Gliomas apresentam um prognóstico precário apesar das múltiplas modalidades terapêuticas como ressecção neurocirúrgica, radioterapia e quimioterapia, possivelmente pelo seu alto nível de invasividade e resistência aos tratamentos. Estudos recentes demonstraram que o peptídeo liberador de gastrina (GRP), assim como seu receptor, possui efeitos importantes no desenvolvimento de muitos tumores, inclusive de gliomas. O receptor de GRP está super expresso em linhagens celulares de glioblastomas tendo sua função relacionada com a proliferação celular, estimulando o crescimento tumoral. No presente estudo, foi investigado o efeito do RC-3095, um antagonista seletivo do receptor de GRP, como mono terapia e em associação à temozolamida (TMZ), um agente citotóxico alquilante de DNA, em modelos experimentais de células de glioma da linhagem C6 de rato in vitro e in vivo. A proliferação celular foi reduzida tanto por RC-3095 quanto por TMZ, porém quando ambos os agentes foram administrados em associação, a redução da proliferação foi significativamente mais efetiva. Nos experimentos in vivo, o grupo controle apresentou os tumores maiores (52 ± 15.5 mm3), enquanto RC-3095 reduziu o tamanho tumoral, tendo um efeito mais efetivo na dose 0.3 mg/kg (21 ± 9.7 mm3). Porém, a combinação dos dois agents produziu a maior redução no tamanho tumoral (10 ± 7.5 mm3), assim como, apresentou índices histológicos menos agressivos. Nossos resultados demonstram que a combinação de RC-3095 e temozolamida produz uma maior redução tumoral em modelos experimentais de glioma de rato indicando que RC-3095 pode ser um forte candidato para associação à temozolamida potencializando os efeitos de agentes alquilantes de DNA no tratamento de gliomas multiformes. / Malignant gliomas have a dismal prognosis despite multi-modality treatments like neurosurgical resection, radiation therapy and chemotherapy, mainly due to their high level of invasion. Recent studies demonstrated that gastrin-releasing peptide (GRP) and its receptors play a role in the development of a variety of cancers including gliomas. The GRP receptor was shown to be over-expressed on glioblastoma cell lines and its function is related with cellular growth. In the present study, we investigated the effects of RC-3095, a selective antagonist of the GRP receptor, alone and in combination with temozolomide (TMZ), a DNA alkylating agent, in vitro and in vivo using experimental rat C6 glioma models. Cellular proliferation was reduced in all treatments (TMZ, RC-3095 and TMZ + RC-3095) with the administration of TMZ together with RC-3095 being the most effective. In in vivo experiments, the control group displayed the largest tumors (52 ± 15.5 mm3), whereas RC-3095 reduced the tumor size, with the most significant effect observed at the dose of 0.3mg/kg (21 ± 9.7 mm3). The combined therapy produced the largest reduction in tumor size (10 ± 7.5 mm3), greater than with either treatment alone. Ours results show that the combination of RC-3095 and TMZ have additive effects on the in vitro and in vivo glioma growth therefore making RC-3095 a candidate drug to potentiate the effects of the DNA alkylanting agent temozolomide in the treatment of malignant gliomas.

Receptores de neuropeptídeos e neurotrofinas constituem importantes alvos moleculares no câncer. Fatores de crescimento como o peptídeo liberador da gastrina (GRP) e fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) estão envolvidos na proliferação celular e progressão do câncer, influenciando na invasão local, angiogênese, metastatização e apoptose. O receptor de GRP (GRPR) tem sido identificado em muitos tumores humanos, mas até o presente trabalho não havia nenhuma informação na literatura quanto à sua expressão em câncer cervical. Nosso estudo inicial demonstrou pela primeira vez a expressão aberrante em GRPR em displasias e câncer do colo uterino, levantando a hipótese de que este receptor poderia estar implicado no processo carcinogênico destes tumores. Para explorar o papel de GRPR como um biomarcador de lesões de colo uterino, em nosso segundo estudo objetivamos avaliar o potencial diagnóstico da detecção de GRPR por imunocitoquímica, técnica que também não havia sido previamente descrita. Verificamos que este receptor foi fortemente associado com displasia e neoplasia cervical invasora. Além disso, o exame demonstrou elevada acurácia para lesões classificadas como células escamosas atípicas de significado indeterminado (ASCUS). Com base nestes resultados, concluímos que a expressão de GRPR por imunocitoquímica pode ser considerada como um método adicional para a detecção de lesões cervicais. Estudos prévios indicam que o bloqueio de GRPR ou do receptor tropomiosina quinase B (TrkB) pode ter efeito antiproliferativo em células de câncer. Neste trabalho mostramos que a ativação do GRPR pode reduzir, ao passo que o bloqueio pode aumentar a viabilidade de células de câncer de ovário, mama e colo uterino. Além disso, demonstramos que a inibição TrkB reduz a viabilidade destas células, sendo que o tratamento com BDNF aumentou a viabilidade de células de ovário. Os resultados obtidos reforçam o conhecimento de que as sinalizações GRP/GRPR e BDNF/TrkB regulam a viabilidade de células de câncer. Ainda mais importante, fornecem a primeira evidência de que, sob certas condições, a ativação