Orientador: Adriane Pinto Wasko / Banca: Carlos Roberto Teixeira / Banca: Renata Cristina Batista Fonseca / Resumo: Entre os animais silvestres envolvidos em tráfico e comércio ilegal no Brasil, as aves compreendem um dos grupos mais atingidos, especialmente devido a características como canto e colorido das penas. Atualmente, análises genéticas representam uma das formas mais eficazes de gerar dados para solucionar e minimizar os resultados de crimes ambientais e comércio ilegal de animais silvestres. Desta forma, este trabalho teve como objetivo realizar análises genéticas de sexagem em diversas aves, incluindo espécies comumente associadas ao tráfico de animais e apreendidas pela Polícia Ambiental e pelo IBAMA (Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis), e gerar um material de divulgação científica sobre tráfico e conservação deste grupo de vertebrados. Amostras de DNA foram obtidas de penas e sangue de 124 exemplares de 53 espécies das famílias Accipitridae, Cacatuidae, Cardinalidae, Cariamidae, Columbidae, Cuculidae, Emberezidae, Falconidae, Icteridae, Musophagidae, Psittacidae, Ramphastidae, Sturnidae, Thraupidae, Tinamidae, Trochilidae e Turdidae, mantidas junto a um Centro de Recepção, Triagem e Reabilitação de Animais Silvestres - CETAS (ONG Instituto Floravida, Botucatu, SP), a um Centro de Medicina e Pesquisa em Animais Silvestres - CEMPAS (Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, UNESP, Botucatu, SP) e a dois criadouros científicos de fauna silvestre para fins de conservação (Criadouro C.A., Itatiba, SP e Criadouro Poços de Caldas, Poços de Caldas, MG). Perfis genéticos sexo-específicos foram gerados por meio da amplificação de segmentos de DNA dos cromossomos Z e W. Um conjunto de primers que se anelam a regiões de éxons dos genes CHD-Z e CHD-W (chromo helicase-DNA binding) e que amplificam uma região de íntron que difere em tamanho entre os dois genes foi utilizado em PCR (Polymerase Chain Reaction) e os produtos de amplificação foram visualizados em gel de agarose 2%. ... / Abstract: Birds represent a large part of the animals associated to illegal trade and commerce in Brazil, mainly due to some characteristics as song and feathers colors. Nowadays, genetic analyses comprehend one of the most efficient approaches to generate data in order to solve and minimize the results of environmental crimes and illegal trade of wild animals. Therefore, this work intent to perform sex identification genetic analyses in several birds, including species that are commonly associated to illegal animal trade and apprehended by the Environmental Policy and by IBAMA (Brazilian Institute of Environment and Renewable Natural Resources), and generate a scientific broadcasting material about illegal trade and conservation of this vertebrate group. DNA samples were obtained from feathers and blood of 124 individuals that belong to 53 species of the families Accipitridae, Cacatuidae, Cardinalidae, Cariamidae, Columbidae, Cuculidae, Emberezidae, Falconidae, Icteridae, Musophagidae, Psittacidae, Ramphastidae, Sturnidae, Thraupidae, Tinamidae, Trochilidae, and Turdidae, maintained by a Wildlife Reception, Screening and Rehabilitation Center (Floravida Institute NGO), a Wildlife Animal Health and Research Center (Faculty of Veterinary Medicine and Zootechny, São Paulo State University Botucatu, SP) and to two scientific breeding grounds of wild fauna based on conservation purposes (Criadouro C.A., Itatiba, SP and Criadouro Poços de Caldas, Poços de Caldas, MG). Sex-specific genetic profiles were generated by the amplification of DNA segments of the Z and W chromosomes. A primer set that anneal to exon regions of the CHD-Z and CHD-W (chromo helicase-DNA binding) genes and that amplify an intron region that differ in size between the two genes was used in PCR (Polymerase Chain Reaction) and the amplification products were visualized in 2% agarose gel. Two different size DNA fragments were evidenced for females and a single fragment was ... / Mestre

Orientador: Regina Maria Barretto Cicarelli / Banca: Joyce Aparecida Martins Lopes Ferraz / Banca: Rogério Nogueira de Oliveira / Resumo: A identificação humana por meio do DNA constitui um dos produtos mais revolucionários da Genética Moderna, tornando-se uma ferramenta indispensável na investigação criminal. Essa identificação é baseada no perfil genético do indivíduo, pela combinação de diversos marcadores herdados de seus progenitores. Os marcadores são, geralmente,e diferenças nas sequências de DNA nuclear entre os indivíduos (polimorfismos). Em alguns casos, em que a análise do DNA nuclear não puder ser aplicada, a alternativa de maior sucesso é a análise do DNA mitocondrial (DNAmt). As mitocôndrias são organelas intracelulares de dupla membrana presentes em todas as células nucleadas de mamíferos, com genoma extracromossômico separado e distinto do genoma nuclear, o DNA mt. A maioria dos laboratórios que