF-ICG pour autant qu’elles ne soient pas d’origine mucineuse. De plus, l’IF-ICG a permis de détecter des MP non visualisées en lumière visible, permettant d’adapter le geste chirurgical et d’augmenter la radicalité de la résection dans près de 38% des cas. Dans une seconde étude, nous avons rapporté que la technique d’IF utilisée in vivo et ex vivo après injection iv d’ICG permettait d’identifier des ganglions métastatiques, détectés ou non par les imageries conventionnelles et métaboliques préopératoires. Les résultats de cette étude constituant une preuve de concept ont été ensuite confirmés dans une étude rétrospective réalisée sur l’analyse ex vivo des ganglions de patients ayant reçu une injection iv d’ICG. Dans ce travail, nous avons montré que les ganglions envahis étaient plus fluorescents que les ganglions non envahis. Toutefois, cette preuve de concept doit encore être confirmée et évaluée plus largement dans une étude prospective. Ces 2 travaux montrent donc le bénéfice potentiel de l’utilisation de l’IF après injection iv d’ICG à 2 niveaux, pour guider la chirurgie en améliorant la détection peropératoire des sites métastatiques infracliniques et pour guider l’analyse histologique, en identifiant des ganglions fluorescents sur la pièce de résection, permettant une étude anatomopathologique plus ciblée et plus approfondie. Conclusions et perspectivesNos travaux sur la recherche du GS dans le CCR par la technique au BP et à l’IF-ICG ont montré que ces techniques étaient faisables mais que leurs sensibilités restaient limitées, en particulier chez les patients porteurs de tumeurs localement avancées. Dans la CP d’origine colorectale, nous avons montré que l’IF-ICG permettait d’améliorer la stadification de la CP des patients opérés de métastases péritonéales non mucineuses, de révéler des lésions non visibles dans les conditions standards et d’améliorer la radicalité de la chirurgie. Pour la détection de ganglions métastatiques, nous avons montré que l’IF-ICG permettait, in vivo, de détecter des ganglions infracliniques durant l’intervention et ex vivo, de guider l’analyse anatomopathologique de la pièce de résection. Enfin, nous pensons que ces observations pourraient nous permettre d’élaborer un nouveau concept de GS systémique par opposition au GS classique correspondant aux ganglions de drainage anatomique de la tumeur. Nous proposons que les capacités particulières de rétention de l’ICG dans les tissus cancéreux après injection par voie systémique pourraient permettre d’identifier des sites ganglionnaires métastatiques en dehors des sites de drainage révélés par les injections de marqueurs au sein ou en périphérie de la tumeur elle-même. Pour vérifier cette hypothèse, nous avons élaboré un nouveau protocole d’une étude clinique prospective dans laquelle la détection du GS systémique après injection iv d’ICG sera comparée aux résultats obtenus suite à l’injection péritumorale de BP. Les ganglions révélés par ces 2 techniques seront recherchés ex vivo sur la pièce de résection et analysés en anatomopathologie. Outre la démonstration de métastases ganglionnaires extra-anatomiques, nous pensons que cette approche systémique pourrait permettre de réduire le taux de FN observé suite à une injection péritumorale, notamment pour les tumeurs localement avancées, celles-ci pouvant perturber le drainage lymphatique selon les voies anatomiques. Summary:This thesis reports several clinical research works on the role of indocyanine green (ICG) fluorescence imaging (FI) for the detection of colorectal tumoral tissue. We first evaluate and compare the role of ICG-FI in the detection of sentinel lymph node (SLN) in colorectal cancer (CRC) in view to upstage patients. We have reported that both techniques (blue dye and ICG-FI) are similar in term of sensitivity with a high rate of false negative results. Therefore, we think that new approaches for SLN detection should be developped in CRC. Secondarily, we evaluate the role of ICG-FI after IV ICG injection for the detection of peritoneal carcinomatosis (PC) from CRC origin. We have reported that ICG-FI is able to detect non-mucinous PM with a sensitivity of 86%. Moreover, ICG-FI was able to guide surgery