de GRPR pode inibir, em vez de estimular, células neoplásicas de mama, ovário e colo uterino. / Neuropeptide and neurotrophin receptors are increasingly important molecular targets in cancer. Growth factors as the gastrin-releasing peptide (GRP) and brain-derived neurotrophic factor (BDNF) are involved in cell proliferation and cancer progression, enhancing local invasion, angiogenesis, distant metastasis and apoptosis. The GRP receptor has been identified in many human malignancies, but no information regarding its expression in cervical cancer was found in the literature. Considering that cervical cancer is a very important cause of morbidity and mortality worldwide, we aimed to evaluate the GRPR expression profile in preinvasive and invasive cervical lesions. Our initial study demonstrated for the first time the aberrant GRPR expression in human cervical dysplasia and cancer, raising the hypothesis that GRPR could be implicated in the carcinogenic process of cervical tumors. To further exploit GRPR as a biomarker, in our second study we aimed to evaluate the diagnostic potential of GRPR immunocytochemistry in detecting cervical dysplasia and invasive cancer. This was the first immunocytochemical evaluation of GRPR expression in cervical epithelial cells. This receptor was strongly associated with cervical dysplasia and invasive cancers. Additionally, GRPR immunosignaling showed high accuracy in detecting dysplasias in cells classified as atypical squamous cells of undetermined significance (ASCUS). Based on these results, we concluded that immunocytochemistry for GRPR may be regarded as a valuable method for early detection of cervical intraepithelial neoplasia. Previous studies have indicated that compounds that act by blocking gastrin-releasing peptide receptors (GRPR) or tropomyosin receptor kinase B (TrkB) receptors can display antiproliferative activities against cancer cells. Here we show that GRPR activation can reduce, whereas its blockade can increase, the viability of breast, ovarian, and cervical cancer cell lines. In addition, we demonstrate that TrkB inhibition reduces the viability of these cells and BDNF increases the viability of ovarian cells. The results support the view that GRPR and BDNF/TrkB signaling regulate cancer cell viability. Most importantly, the findings provide the first evidence that, under certain conditions, GRPR activation can inhibit, rather than stimulate, breast, ovarian and cervical cancer cells.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000411926-Texto+Completo-0.pdf: 537628 bytes, checksum: ad84cc7d4a6b34220ad5f86256433b5f (MD5) Previous issue date: 2009 / Cadherins play a crucial role in tissue homeostasis by maintaining cell-cell adhesion, and therefore have been implicated in cancer progression. The synthetic antagonist of the gastrin-releasing peptide receptor RC-3095 have been shown to inhibit tumor growth by repressing cell proliferation, motility and morphogenesis, and is pointed as a promising anti-cancer drug. This work aimed to evaluate the effect of RC-3095 treatment on colorectal adenocarcinoma HT-29 cell line upon E and N cadherin expression. Our results corroborate previous findings demonstrating the negative effect of RC-3095 on cell viability, reinforcing its potential anti-cancer effect. However, our results failed to establish a correlation between RC-3095 treatment and cadherin expression, suggesting that modulation of cell adhesiveness is not a target of RC-3095 under these conditions. N cadherin was not detected while E cadherin expression decreased progressively along the 48h period tested. / As caderinas desempenham um papel-chave na manutenção das adesões célula-célula e alterações em sua expressão tem implicações significativas na homeostasia tecidual, estando envolvidas na progressão do câncer. O RC-3095 e um antagonista sintético do receptor do peptídeo liberador de gastrina capaz de restringir o crescimento de tumores pela ação inibitória sobre proliferação, aumento da motilidade e morfogênese de células tumorais, representando uma nova e promissora estratégia farmacológica no tratamento anti-tumoral. O objetivo deste trabalho foi analisar o efeito do tratamento com RC-3095 durante a progressão tumoral da linhagem de adenocarcinoma colorretal HT-29 sobre a expressão de caderinas dos tipos E e N. Nossos resultados corroboram achados prévios que demonstraram o efeito negativo do RC-3095 sobre a viabilidade celular, reforçando seu potencial no tratamento do câncer colorretal. O tratamento com RC-3095, contudo, não alterou o perfil de expressão de caderinas durante o período de 48h estudado. Neste período não foi detectada expressão de caderina do tipo N, enquanto a expressão de caderina E diminui progressivamente independente do tratamento com RC-3095, sugerindo que a adesividade celular não e alvo do antagonista do receptor do peptídeo liberador de gastrina nas condições estudadas.