utilizam tipagem do DNAmt baseiam-se nos polimorfismos presentes na sequência de nucleotídeos na região não codificadora (também conhecida como região controle, hipervariável, ou D-loop) do DNAmt. No entanto, a classificação em alguns haplogrupos pode não ser possível com base em dados apenas da região controle. Assim, estudos sugerem a necessidade de tipagem adicional de polimorfismos de nucleotídeos únicos (SNPs) em outras regiões do DNAmt, em especial, nos casos onde não é possível diferenciar os indivíduos apenas pela análise da região hipervariável. Este trabalho teve como objetivo analisar, analisar 30 (trinta) SNPs do DNAmt em amostras de indivíduos não relacionados, nascidos e residentes no Estado do Espírito Santo, permitindo a classificação das mesmas em haplogrupos e complementando os dados de SNPs da região controle do DNAmt obtidos em trabalho anterior no laboratório, para posterior utilização em casos forense. De um total de 100 amostras, foram encontrados 19 haplogrupos e a população estudada foi classificada conforme sua origem em: 43% africana, 30% europeia... / Abstract: Human identification through DNA is one of the most revolutionary products of Modern Genetics, making it an indispensable tool in criminal investigation. This identification is based on the genetic profile of the individual, the combination of several markers inherited from their parents. The markers are generally differences in nuclear and DNA sequences between individuals (polymorphisms). In some cases, the analysis of nuclear DNA cannot be applied, the most successful alternative is the analysis of mitochondrial DNA (mtDNA). Mitochondria are intracellular organelles with a double membrane present on all nucleated mammalian cells with separate and distinct extrachromosomal genome nuclear genome, the mt DNA. Most laboratories use typing based mtDNA polymorphisms in the nucleotide sequence in the noncoding region (also known as the control region, the hypervariable or D-loop) of mtDNA. However, in some haplogrupos classification may not be possible based on only control data region. Thus, studies suggest the need for additional typing single nucleotide polymorphisms (SNPs) in other regions of mtDNA, especially in cases where it is not possible to differentiate individuals only by the analysis of hypervariable region. This study aimed to analyze, analyze thirty (30) SNPs of mtDNA in samples of unrelated individuals born and living in the State of Espírito Santo, allowing their classification in haplogroups and complementing the SNPs data of mtDNA control region achieved in previous work in the laboratory, for later use in forensic cases. A total of 100 samples, 19 were found haplogroups and the sample were classified according to its origin: 43% African, 30% European, 26% Native American, and 1% Asian. The haplogroup was found more L3 having African origin. Some samples of previous work could not be correctly classified only with the sequencing of the control region of mtDNA, after analysis of 30... / Mestre

Orientador: Regina Maria Barretto Cicarelli / Banca: Raquel Mantuaneli Scarel Caminaga / Banca: Celso Teixeira Mendes Júnior / Banca: Rogério Nogueira de Oliveira / Banca: Maria Leonor Rodrigues de Souza Botelho Gusmão / Resumo: Os marcadores STR são os mais utilizados na rotina de identificação humana e genética forense, entretanto, os marcadores INDEL s vem chamando a atenção dos pesquisadores desta área, pois sua análise pode ser uma ferramenta interessante por serem analisados com um fragmento menor que os STR e apresentarem baixa taxa de mutação, podendo ser utilizados na identificação de indivíduos e na avaliação de ancestralidade. Neste trabalho, caracterizamos as populações brasileiras dos estados de São Paulo e Espírito Santo pela análise de marcadores INDEL através de dois sistemas: 38 HID - INDELs, verificando a eficiência forense nas duas populações e comparando os dados com os d e STRs rotineiramente utilizados na população de São Paulo; e 46 AIM - INDELs, avaliando as proporções de ancestralidade nas duas populações, e comparando os dados com os de marcadores uniparentais na população do Espírito Santo. Ambos os métodos foram efici entes para suas respectivas finalidades, sendo que o sistema 38 HID - INDELs apresentou alto poder de discriminação, para Espírito Santo (PD = 0,9999999999999990) e para São Paulo (PD = 0,999999999999994) ; e o sistema 46 AIM - INDELs confirmou a miscigenação d as populações estudadas, e neste caso, com maior ancestralidade genética de europeus, em comparação a africanos e nativo - americanos. Além disso, inserimos o marcador amelogenina no sistema multiplex 38 HID - INDELs como uma ferramenta complementar para ident ificação de sexo de amostras degradadas. / Abstract: The STR markers are the most used in routine of human identification and forensic genetics, however, INDEL markers has attracted the attention of those researchers in this