modifying the surgical procedure in 38% of patients. Thirdly, we investigate the role of ICG-FI for the detection lymph node (LN) metastases. We have reported that ICG-FI performed after IV ICG injection is able to detect LN metastases both in vivo and ex vivo. These findings have been confirmed in a retrospective study. Fiinally, we propose a new protocol to evaluate a new approach for SLN detection. In comparison with the standard technique using peritumoral injection, we propose a new approach using systemic (intravenous) ICG injection. We have called this approach the 'systemic' SLN detetion. This approach will be compared with the standard one using peritumoral blue dye injection. Sensitivity, specificity of both technique will be compared. In conclusion, the results of these preliminary clinical studies using ICG-FI for tumoral staging and treatment are encouraging and further larger studies should be performed. / Doctorat en Sciences médicales (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les processus de type “action-conséquence” (orienté vers un but) et stimulus-réponse sont deux composants importants du comportement. Le premier évalue le bénéfice d’une action pour choisir la meilleure parmi celles disponibles (sélection d’action) alors que le deuxième est responsable du comportement automatique, suscitant une réponse dès qu’un stimulus connu est présent. De telles habitudes sont généralement associées (et surtout opposées) aux actions orientées vers un but qui nécessitent un processus délibératif pour évaluer la meilleure option à prendre pour atteindre un objectif donné. En utilisant un modèle computationnel, nous avons étudié l’hypothèse classique de la formation et de l’expression des habitudes au niveau des ganglions de la base et nous avons formulé une nouvelle hypothèse quant aux rôles respectifs des ganglions de la base et du cortex. Inspiré par les travaux théoriques et expérimentaux de Leblois et al. (2006) et Guthrie et al. (2013), nous avons conçu un modèle computationnel des ganglions de la base, du thalamus et du cortex qui utilise des boucles distinctes (moteur, cognitif et associatif) ce qui nous a permis de poser l’hypothèse selon laquelle les ganglions de la base ne sont nécessaires que pour l’acquisition d’habitudes alors que l’expression de telles habitudes peut être faite par le cortex seul. En outre, ce modèle a permis de prédire l’existence d’un apprentissage latent dans les ganglions de la base lorsque leurs sorties (GPi) sont inhibées. En utilisant une tâche de bandit manchot à 2 choix, cette hypothèse a été expérimentalement testée et confirmée chez le singe; suggérant au final de rejeter l’idée classique selon laquelle l’automatisme est un trait subcortical. / Action-outcome and stimulus-response processes are two important components of behavior. The former evaluates the benefit of an action in order to choose the best action among those available (action selection) while the latter is responsible for automatic behavior, eliciting a response as soon as a known stimulus is present. Such habits are generally associated (and mostly opposed) to goal-directed actions that require a deliberative process to evaluate the best option to take in order to reach a given goal. Using a computational model, we investigated the classic hypothesis of habits formation and expression in the basal ganglia and proposed a new hypothesis concerning the respective role for both the basal ganglia and the cortex. Inspired by previous theoretical and experimental works (Leblois et al., 2006; Guthrie et al., 2013), we designed a computational model of the basal ganglia-thalamus-cortex that uses segregated loops (motor, cognitive and associative) and makes the hypothesis that basal ganglia are only necessary for the acquisition of habits while the expression of such habits can be mediated through the cortex. Furthermore, this model predicts the existence of covert learning within the basal ganglia ganglia when their output is inhibited. Using a two-armed bandit task, this hypothesis has been experimentally tested and confirmed in monkey. Finally, this works suggest to revise the classical idea that automatism is a subcortical feature.