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000434382-Texto+Completo-0.pdf: 1595815 bytes, checksum: e9f7e7d4a7dcd6de22b69890074a8785 (MD5) Previous issue date: 2011 / Neutrophils are major players in inflammatory processes both in innate and adaptive immunity. Their migration to inflamed sites is crucial both for the initiation of inflammation as well as resolution of infection, and yet they are involved in the perpetuation of different chronic inflammatory diseases. Gastrin-releasing peptide (GRP) is a neuropeptide that acts through G-protein coupled receptors involved in different physiological functions, from gastrointestinal motility to modulation of memory. The preferential receptor, GRPR (Gastrin-releasing peptide receptor), is expressed by various cell types, including the gastric, respiratory and nervous system, being over expressed on cancer cells. RC-3095 is one of GRPR´s selective antagonists, developed for cancer treatment. More recently, RC-3095 has been found to have anti-inflammatory properties in arthritis and sepsis. The mechanism underlying GRP and RC-3095 effects in tumor growth and immune suppression has not been fully determined. In this study, we propose to characterize the pro-inflammatory effects of GRP on the migratory induction of leucocytes in vitro and in vivo, demonstrating that GRPR acts as a chemotactic receptor for neutrophils. Intraperitoneal injection of GRP attracts neutrophils in four hours, a phenomenon that is antagonized by RC3095 and macrophage depletion or neutralization of TNF-α.More importantly, GRP has a direct chemokine-like effect on neutrophils in vitro, inducing migration through GRPR signaling, in a mechanism dependent on PI3K, ERK and p38 and independent of Gαi protein, demonstrating that GRPR is an alternative chemokine receptor. Interestingly, in vitro neutrophil migration towards synovial fluid of arthritis patients is abolished by pretreatment with RC-3095, in a magnitude comparable to blocking of CXCR2. We discuss the implications of these findings for GRPR antagonist-based treatment for inflammatory diseases and propose that GRPR is a new alternative chemokine receptor involved these pathogeneses / Neutrófilos são os principais personagens do processo inflamatório, tanto na imunidade inata como adaptativa. Sua migração para os sítios inflamatórios é crucial para o início da inflamação, assim como para o controle de infecções, apresentando envolvimento na perpetuação de diferentes doenças inflamatórias crônicas. O peptídeo liberador de gastrina (GRP: Gastrin-releasing peptide) é um neuropeptídeo que atua via receptores ligados a proteína G e que está envolvido em diferentes funções fisiológicas, atuando da motilidade gastrointestinal à modulação da memória. Seu receptor preferencial, GRPR (Gastrin-releasing peptide receptor), é expresso em vários tipos celulares, incluindo os sistemas gástrico, respiratório e nervoso, tendo sua expressão aumentada em células tumorais. RC-3095 é um dos antagonistas seletivos de GRPR, desenvolvido para o tratamento de câncer. Mais recentemente, o RC-3095 mostrou-se com propriedades anti-inflamatórias no tratamento de artrite e sepse. Os mecanismos pelos quais o GRP e o RC-3095 afetam o crescimento tumoral e o sistema imune ainda não foram totalmente determinados. Neste estudo, nós propomos caracterizar os efeitos pró-inflamatórios do GRP na indução de migração de leucócitos in vitro e in vivo, demonstrando que o GRPR atua como um receptor quimiotático para neutrófilos. Injeções intraperitoneais de GRP recrutaram neutrófilos em quatro horas, um fenômeno antagonizado pelo RC-3095, depleção de macrófagos ou neutralização do TNF-α. Além disso, o GRP apresentou um efeito direto in vitro, atuando como quimiocina na indução de migração através da sinalização por GRPR, um mecanismo que é dependente de PI3K, ERK, p38 e independente de proteína Gαi, demonstrando que o GRPR é um receptor quimiotático alternativo. Interessantemente, a migração de neutrófilos in vitro em direção ao líquido sinovial de pacientes com artrite foi abolida com o pré-tratamento com RC-3095, em uma magnitude comparada ao bloqueio do CXCR2. Discutimos aqui as implicações dessas descobertas para os tratamentos baseados no antagonista de GRPR em doenças inflamatórias e propomos que o GRPR é um novo receptor quimiotático alternativo que está envolvido nessa patogênese destes distúrbios.

É bem estabelecido que respostas imunes possam ser influenciadas pelo sistema nervoso. O neuropeptídeo, peptídeo liberador de gastrina (GRP) tem sido detectado na produção e liberação de citocinas, em modelo animal e em humanos com doenças inflamatórias e sabe-se que o antagonista do receptor de GRP, RC-3095 modula a resposta de citocinas pro-inflamatórias em macrófagos ativados por lipopolissacarídeo (LPS) molhando a sobrevivência em modelo animal de sepse induzida por ligação e perfuração cecal (CLP). Neste contexto, neste estudo avaliamos o efeito modulatório de GRP em modelos animais de doenças inflamatórias agudas: injúria pulmonar associada à pleurisia induzida por carragenina e sepse induzida por CLP e adicionalmente, em pacientes sépticos através da correlação dos seus níveis com o desfecho clínico. Para esta proposta, no Capítulo 1 avaliamos em pleurisia induzida por carragenina os seguintes parâmetros: migração celular, atividade da lactato desidrogenase, conteúdo de proteínas totais, concentração de nitrito/nitrato e níveis de TNF-α e IL- β no exsudato pleural e atividade da mieloperoxidade e marcadores de dano oxidativo em lipídios e proteínas no tecido pulmonar. Assim, o RC-3095 exibiu significante ação anti-inflamatória através da inibição do influxo de leucócitos e bloqueio da mieloperoxidade, conteúdo de