area, because their analysis can be an interestin g tool to be analyzed with a smaller fragment that STR and to present low mutation rate, may be used to identify individuals and evaluating a ncestry. In this work, we characterize d the Brazilian populations of the states of São Paulo and Espírito Santo by INDEL markers analysis thr ough two systems: 38 HID - INDEL s, checking the forensic efficiency in this two populations and comparing the data w ith STRs r outinely used in São Paulo population; and 46 AIM - INDELs, assessing the proportions of ancestry in this two populations, and comparing the data with uniparental markers in Espírito Santo population. Both methods were effectiv e for their respectiv e purposes, the 38 HID - INDEL s system showed high discrimi nation power to Espírito Santo ( PD = 0 .9999999999999990 ) and to São Paulo (PD = 0.999999999999994 ) ; and the 46 AIM - INDEL s system confirmed the mi xing of the populations studied, and in this case, with greater genetic ancestry of e uropeans, compared to af ricans and n ative a mericans. In addition, we insert the amelogenin ma rker in the 38 HID - INDEL s multiplex system as a complementary tool to identificate the sex of degraded samples. / Doutor

Orientador: Regina Maria Barretto Cicarelli / Banca: Leonor Gusmão / Banca: Joyce Aparecida Martins Lopes Ferraz / Banca: Raquel Mantuaneli Scarel Caminaga / Banca: Celso Teixeira Mendes Júnior / Resumo: Na rotina da genética forense, o uso exclusivo dos marcadores STRs (Short Tandem Repeats) em situações que a amostra biológica apresenta-se degradada pode gerar um resultado final estatístico inconclusivo, tornando fundamental a análise de marcadores adicionais para a resolução do caso. Utilizado como método complementar, os polimorfismos InDels (inserção/deleção) têm mostrado grande potencial para superar as limitações dos marcadores tradicionais. A análise de regiões do cromossomo X também vem ganhando significativa importância nesses estudos, especialmente nos casos em que a análise dos autossômicos não é suficiente. Nessa perspectiva, este trabalho teve por objetivo geral caracterizar a população do estado de São Paulo para 32 polimorfismos de inserção/deleção no cromossomo X (32 X-InDels) e avaliar a utilidade desse multiplex na resolução de casos forenses. Para tanto, buscou-se identificar a diversidade genética desses polimorfismos nessa população, a segregação dos alelos entre os genitores (pai e mãe) para as suas respectivas filhas e a eficiência desse painel na amplificação de DNA extraído de amostras ósseas. Para identificar a diversidade genética, foram analisados os perfis genotípicos de 500 indivíduos não aparentados nascidos no estado de São Paulo. Todos os marcadores mostraram-se polimórficos para a população, sendo MID3701 o que apresentou maior diversidade e somente MID2637 se mostrou pouco informativo. O marcador MID1361 apresentou-se em desequilíbrio de Ha... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In forensic genetics routine, the exclusive use of STRs (Short Tandem Repeats) markers when the biological sample is degraded can generate an inconclusive final statistical result, making essential the analysis of additional markers for case resolution. Used as a complementary method, InDels (insertion/deletion) polymorphisms have shown great potential to overcome the limitations of traditional markers. Polymorphisms in the X chromosome is also gaining significant importance in these studies, especially in those cases in which the analysis of the autosomal markers is not enough. In this perspective, this study aimed to characterize the São Paulo state population for 32 X chromosome insertion/deletion polymorphisms (32 X-InDels) and to evaluate the utility of this multiplex in the resolution of forensic cases. Therefore, it was analyzed the genetic diversity of this population, the alleles segregation between the parents and their respective daughters, and the amplification efficiency of this panel in DNA extracted from human bones. To identify genetic diversity, the genotypic profiles of 500 unrelated individuals born in São Paulo state was analysed. All markers were polymorphic for the population, with MID3701 being the most diverse, and MID2637 the less informative. The MID1361 marker was in Hardy-Weinberg disequilibrium and an allelic variant was identified in its short allele. The panel showed high forensic efficiency, confirmed by the accumulated power of discrimination (0.9999999999993 in females and 0.99999993 in males) and by the accumulated mean exclusion chance (0.999996 in trios and 0.99995 in duos). Comparing with other populations, significant values of genetic distance were obtained and São Paulo is closer to three... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-09-27T18:20:19Z No. of bitstreams: 1 TATIANA HESSAB DE CASTRO ARANHA.pdf: 1009567 bytes, checksum: fb4a1f6da7bdfaf8b20dee653132ee39 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-27T18:20:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TATIANA HESSAB DE CASTRO ARANHA.pdf: 1009567 bytes, checksum: fb4a1f6da7bdfaf8b20dee653132ee39 (MD5) Previous issue date: 2012-08-20 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A Genética Forense é um ramo da Ciência que está se expandindo a cada dia. O aprimoramento das técnicas moleculares vem trazendo uma constante renovação e relevantes discussões para a consolidação dessa área de estudo. Na identificação humana pelo perfil de DNA, além da comparação de perfis genéticos, usam-se métodos estatísticos a fim de estimar a probabilidade de um determinado perfil ser encontrado apenas a partir do doador em comparação ao de outro indivíduo qualquer da população. Essa análise é baseada em frequências obtidas de estudos feitos previamente na população. Para a realização dos casos criminais de identificação genética, o estado do Rio de Janeiro conta com o Instituto de Pesquisa e Perícias em Genética Forense (IPPGF), que é o órgão Pericial da Polícia Civil. Esse órgão recebe amostras de todo o estado, agregando um estoque representativo de amostras da população Rio de Janeiro. Dessa forma, um estudo empregando amostras do IPPGF é de grande importância na solução de casos de identificação genética criminal. Nesse contexto, o presente trabalho tem por finalidade caracterizar a população de Rio de Janeiro através das frequências alélicas de marcadores utilizados na genética forense a partir da análise de amostras de 505 indivíduos não aparentados, que doaram material biológico para confronto genético, no Instituto de Pesquisa e Perícias em Genética Forense, no período de 2008 a 2011. No presente estudo foram empregados 17 marcadores autossômicos do tipo STR 2 (short tandem repeats) e a genotipagem foi baseada nos kits de identificação humana Power Plex® 16 System / Power Plex® 16 HS System, da empresa Promega, e/ou AmpFlSTRIdentifiler™ / AmpFlSTRIdentifiler™ Plus e AmpFℓSTR® MiniFiler™, da empresa Applied Biosystems. Com base na análise dos perfis genéticos, foram calculadas as frequências alélicas dos marcadores genéticos, os parâmetros forenses, o coeficiente de endogamia (FIS), realizado o teste exato do Equilíbrio Hardy-Weinberg. Nos 17 marcadores estudados, foi detectado um total de 215 alelos distintos. O locus D21S11, foi o mais polimórfico (25 alelos), seguido do FGA (22 alelos). O alelo 8 do TPOX apresentou a maior frequência observada. Além disso, esse locus teve o menor Poder de Discriminação (PD = 0,879), Poder de Exclusão (PE = 0,419) e Conteúdo de Informação Polimórfica (PIC = 0,676) e a maior Probabilidade de Coincidência Aleatória (PM = 0,121). O marcador genético Penta E apresentou o maior Poder de Discriminação (PD = 0,983), Poder de Exclusão (PE = 0,761) e Conteúdo de Informação Polimórfica (PIC = 0,905) e menor Probabilidade de Coincidência Aleatória (PM = 0,017). Foram realizados ainda análises a fim de estudar a composição étnica da população. A árvore filogenética de Neighbor-Joining, com dados de diferentes regiões brasileiras, possibilitou detectar uma semelhança entre população do Rio de Janeiro e a população do Nordeste. No entanto, não foram observados valores estatisticamente significativos na análise do índice de fixação (FST) par a par entre as populações, indicando ausência de estruturação, importante característica no caso de marcadores genéticos utilizados em testes de identificação humana. O gráfico “Triangle Plot” populacional, gerado no software Structure, sugere que, em média, os indivíduos não apresentam contribuição maior de determinado grupo étnico em comparação com os demais, podendo a população do Rio de Janeiro ser formada por contribuição similar dos grupos étnicos principais. De maneira, geral observamos que os alelos de maior frequência nos diversos genes estudados também se distribuem amplamente nas diversas populações mundiais. / Improvement of molecular techniques has brought a constant renewal and relevant discussion to Forensic Genetics development. In human genetic identification, after comparing genetic profiles, statistical methods are applied to estimate the probability of a given profile be found only from the donor in comparison to another individual of the population. This analysis is based on frequencies obtained from previous studies done in the population. In the state of Rio de Janeiro, the IPPGF (Instituto de Pesquisa e Perícias em Genética Forense) is responsible for performing genetic identification in criminal cases. This Institute receives samples of the whole state, joining a representative stock of Rio de Janeiro samples. In this way, a research using samples of IPPGF is very important to solve criminal case of genetic identification. Therefore, this work aims to develop an allele frequencies database from samples of 505 unrelated individuals who, from 2008 to 2011, donated biological material to IPPGF. For this