In Canada alone, there were an estimated 800,000 visually impaired people in 2007, costing the federal government an annual amount of $15.8 billion in services, treatments and lost revenue. These costs are estimated to double by the year 2032, as the population ages. The leading causes of visual impairment and blindness is retinal degeneration, characterized by the progressive death of retinal cells. The research presented in this PhD thesis aimed to prevent retinal degeneration by over-expressing the X-linked Inhibitor of Apoptosis (XIAP) in retinal cells using plasmid and adeno-associated viral vectors. The work is divided into four sequential chapters targeted at developing an anti-apoptotic gene therapy strategy to prevent retinal cell death. The first chapter examines XIAP gene therapy in the treatment of Leber’s Hereditary Optic Neuropathy (LHON). In vitro studies using the 661W cone-photoreceptor cell line showed that XIAP over-expression significantly lowers cell death when 661W cells are exposed to a number of apoptotic stimuli. In a mouse model of Leber’s Hereditary Optic Neuropathy (LHON), XIAP expression in retinal ganglion cells (RGCs) protected the ultrastructure of the RGC axons within the optic nerve, in addition to providing evidence of functional protection. The second and third chapters further examine the potential for XIAP gene therapy in the treatment of retinal disease by developing an in vivo model of retinal detachment in cats, followed by evaluating the efficacy of XIAP gene therapy intervention. When XIAP was over-expressed in the photoreceptor cells, there was significant structural protection and trends in preservation of function in this model of degeneration. Finally, the fourth chapter explores an alternate method to viral gene therapy by evaluating the efficacy and toxicity of chitosan microparticles as a protein delivery system to the retina. Results show that chitosan microparticles are mucosal-adhesive and are non-toxic at low concentrations in vitro in 661W cells and in vivo in rats. This thesis work provides strong evidence that XIAP gene therapy is an effective method for preventing retinal degeneration, and works as a broad spectrum gene therapy strategy that can be applied to different forms of retinal degeneration.

Purpose: To review the roles of the different vascular beds nourishing the inner retina [retinal ganglion cells (RGCs)] during normal development of the human eye, using our own tissue specimens to support our conclusions. Methods: An extensive search of the appropriate literature included PubMed, Google scholar, and numerous available textbooks. In addition, choroidal and retinal NADPH-diaphorase stained whole mount preparations were investigated. Results: The first critical interaction between vascular bed and RGC formation occurs in the sixth to eighth month of gestation leading to a massive reduction of RGCs mainly in the peripheral retina. The first 3 years of age are characterized by an intense growth of the eyeball to near adult size. In the adult eye, the influence of the choroid on inner retinal nutrition was determined by examining the peripheral retinal watershed zones in more detail. Conclusion: This delicately balanced situation of RGC nutrition is described in the different regions of the eye, and a new graphic presentation is introduced to combine morphological measurements and clinical visual field data.

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Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / Reactive gliosis is known to have a beneficial and a degenerative effect following injury to neurons. Although many factors have been implicated in reactive gliosis, their role in regulating this change is still unclear. We investigated the role of bone morphogenetic proteins in reactive gliosis in vivo and in vitro. In vivo, IHC analysis indicated reactive gliosis in the 6 week Ins2Akita mouse and WPK rat retinas. Expression of BMP7 was upregulated in these models, leading to an increase in the phosphorylation of downstream SMAD1. In vitro, treatment of murine retinal astrocyte cells with a strong oxidizing agent such as sodium peroxynitrite regulated RNA levels of various markers, including GFAP, CSPGs, MMPs and TIMPs. BMP7 treatment also regulated RNA levels to a similar extent, suggesting reactive gliosis. Treatment with high glucose DMEM and BMP4, however, did not elicit increase in levels to a similar degree. Increase in SMAD levels and downstream targets of SMAD signaling such as ID1, ID3 and MSX2 was also observed following treatment with sodium peroxynitrite in vitro and in the 6 week Ins2Akita mouse retinas in vivo. These data concur with previously established data which show an increase in BMP7 levels following injury. It also demonstrates a role for BMP7 in gliosis following disease. Further, it suggests SMAD signaling to play a role in initiating reactivity in astrocytes as well as in remodeling the extracellular matrix following injury and in a disease condition.