nitrito/nitrato e níveis de citocinas. Além disso, os resultados mostraram que RC-3095 exerce ação contra o dano oxidativo em lipídios e proteínas, bem como o aumento na viabilidade celular. Isto sugere que RC- 3095 tem propriedades anti-inflamatórias que podem estar relacionadas com a redução do dano oxidativo. No Capítulo 2, entretanto, nós seguimos no modelo animal de sepse onde buscamos o entendimento do papel protetor que exerce o RC-3095. Vários estudos sugerem o envolvimento de TLR-4 como um importante elemento de defesa do hospedeiro durante a infecção, e importantes eviências indicam que esses receptores também possuem um papel na patofisiologia da sepse, onde camundongos deficientes de TLR-4 não apresentam falência na migração de neutrófilos para a cavidade peritoneal durante a sepse polimicrobiana induzida por CLP letal, e como conseqüência, foram mais resistentes para sepse que controles. Nossos resultados indicam que este efeito protetor pode ser atribuído para uma atenuação de sinalização de TLR-4 em cultura de células RAW 264.7 estimuladas por LPS e tecido pulmonar em ratos CLP, levando a uma diminuição de citocinas proinflamatórias as quais a via de ativação de GRPR mostra seletividade como verificado no Capítulo 3, possibilitando a explicação dos baixos níveis de citocinas pro-inflamatórias em pacientes sépticos tratados com RC-3095. Esta atenuação favorece a infiltração de neutrófilos, resultando na diminuição de bacteremia preservando o controle da infecção no local melhorando o desfecho da sepse. Nossos resultados ainda mostram que níveis plasmáticos de GRP podem predizer o desfecho na sepse, mas não em pacientes SIRS sugerindo que GRP exerce funções diferenciais nas duas condições e sugere que o antagonismo de GRPR modula a inflamação incontrolada por agir em respostas mediadas por TLR-4 e funcionalidade imunoregulatória. Em conclusão, os presentes resultados indicam que o antagonista de GRPR exerce um papel na inflamação aguda e pode ser utilizado como uma nova terapia alternativa para sepse bacteriana Gram-negativa. / It is well established that immune responses may be influenced by the nervous system. The neuropeptide gastrin-releasing peptide (GRP) has been detected on the production and release of cytokines, both in animal models and humans with inflammatory diseases and reported that the GRP receptor antagonist RC-3095 modulates the response of proinflammatory cytokines in activated macrophages by lipopolysaccharide and improved the survival in an animal model of sepsis induced by cecal ligation and puncture (CLP). Within this context, in this work we evaluate the GRP modulatory effect in animal models of acute inflammatory illnesses: lung injury associated with carrageenan-induced pleurisy, and in CLP-induced sepsis and additionally in septic patients through the correlations of its levels with the clinical outcome. For this purpose, in Chapter 1 we evaluated in carrageenan-induced pleurisy the following parameters: cell migration, lactate dehydrogenase activity, total protein content, nitrite/nitrate concentration, TNF-α and interleukin-1β (IL-1β) levels in pleural exudates; myeloperoxidase activity and lipid and protein oxidative damage markers in lung tissue. Thus, RC-3095 exhibited pronounced anti-inflammatory actions by inhibition of leukocyte influx and blockade of myeloperoxidase, nitrite/nitrate content and cytokine levels. Moreover, the results showed that RC-3095 elicits action against oxidative damage in lipids and proteins, as well as increases cell viability. These suggest that RC-3095 has anti-inflammatory properties that can be related with the reduction of oxidative damage. In Chapter 2, however, we follow the animal model of sepsis where we search the agreement of the protective role that RC-3095 exerts. Increasing evidences suggest the evolvement of TLR-4 as an important element of host defense during an infection, a growing body of evidence indicates that these receptors also may play a role in the pathophysiology of sepsis where TLR-4 defective mice did not present failure of neutrophil migration to the peritoneal cavity during polymicrobial sepsis induced by lethal CLP, and as consequence, they were more resistant to sepsis than controls Our results further indicate that this protective effect can be attributed to an attenuation of TLR-4 signaling in RAW 264.7 cell culture stimulated by LPS and lung tissue in CLP rats, leading to a decrease of release of proinflammatory cytokines which the pathway of activation of GRPR shows selectivity as verified in Chapter 3, and can additionally explain the lower levels of the proinflammatory cytokine in RC-3095-treated septic patients. This attenuation favors neutrophil infiltration, resulting in decreased bacteremia preserving the control of infection in situ improving sepsis outcome. Our finding still show that plasma GRP levels could predict outcome in sepsis but not SIRS patients suggesting that GRP plays different roles in the two conditions and suggest that GRPR antagonism modulates uncontrolled inflammation by targeting TLR-4-mediated responses and immunoregulatory functionality. Taken together, the present results indicate that a GRPR antagonist plays a role in acute inflammation and could be developed as a new alternative therapy for Gram-negative bacterial sepsis.