purpose, we have genotyped 17 autosomal STRs (short tandem repeats) using the human identification kits PowerPlex® 16 System / PowerPlex® 16 HS System (Promega Corporation) and AmpFℓSTR™ Identifiler / AmpFℓSTR™ Identifiler Plus and AmpFℓSTR® MiniFiler™ (Applied Biosystems). Based on the genetic profiles analysis, we have calculated 4 the STR allele frequencies, tested for Hardy-Weinberg equilibrium, inbreeding coefficient (FIS) and forensic parameters. In these 17 genetic markers, we detected a total of 215 distinct alleles. The locus D21S11, was the most polymorphic (25 alleles), followed by FGA (22 alleles). The TPOX allele 8 was the most frequently observed. Furthermore, this locus had the lowest Power of Discrimination (PD = 0.879), Power of Exclusion (PE = 0.419) e Polymorphism Information Content (PIC = 0.676) and the highest Probability of a Random Match (PM = 0.121). The marker Penta E had the highest Power of Discrimination (PD = 0,983), Power of Exclusion (PE = 0.761) and Polymorphism Information Content (PIC = 0.905) and the lowest Probability of a Random Match (PM = 0.017). Further analyzes were performed to study the ethnic composition of the population. The Neighbor-Joining phylogenetic tree (data from different Brazilian regions) showed a similarity between the Rio de Janeiro population and the Northeast Brazilian population. However, none statistical significance was observed in pairwise FST analysis among populations, indicating the absence of structuration, an important trait for of genetic markers used in human identification tests. The "Triangle Plot" graphic, designed by the Structure software, suggests that, on average, individuals have no greater contribution of a particular ethnic group and the Rio de Janeiro population may be formed by the similar contribution of the main ethnic groups. By comparing the allele frequencies obtained, we have detected that the alleles of higher frequency, in the present study, showed in general, wide distribution in various populations.

Submitted by DANILO FAUSTINO BRAGANHOLI null (danilobraganholi@hotmail.com) on 2016-02-26T18:28:02Z No. of bitstreams: 1 TESE DOUTORADO DANILO FINAL.pdf: 5854320 bytes, checksum: 574fd8d3f97ad7193fe8490f98829058 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-02-29T13:48:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 braganholi_df_dr_araiq.pdf: 5854320 bytes, checksum: 574fd8d3f97ad7193fe8490f98829058 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-29T13:48:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 braganholi_df_dr_araiq.pdf: 5854320 bytes, checksum: 574fd8d3f97ad7193fe8490f98829058 (MD5) Previous issue date: 2016-02-17 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Os marcadores STR são os mais utilizados na rotina de identificação humana e genética forense, entretanto, os marcadores INDELs vem chamando a atenção dos pesquisadores desta área, pois sua análise pode ser uma ferramenta interessante por serem analisados com um fragmento menor que os STR e apresentarem baixa taxa de mutação, podendo ser utilizados na identificação de indivíduos e na avaliação de ancestralidade. Neste trabalho, caracterizamos as populações brasileiras dos estados de São Paulo e Espírito Santo pela análise de marcadores INDEL através de dois sistemas: 38 HID-INDELs, verificando a eficiência forense nas duas populações e comparando os dados com os de STRs rotineiramente utilizados na população de São Paulo; e 46 AIM-INDELs, avaliando as proporções de ancestralidade nas duas populações, e comparando os dados com os de marcadores uniparentais na população do Espírito Santo. Ambos os métodos foram eficientes para suas respectivas finalidades, sendo que o sistema 38 HID-INDELs apresentou alto poder de discriminação, para Espírito Santo (PD = 0,9999999999999990) e para São Paulo (PD = 0,999999999999994); e o sistema 46 AIM-INDELs confirmou a miscigenação das populações estudadas, e neste caso, com maior ancestralidade genética de europeus, em comparação a africanos e nativo-americanos. Além disso, inserimos o marcador amelogenina no sistema multiplex 38 HID-INDELs como uma ferramenta complementar para identificação de sexo de amostras degradadas. / The STR markers are the most used in routine of human identification and forensic genetics, however, INDEL markers has attracted the attention of those researchers in this area, because their analysis can be an interesting tool to be analyzed with a smaller fragment that STR and to present low mutation rate, may be used to identify individuals and evaluating ancestry. In this work, we characterized the Brazilian populations of the states of São Paulo and Espírito Santo by INDEL markers analysis through two systems: 38 HID-INDELs, checking the forensic efficiency in this two populations and comparing the data with STRs routinely used in São Paulo population; and 46 AIM-INDELs, assessing the proportions of ancestry in this two populations, and comparing the data with uniparental markers in Espírito Santo population. Both methods were effective for their respective purposes, the 38 HID- INDELs system showed high discrimination power to Espírito Santo (PD = 0.9999999999999990) and to São Paulo (PD = 0.999999999999994); and the 46 AIM- INDELs system confirmed the mixing of the populations studied, and in this case , with greater genetic ancestry of europeans, compared to africans and native americans. In addition, we insert the amelogenin marker in the 38 HID-INDELs multiplex system as a complementary tool to identificate the sex of degraded samples.