Numerous studies showed that cochlear implant (CI) users generally prefer individualized stimulation rates in order to maximize their speech understanding. The underlying reasons for the reported variation in speech perception performance as a function of CI stimulation rate is unknown. However, multiple interacting electrophysiological processes influence the auditory nerve (AN) in response to high-rate CI stimulation. Experiments studying electrical pulse train stimulation of cat AN fibers (ANFs) have demonstrated that spike rates slowly decrease over time relative to onset stimulation and is often attributed to spike rate (spike-triggered) adaptation in addition to refractoriness. Interestingly, this decay tends to adapt more rapidly to higher stimulation rates. This suggests that subthreshold adaptation (accommodation) plays a critical role in reducing neural excitability. Using biophysical computational models of cat ANF including ion channel types such as hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) and low threshold potassium (KLT) channels, we measured the strength of adaptation in response to pulse train stimulation for a range of current amplitudes and pulse rates. We also tested these stimuli using a phenomenological computational ANF model capable of applying any combination of refractoriness, facilitation, accommodation, and/or spike rate adaptation. The simulation results show that HCN and KLT channels contribute to reducing model ANF excitability on the order of 1 to 100 ms. These channels contribute to both spike rate adaptation and accommodation. Using our phenomenological model ANF we have also shown that accommodation alone can produce a slow decay in ANF spike rates responding to ongoing stimulation. The CI users that do not benefit from relatively high stimulation rates may be due to ANF accommodation effects. It may be possible to use electrically evoked compound action potentials (ECAP) recordings to identify CI users exhibiting strong effects of accommodation, i.e., the increasing strength of adaptation as a function of increasing stimulation rate. / Dissertation / Doctor of Philosophy (PhD) / Cochlear implants (CI) attempt to restore hearing to individuals with severe to profound hearing deficits by stimulating the auditory nerve with a series of electrical pulses. Recent CI stimulation strategies have attempted to improve speech perception by stimulating at high pulse rates. However, studies have shown that speech perception performance does not necessarily improve with pulse rate increases, leading to speculation of possible causes. Certain ion channels located in auditory nerve fibers may contribute to driving the nerve to reduce its excitability in response to CI stimulation. In some cases, those channels could force nerve fibers to cease responding to stimulation, causing a breakdown in communication from the CI to the auditory nervous system. Our simulation studies of the auditory nerve containing certain types of channels showed that the effective rate of communication to the brain is reduced when stimulated at high rates due to the presence of these channels.

Les neurones nocicepteurs jouent un rôle clé dans la défense de l’organisme. Dans le cas des réactions inflammatoires, ils initient des réflexes protecteurs tels que la toux, les vomissements, où les démangeaisons, et participent à la régulation de plusieurs mécanismes physiologiques, notamment la réponse immunitaire. Ils jouent ainsi un rôle prépondérant dans l’inflammation de type 2, souvent associée aux allergies. Mais les mécanismes qui permettent l’activation de ces neurones dans ce contexte sont encore mal connus. Au cours de ce projet de recherche, nous avons exploré la capacité des neurones nocicepteurs à détecter les signaux immunitaires spécifiquement associés à l’asthme. Nous avons ainsi identifié les caractéristiques des nocicepteurs des voies aériennes. Nous avons également démontré leur sensibilité aux allergènes grâce à l’expression du récepteur aux immunoglobulines de type E, FcεR1, ainsi que leur capacité à modifier leur transcriptome en réponse aux cytokines IL-4 et IL-13. Ces travaux soutiennent l’importance de la communication entre systèmes nerveux et immunitaires, et mettent en évidence de nouvelles cibles pour limiter la contribution neuronale aux réactions allergiques. / Nociceptor neurons play a major role in organism defense. In the context of inflammation, they initiate protective reflexes such as cough, vomiting, or itch, and participate in the regulation of various physiological mechanisms, including the immune response. They notably participate in type 2 inflammation, often associated with allergies. But the mechanisms driving the activation of nociceptor neurons in this context are still elusive. During this research project, we investigated the ability of nociceptor neurons to sense immune signals specifically associated with asthma. We identified the characteristics of airway innervating nociceptors. We also demonstrated their sensitivity to allergens through the expression of the Immunoglobulin E receptor FcεR1, as well as their ability to change their transcriptome in response to IL-4 and IL-13. This work supports the importance of bidirectional communication between the nervous and immune systems and unravels new targets to regulate neuronal contribution to inflammation.