O câncer de pulmão é a principal causa de morte relacionada ao câncer em todo o mundo. As medidas adotadas atualmente ainda permancem desanimadoras, apesar das mais avançadas estatégias de tratamento, pois 86% dos pacientes com neoplasias pulmonares morrem dentro de cinco anos do diagnóstico. A maioria das histologias das neoplasias pulmonares são os carcinomas não-pequenas células que acometem cerca de 85% de todos os tumores pulmonares. Esse grupo histológico é frequentemente diagnosticado em estágios avançados da doença e, por isso, apresenta um pobre prognóstico. A quimioterapia paliativa ria doença avançada, ou metastática, está associada apenas com um modesto aumento da sobrevida e com uma melhora da qualidade de vida . O aumento na compreensão da biologia tumoral para o desenvolvimento de drogas alvo que são chave nos mecanismos biológicos requeridos para o desenvolvimento tumoral, é a oportunidade para melhorar os resultados de pacientes com câncer de pulmão. Os peptídeos liberadores de gastrina (GRPR) são superexpressos em vários tumores e desempenham um papel crítico na proliferação, migração e invasão celular. Entretanto, a expressão deste peptídeo não tem sido muito explorada nas diferentes histologias e estágios clínicos das neoplasias pulmonares. Neste estudo, a meta foi: (1) identificar a expressão de GRPR, tanto em neoplasias não-pequenas células (NSCLC), quanto em neoplasias de pequenas células (SCLC); (2) correlacionar a expressão deste marcador com estágios clínicos e variáveis demográficas dos pacientes envolvidos rio estudo; (3) comparar a expressão de GRPR em pacientes asiáticos e não-asiáticos. Foi utilizada a técnica de imuno-histoquímica para avaliar a expressão de GRPR em 238 pacientes brasileiros com câncer de pulmão e em 96 pacientes japoneses com a mesma neoplasia. Os resultados mostraram urna diferença visível na intensidade de expressão de GRPR entre os pacientes com NSCLC, comparados àqueles com SCLC. Os pacientes com NSCLC apresentaram 48% fraca, 16,5% moderada e 7,5% forte expressão de GRPR, comparados a 34,21% fraca; 15,78% moderada; 2,63% forte expressão deste marcador em SCLC. Quando o grupo de NSCLC foi separado nos subtipos histológicos, a alta expressão de GRPR foi maior nos adenocarcinomas (10%) em relação às outras histologias. Quanto aos estágios clínicos, a expressão de GRPR foi muito mais pronunciada nos estágios III e IV dos NSCLC e em doença extensa dos SCLC em relação à doença mais precoce. Quando o GRPR foi comparado em ambas populações, observou-se que a expressão foi maior nos pacientes japoneses com 92,85% comparados aos pacientes brasileiros com 62,50% (p= 0,001). / Lung cancers are the leading cause of cancer-related death worldwide. Outcome measures are very discouraging as even with the most advanced treatment strategies, about 86% of lung cancer patients die within 5 years of diagnosis. Most of the histologies are non-small cell (NSCLC) that accounts for 85% of ali lung cancer. The NSCLC is often diagnosed at an advanced stage and has a poor prognosis. Palliative chemotherapy in advanced or metastatic NSCLC is associated with only a modest survival prolongation and improved quality of life. The increase understanding of tumor biology and availability of drugs targeting key biological mechanism required for tumour development provide an opportunitty to further improve the outcome of pacientes with lung cancer. Gastrin-releasing peptide receptor (GRPR) are overexpressed in several neoplasms and plays a criticai role in tumor cell survival, proliferation, migration and invasion. However the expression of this peptide has not been very explored in different histologies and clinicai stages of lung cancer . Our aim was: (1) to identify GRPR expression in both non-small cell lung cancer (NSCLC) and small cell lung cancer (SCLC); (2) to correlate its expression with clinicai stages and demographic variables; (3) to compare GRPR expression in Asian and non-Asian population. Was used standard immunohistochemistry to evaluate GRPR expression in 238 lung cancer of Brazilian patients and 96 lung cancer of Japanse patients. The different intensity GRPR expression was visible between SCLC and NSCL, mainly in high expression of this biomarker. In NSCLC have 48% weak; 16.5% moderate; 7.5% strong expression compared to 34.21% weak; 15.78% moderate; 2.63% strong in SCLC. When the group of non-small cell was separated, a conspicuous high expression was seen in adenocarcinomas (10% strong expression) in relation to other histologies. In clinicai stages, GRPR expression was more pronounced in stage III and IV of NSCLC and extensive disease of SCLC than earlies stages of this disease. When compared both populations, GRPR expression was more present in Japanese population with 92.85% than Brazilian patients with 62.50% (p= 0,001). Conclusions: We have shown for the first time that GRPR is expressed differently in clinicai stages and higly expressed in histologies not known before. Furthermore, this biomarker has, as EGFR, a distinct behavior in Asian and non-Asian patients. Undoubtedly, GRP participate as a important growth factor in mediate progression and metastasis development in lung cancer. These findings can identify this biomarker as possible biological target for developmentof a new approachs to the treatment of lung cancer.