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciência da Saúde, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2015-01-22T16:24:20Z No. of bitstreams: 1 2014_ArthurEstivaletSvidzinski.pdf: 3625845 bytes, checksum: afc856ef59683659e917b21d2b7e4d7c (MD5) / Approved for entry into archive by Ruthléa Nascimento(ruthleanascimento@bce.unb.br) on 2015-02-11T18:36:28Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_ArthurEstivaletSvidzinski.pdf: 3625845 bytes, checksum: afc856ef59683659e917b21d2b7e4d7c (MD5) / Made available in DSpace on 2015-02-11T18:36:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_ArthurEstivaletSvidzinski.pdf: 3625845 bytes, checksum: afc856ef59683659e917b21d2b7e4d7c (MD5) / Genotipagem obtidas da analise da sequencia de DNA pelas mais diversas metodologias, os perfis de DNA, tem sido utilizadas frequentemente como ferramentas de investigação criminal e produção de provas periciais. Esses perfis tem sido cada vez mais solicitados as pericias, mesmo em situações onde a quantidade de DNA presentes nas amostras é muito pequena. Este é o caso de amostras produzidas por contato, o touch DNA, onde objetos manipulados ou que entraram em contato com a pele humana apresentam pequenas quantidades de células depositadas em sua superfície, que podem ser alvos de pesquisa de material genético. Neste tipo de amostra, uma grande dificuldade é identificar as melhores regiões para coleta, uma vez que o material depositado por contato não é visualmente destacado. A pesquisa de impressões digitais utiliza pós reveladores com a finalidade de revelar impressões digitais latentes, ou seja, possibilitam identificar as áreas de um objeto que entraram em contato com a pele humana. O objetivo deste trabalho foi avaliar a utilização de pós reveladores como ferramentas de triagem para coleta de material biológico deixado por contato com a finalidade de obtenção de perfis genéticos. Em primeiro lugar foi avaliada a quantidade de pó aderido a impressões deixadas por diferentes partes das mãos e a correlação entre a quantidade de pó aderido e a quantidade de DNA recuperado em uma amostra produzida por contato. A seguir foi avaliada a influência do pó revelador nos procedimentos laboratoriais envolvidos em uma análise de DNA. Para tanto, foi observado o efeito inibidor dos pós reveladores sobre a reação de PCR, a capacidade de diferentes métodos de extração em diminuir essa inibição e o resultado de um procedimento de purificação sobre o efeito inibitório. Finalmente, foi feita a pesquisa de DNA em cinco objetos relacionados a ocorrências criminais: arma de fogo, cartucho de munição, faca de cozinha, volante de veículo e alavanca de câmbio. Os resultados mostraram que a quantidade de pó aderido variou conforme a região da mão que produziu a impressão e que foi diretamente relacionada com a quantidade de DNA presente na amostra. O pó revelador apresentou um importante efeito inibidor sobre a reação de PCR. Os métodos de extração de DNA diminuem o efeito inibitório, porém este continua relevante. O procedimento de purificação não eliminou totalmente o efeito inibitório, porém o reduz a uma intensidade em que não comprometeu totalmente a obtenção de perfis genéticos. Nos cinco objetos testados foi possível coletar DNA em grande quantidade no volante de veículo e em quantidades razoáveis na arma de fogo, alavanca de câmbio e faca de cozinha. O cartucho de munição apresentou uma quantidade de DNA recuperada muito baixa, insuficiente para a produção de perfis genéticos de qualidade. Portanto, podemos concluir que pós reveladores podem ser utilizados como ferramentas para a eleição das regiões de coleta de material biológico produzido por contato. Mesmo considerando o seu efeito inibitório sobre a reação de PCR, amostras coletadas juntamente com pós reveladores são capazes de produzir perfis genéticos com qualidade suficiente para análise genética. __________________________________________________________________________________ ABSTRACT / DNA analysis has been used as a tool of criminal investigation and for producing forensic evidence. This kind of exam has been increasingly requested, even in situations where the amount of DNA present in the samples is very small. For example, samples of touch DNA, which consists of objects manipulated or touched by