Introdução: A incidência de melanoma maligno (MM) está aumentando mundialmente e o manejo de pacientes com doença avançada representa um difícil problema. Durante décadas, a quimioterapia foi o tratamento padrão no tratamento de pacientes com MM metastático. Entretanto, essa modalidade tem produzido resultados desapontadores. Recentemente, com os avanços no conhecimento sobre os eventos moleculares relacionados ao desenvolvimento do MM, novas drogas dirigidas a alvos moleculares de relevância na doença têm sido identificadas. O peptídeo liberador de gastrina (GRP) é um peptídeo neuroendócrino, o qual possui efeito estimulador no crescimento em vários tipos de neoplasias murinas e humanas. Poucos dados são conhecidos em relação à expressão de receptores de GRP (GRPR) em materiais de biópsia de pacientes portadores de MM. A identificação de uma expressão elevada destes receptores no MM poderá permitir uma maior compreensão sobre a biologia desta neoplasia, bem como embasar estudos com o uso de moduladores desta via de sinalização com potencial ação terapêutica. Objetivos: O objetivo desse estudo foi determinar a expressão de receptores de GRP em biópsias de pacientes com MM, bem como buscar eventuais correlações entre os níveis de expressão de GRPR e fatores prognósticos reconhecidos nesta doença. Métodos: Foi realizado um estudo imuno-histoquímico (IHQ) em blocos fixados em formalina e embebidos em parafina, contendo material de biópsia de 51 pacientes portadores de MM cutâneo. Utilizou-se um anticorpo policlonal de coelho anti-GRPR (OPA1-15619, Affinity Bioreagents, USA). Após a quantificação da expressão de GRPR nas amostras, foram analisadas as diferenças de expressão entre subgrupos prognósticos, com a aplicação do teste exato de Fisher. Resultados: A expressão de GRPR foi demonstrada no citoplasma de 42 das 51 (82,4%) amostras de MM cutâneo. A expressão foi considerada forte em 30 amostras (58,9%). Não foi observada diferença significativa na expressão de GRPR quando foram analisadas amostras de MM em sítio primário versus metastático. Foram correlacionados os escores da expressão de GRPR com os achados patológicos associados ao prognóstico do MM cutâneo primário, não tendo sido detectadas diferenças significativas com relação aos níveis de Clark (p=0,35) e Índice espessura de Breslow (p= 0,175). Conclusão: Nosso trabalho mostrou uma expressão de GRPR em amostras de MM cutâneo na vasta maioria dos casos (82,4%). Em 30 amostras (58.3%), a expressão de GRPR foi considerada de forte intensidade. Não houve associação entre a intensidade de expressão de GRPR quando comparadas amostras de sítio primário versus metastático, níveis de Clark ou índices de Breslow. Este estudo é um dos primeiros na literatura a descrever uma expressão de GRPR elevada em amostras obtidas de pacientes portadores de MM cutâneo. Estudos subsequentes, preferencialmente com um maior número amostral, são necessários para confirmar estes achados e permitir melhor análise da expressão deste receptor em distintos subgrupos prognósticos. Se confirmados, os nossos dados podem justificar a realização de estudos que explorem novas estratégias terapêuticas utilizando agentes moduladores da expressão de GRPR em pacientes com MM refratário ao tratamento convencional. / Background: The incidence of malignant melanoma (MM) is increasing worldwide and the management of patients with disseminated disease is a difficult problem. Chemotherapy was the treatment of choice in metastatic melanomas for many decades. However, this option produces disappointing results. Recently, the better understanding about molecular events related do the development of MM allowed the development of new drugs directed against specific molecular targets. The gastrin-releasing peptide (GRP) is a neuroendocrine peptide shown to have growth-stimulatory effects on many types of murine and human cancers. Few data are available about GRP receptor (GRPR) expression in MM. The understanding about the molecular biology of MM may allow the identification of novel intracellular pathways of relevance in this disease, and potential GRPR modulators of therapeutic application in patients with refractory MM. Objectives: The aim of this study was to determine the GRPR expression in biopsy samples of patients with cutaneous MM, as well as to correlate its expression with known prognostic factors of relevance in this disease. Methods: Immunohistochemistry was performed on formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy samples from 51 patients with cutaneous MM. A rabbit polyclonal anti-GRPR antibody (OPA1-15619, Affinity Bioreagents, USA) was used. Following the quantification of GRPR expression in the samples, the differences in GRPR expression among distinct prognostic MM subgroups were analyzed, using the Fisher´s test. Results: GRPR immunoexpression was demonstrated in cytoplasm of 42/51 (82.4%) cutaneous MM cases. It was strongly expressed in 30 (58.9%) of the samples. No significant differences between GRPR expression neither in relation to the primary or metastatic site, nor among known prognostic subgroups Clark´s level (p=0.35) and Breslow index ( p= 0.175) was observed. Conclusion: Our study has demonstrated the occurrence of a high GRPR expression in tumor specimens obtained from patients with cutaneous MM (82,4%). In 30 samples, a strong intensity of expression was documented (58.3%). No correlation was observed between the level of GRPR expression in primary or metastatic sites, nor for distinct Clark´s levels or Breslow index. This is one of the first studies demonstrating a high GRPR expression in tumor samples from patients with MM. Further studies are warranted, preferably including a larger patient population, to allow a better analysis of the expression of these receptors in different prognostic subgroups. If these observations are confirmed, the therapeutic use of GRPR inhibitors should be considered in patients with advanced MM who failed conventional treatments.

O principal objetivo dos experimentos apresentados nesta tese foi investigar o envolvimento dos receptores do peptídeo liberador de gastrina (GRPRs) hipocampais nos processos de extinção e reconsolidação da memória e em um modelo de amnésia associado à doença de Alzheimer. No Capítulo I foram avaliados os efeitos do bloqueio do GRPR na extinção da memória aversiva. Ratos Wistar machos foram treinados na tarefa de esquiva inibitória e retornaram repetidamente ao contexto da sessão de treino sem choque durante três dias seguidos. A infusão no hipocampo dorsal de um antagonista dos GRPRs ou anisomicina, inibidor da síntese protéica, imediatamente após a primeira sessão de teste inibiram a extinção da memória. Estas drogas não tiveram o mesmo desempenho nas sessões subseqüentes quando a primeira sessão da extinção (primeiro dia após o treinamento) foi omitida. Os resultados indicam que os GRPRs estão envolvidos na extinção da memória motivada por medo no hipocampo.No Capítulo II foi avaliado o possível papel do GRPR e do receptor de glutamato do tipo N-metil-D-aspartato (NMDAR) em processos associados à reconsolidação da memória. Os resultados mostraram que a inativação de GRPR pelo antagonista RC-3095 ou de NMDARs hipocampais pelo antagonista ácido aminofosfonopentanoico (AP5), após a reativação da memória, prejudica temporariamente a retenção. Entretanto, o prejuízo da memória induzido por RC-3095 ou AP5 pós-reativação foi transitório e voltou aos níveis dos ratos-controle em um teste subseqüente 3 dias após o treino. O efeito das drogas se deu apenas após a reativação da memória, e não na ausência da mesma. Estes resultados fornecem a primeira evidência que a inativação de GRPR após areativação pode prejudicar a memória. No Capítulo III nós investigamos o efeito da ativação dos GRPRs em um modelo de amnésia associado à doença de Alzheimer. Os ratos receberam infusão bilateral de bombesina, agonista GRPR, ou salina 10 min antes do treino na tarefa de esquiva inibitória, e peptídeo β-amilóide (25-35) ou água destilada imediatamente após o treino. A infusão intrahipocampal pós-treino do peptídeo β-amilóide (25-35) induziu um prejuízo significativo na retenção da memória na tarefa de esquiva inibitória. A infusão pré-treino de bombesina previniu o prejuízo da retenção da memória induzido pelo peptídeo β-amilóide (25-35). O resultado indica que os agonistas de GRPR podem previnir os prejuízos da memória causados pelo peptídeo β-amilóide (25-35) no hipocampo. / The main purpose of the research presented in this thesis was to evaluate the involvement of hippocampal gastrin-releasing peptide receptors (GRPRs) in extinction and reconsolidation of fear memory, as well as the effects of GRPR activation in a rat model of memory dysfunction associated with Alzheimer’s disease (AD). In Chapter 1, we evaluated the possible involvement of the GRPR in extinction of memory for aversive training. Male Wistar rats were trained in inhibitory avoidance (IA) conditioning and then returned repeatedly to the training context without shock on a daily basis for 3 days. Infusion of the GRPR antagonist RC-3095 or the protein synthesis inhibitor anisomycin into the CA1 area of the dorsal hippocampus immediately after the first extinction session blocked extinction. These drugs did not affect performance in subsequent sessions when the first extinction session (1 day after training) was omitted.The results provide the first evidence that hippocampal GRPRs are involved in memory extinction. In Chapter 2, we evaluated the possible role of hippocampal GRPRs and glutamate N-methyl-D-aspartate receptors (NMDARs) in reconsolidation-like processes. We show that inactivation of hippocampal GRPRs or NMDARs after memory reactivation temporarily disrupts retention of IA memory.Post-retrieval intrahippocampal infusion of the GRPR antagonist RC-3095 or the NMDAR antagonist aminophosphonopentanoic acid (AP5) produced an impairment of IA performance tested 2 days after training in rats. However, the memory impairment induced by postretrieval RC-3095 or AP5 was transient and recovered to levels of control rats in a subsequent test 3 days after training. The drug effects were only present after memory reactivation and not in the absence of reactivation. The findings provide the firstevidence that GRPR inactivation after memory retrieval can impair memory. In Chapter 3, we verified whether GRPR activation would affect IA memory retention in a rat model of memory dysfunction associated with AD. Rats were given bilateral infusions of the GRPR agonist bombesin or saline 10 min before IA training, and β-amyloid peptide (25- 35) or distilled water immediately after training. Posttraining intrahippocampal infusion of β-amyloid peptide (25-35) induced a significant impairment of IA retention. Pretraining infusion of an otherwise ineffective dose of bombesin prevented the β-amyloid peptide (25-35)-induced retention impairment. The result indicates that GRPR agonists can prevent memory impairments elicited by β-amyloid peptide (25-35) in the hippocampus.

O peptídeo liberador da gastrina (GRP), pertencente à família dos peptídeos semelhantes à bombesina, e seus receptores (GRPR) estão presentes em todo o sistema nervoso central, em particular em áreas límbicas cerebrais como o hipocampo e a amídala, as quais estão envolvidas de forma importante na regulação emocional, na função cognitiva e, possivelmente, em transtornos neuropsiquiátricos e neurodegenerativos. Crescentes evidências indicam que o receptor do peptídeo liberador de gastrina (GRPR) está envolvido na regulação da plasticidade sináptica e formação da memória no hipocampo e em outras áreas cerebrais. Entretanto, o mecanismo molecular do efeito prejudicial da memória do antagonismo do GRPR não está claro. O fator de crescimento de fibroblasto básico (bFGF/FGF-2), é um peptídeo que possui efeitos estimulatórios na proliferação, diferenciação e motilidade de diferentes tipos celulares. Em neurônios atua como um fator neurotrófico que estimula a sobrevida neuronal e