human skin that have small amounts of cells deposited on its surface, potential targets to DNA analysis. In this kind of sample, a great challenge is to identify the best locations for sample collection, since the biological material is not easy to identify. The fingerprint revelation technique uses fingerprint powders to reveal latent fingerprints allowing the identification surfaces touched by human skin. The aim of this study was to evaluate the possibility of using the fingerprint powders as screening tools for collecting biological material in touch DNA samples, obtaining good quality genetic profiles. The first step was to study the amount of powder adhered to the impressions produced by the different parts of the hands and the correlation between the amount of powder and the amount of DNA recovered. Next, the influence of fingerprint powder on laboratory procedures involved in DNA analysis was evaluated. The inhibitory effect of fingerprint powder in the PCR reaction was tested followed by the effect of different extraction methods on the inhibition. One DNA purification step was even included to improve the results. Finally, five different objects related to crimes: firearms, ammunition cartridge, kitchen knife, steering wheel and gear shift were proceeded to DNA analysis. The results showed that the amount of fingerprint powder recovered differed according the region of the hand which produced the fingerprint and the amount of adhered powder was directly related to the amount of DNA obtained. The fingerprint powder had a significant inhibitory effect on the PCR reaction. The methods of DNA extraction decreases the inhibitory effect, but it remains relevant. The purification procedure does not completely eliminate the inhibitory effect, but reduces an intensity that does not completely compromise the obtaining genetic profiles. In the five tested objects, it was possible to collect good amounts of DNA in the steering wheel, and in reasonable quantities in the firearms, gear shift and kitchen knife. The cartridge ammunition was the only object which was not possible to recover DNA in sufficient amount to produce quality genetic profiles. Therefore, we conclude that fingerprint powders can be used as tools for choosing the right regions to collect biological material in touch DNA samples. Even considering its inhibitory effect on the PCR reaction, samples collected along with fingerprint powders are able to produce genetic profiles with sufficient quality for genetic analysis.

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-07-19T13:40:55Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) tese final.pdf: 4052323 bytes, checksum: 74297c119131b87a26908be1d213027a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-19T13:40:55Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) tese final.pdf: 4052323 bytes, checksum: 74297c119131b87a26908be1d213027a (MD5) Previous issue date: 2015-12-01 / CAPEs / O uso de insetos visando responder aos quesitos levantados em investigações criminais ganhou espaço nas últimas décadas entre os pesquisadores e profissionais desta área, assim como a combinação de técnicas de genética forense para a obtenção de DNA humano a partir destes organismos, em especial dos dípteros necrófagos. Desse modo, neste estudo objetivou-se obter e testar um protocolo de identificação de DNA humano extraído a partir de larvas de dípteros coletadas em cadáveres no Instituto de Medicina Legal de Pernambuco Antonio Persivo Cunha (IMLAPC/PE). Inicialmente, espécimes imaturos foram coletados no IMLAPC/PE e criados em dieta a base de carne moída bovina para possibilitar a identificação da espécie mais abundante e frequente que se cria neste substrato. A espécie Chrysomya albiceps (Diptera: Calliphoridae) foi selecionada como modelo experimental. Grupos de larvas dessa espécie foram submetidos a uma dieta baseada em carne moída e sangue humano por 48 horas, dissecadas e submetidas a extração de DNA, utilizandose duas metodologias comumente adotadas pelos laboratórios de genética forense: Kit DNA IQ™ e Método Fenol-Clorofórmio. O DNA extraído foi quantificado através de Nanodrop® e Real-Time PCR 7500 com uso do Quantifiler® Duo DNA Quantification. Para amplificação do DNA foram usados os kits para STR (short tandem repeats): AmpFℓSTR® Identifiler® Plus PCR Kit, Argus X-12® Kit e PowerPlex® Fusion System kit. As amostras amplificadas foram analisadas por eletroforese capilar em ABI PRISM 3500, permitindo observar que, para os kits utilizados houve perfis íntegros e compatíveis com a amostra referência, a partir da extração com kit DNA IQ™ e/ou método Fenol- Clorofórmio. Além disso, foram testados quatro meios de armazenagem comumente utilizados em zoologia: etanol 70%, etanol 95%, formol 4% e via seca. Após 24 horas de armazenagem, as amostras foram submetidas aos processos de análise de DNA e o formol 4% apresentou os melhores perfis de DNA. O fato de haver