neurogênese. Evidências de interações entre o bFGF e o GRPR foram dadas por estudos que mostraram que antagonistas do GRPR inibiam a expressão do bFGF em tumores. Neste trabalho mostramos que o fator de crescimento de fibroblasto básico (bFGF/FGF-2) recupera o prejuízo da memória induzida pelo antagonismo do GRPR no hipocampo dorsal de ratos. O antagonista [D-Tpi6, Leu13 psi(CH2NH)-Leu14] bombesin (6–14) (RC- 3095) na dose de 1.0 Tg prejudica, enquanto o bFGF na dose de 0,25 Tg aumenta a retenção da esquiva inibitória (um tipo de tarefa de condicionamento aversivo) quando infundidos imediatamente após o treino, na área CA1 do hipocampo dorsal em ratos machos. A coinfusão com uma dose sem efeito de bFGF bloqueou o efeito amnésico do RC- 3095. Estes achados sugerem que o efeito prejudicial dos antagonistas do GRPR devem ser parcialmente mediados pela inibição da função e/ou expressão do bFGF neuronal e pela diminuição da ativação das cascatas de proteína cinases intracelulares associadas com a sinalização do bFGF. / Gastrin-releasing peptide (GRP), a bombesin-like peptide, and its receptor, GRP receptor (GRPR) are found throughout the central nervous system (CNS), including limbic areas such as the hippocampus and amygdala, which are significantly involved in emotional responses, cognitive function, and, possibly, neurodegenerative and neuropsychiatric disorders. Increasing evidence indicates that the gastrin releasing peptide receptor (GRPR) is implicated in regulating synaptic plasticity and memory formation in the hippocampus and other brain areas. However, the molecular mechanisms underlying the memory-impairing effects of GRPR antagonism have remained unclear. bFGF is a polypeptide displaying stimulatory actions on proliferation, differentiation and motility of different cell types. In neurons, bFGF acts as neurotrophic factor that stimulates neuronal survival, and neurogenesis. Evidence of functional interactions between bFGF and the GRPR was provided by studies showing that GRPR antagonists inhibit the expression of bFGF in tumours. Here we report that basic fibroblast growth factor (bFGF/FGF-2) rescues the memory impairment induced by GRPR antagonism in the rat dorsal hippocampus. The GRPR antagonist [D-Tpi6, Leu13 psi(CH2NH)-Leu14] bombesin (6–14) (RC-3095) at 1.0g impaired, whereas bFGF at 0.25g enhanced, 24 h retention of inhibitory avoidance (IA) when infused immediately after training into the CA1 hippocampal area in male rats. Coinfusion with an otherwise ineffective dose of bFGF blocked the memory-impairing effect of RC-3095. These findings suggest that the memory-impairing effects of GRPR antagonists might be partially mediated by an inhibition in the function and/or expression of neuronal bFGF or diminished activation of intracellular protein kinase pathways associated with bFGF signaling.

Gliomas apresentam um prognóstico precário apesar das múltiplas modalidades terapêuticas como ressecção neurocirúrgica, radioterapia e quimioterapia, possivelmente pelo seu alto nível de invasividade e resistência aos tratamentos. Estudos recentes demonstraram que o peptídeo liberador de gastrina (GRP), assim como seu receptor, possui efeitos importantes no desenvolvimento de muitos tumores, inclusive de gliomas. O receptor de GRP está super expresso em linhagens celulares de glioblastomas tendo sua função relacionada com a proliferação celular, estimulando o crescimento tumoral. No presente estudo, foi investigado o efeito do RC-3095, um antagonista seletivo do receptor de GRP, como mono terapia e em associação à temozolamida (TMZ), um agente citotóxico alquilante de DNA, em modelos experimentais de células de glioma da linhagem C6 de rato in vitro e in vivo. A proliferação celular foi reduzida tanto por RC-3095 quanto por TMZ, porém quando ambos os agentes foram administrados em associação, a redução da proliferação foi significativamente mais efetiva. Nos experimentos in vivo, o grupo controle apresentou os tumores maiores (52 ± 15.5 mm3), enquanto RC-3095 reduziu o tamanho tumoral, tendo um efeito mais efetivo na dose 0.3 mg/kg (21 ± 9.7 mm3). Porém, a combinação dos dois agents produziu a maior redução no tamanho tumoral (10 ± 7.5 mm3), assim como, apresentou índices histológicos menos agressivos. Nossos resultados demonstram que a combinação de RC-3095 e temozolamida produz uma maior redução tumoral em modelos experimentais de glioma de rato indicando que RC-3095 pode ser um forte candidato para associação à temozolamida potencializando os efeitos de agentes alquilantes de DNA no tratamento de gliomas multiformes. / Malignant gliomas have a dismal prognosis despite multi-modality treatments like neurosurgical resection, radiation therapy and chemotherapy, mainly due to their high level of invasion. Recent studies demonstrated that gastrin-releasing peptide (GRP) and its receptors play a role in the development of a variety of cancers including gliomas. The GRP receptor was shown to be over-expressed on glioblastoma cell lines and its function is related with cellular growth. In the present study, we investigated the effects of RC-3095, a selective antagonist of the GRP receptor, alone and in combination with temozolomide (TMZ), a DNA alkylating agent, in vitro and in vivo using experimental rat C6 glioma models. Cellular proliferation was reduced in all treatments (TMZ, RC-3095 and TMZ + RC-3095) with the administration of TMZ together with RC-3095 being the most effective. In in vivo experiments, the control group displayed the largest tumors (52 ± 15.5 mm3), whereas RC-3095 reduced the tumor size, with the most significant effect observed at the dose of 0.3mg/kg (21 ± 9.7 mm3). The combined therapy produced the largest reduction in tumor size (10 ± 7.5 mm3), greater than with either treatment alone. Ours results show that the combination of RC-3095 and TMZ have additive effects on the in vitro and in vivo glioma growth therefore making RC-3095 a candidate drug to potentiate the effects of the DNA alkylanting agent temozolomide in the treatment of malignant gliomas.