perfis passíveis de comparação confirma a utilidade das larvas de dípteros usadas para este fim, as quais podem futuramente ser usadas para correlacionar perfis genéticos com uma cena criminal. O aprimoramento destas técnicas é necessário para que o uso das larvas de dípteros muscóides com emprego para a entomogenética tenha mais difusão entre os meios acadêmico e forense. / The use of insects for investigations has gained ground in recent decades among researchers and criminal professionals. Recently, the use of these animals has been combined with forensic genetics techniques for obtaining human DNA from these. Among the main focus groups for this technique are the carrion flies that have the host DNA extracted from intestinal contents. Because the visibility of this branch of forensic biology, this study aimed to obtain and test a protocol for identifying human DNA extracted from larvae of Diptera at the Instituto de Medicina Legal de Pernambuco Antonio Persivo Cunha (IMLAPC/PE). The species Chrysomya albiceps (Diptera: Calliphoridae) was selected as an experimental model. Groups of larvae of this species were subjected to diet ground meat and human blood for 48 hours, dissected and subjected to DNA extraction using two methods commonly used by forensic genetics laboratories: DNA IQ™ Kit and Method phenol-chloroform. The extracted DNA was quantified by Nanodrop® and Real-Time PCR 7500 with use of Quantifiler® Duo DNA Quantification. For DNA amplification kits for STR (short tandem repeats) were used: AmpFℓSTR® Identifiler® Plus PCR Kit, Argus X-12® Kit and PowerPlex® Fusion System kit. The amplified samples were analyzed by capillary electrophoresis in ABI PRISM 3500, allowing to observe for kits used there have upright profiles and compatible with the reference sample, from the IQ™ DNA extraction kit and/or phenol-chloroform method. In addition, four storage means commonly used in zoology were tested: 70% ethanol, 95% ethanol, 4% formaldehyde and dry. After 24 hours of storage, the samples were submitted to DNA analysis processes and the 4% formaldehyde DNA showed the best profile. The fact that there be comparable profiles confirms the usefulness of dipteran larvae used for this purpose, which can further be used to correlate genetic profiles and a criminal scene. The improvement of these techniques is required for the use of larvae dipterae with employment for the entomogenetics have more diffusion among academic and forensic means.

Made available in DSpace on 2016-08-10T10:38:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ian Marques Candido.pdf: 1079357 bytes, checksum: dac0a34c413d6875a597e0f2ba2a41f6 (MD5) Previous issue date: 2013-02-08 / The identification of human remains in decomposition, charred, skeletal remains and mass disasters can be performed by Forensic Genetics and, in most cases, bones and teeth are the only viable source for DNA typing .Thus, considering the large number of bones used in human identification and the need for standardization of DNA extraction in this kind of sample, the aim of this study is to compare two techniques of DNA extraction, with the possibility of automation. The analysis was performed on twenty five human bones evaluating the quantity of the extracted genetic material, genetic profiles obtained for each sample and the time analysis by method used. With magnetic bead in platform automated, analysis time was 3 hours to process 12 samples, whereas by silica column four samples in 27 hours. Magnetic bead recovered a larger amount of DNA in 88% of samples. 68% of the samples magnetic particle had a high amplification partial (9/16 loci) and silica column only 36%. Therefore, the method used magnetic bead is suitable for automating the extraction processes. / A identificação humana de restos mortais em avançado estado de decomposição, carbonizados, desastres em massa e esqueletizados pode ser realizada pela Genética Forense e, na maioria das vezes, ossos e dentes são as únicas fontes de DNA viáveis para análise. Dessa maneira, considerando o grande número de ossos utilizados na identificação humana e a necessidade de padronização da técnica de extração de DNA nesse tipo de amostra, o objetivo do presente trabalho é comparar duas técnicas de extração de DNA, com possibilidade de automação. A análise foi realizada em vinte e cinco ossos humanos avaliando a quantidade do material genético extraído, os perfis genéticos obtidos em cada amostra e o tempo de análise gasto pela metodologia de extração. Com a metodologia de extração por partículas magnéticas utilizando plataforma automatizada, o tempo de análise foi de 3 horas para processar 12 amostras, enquanto que por coluna de sílica 4 amostras em 27 horas. Partícula magnética recuperou uma maior quantidade de DNA em 88% das amostras. 68% das amostras extraídas por partículas magnéticas tiveram uma amplificação parcial alta (9/16 loci) e por coluna de sílica apenas 36%. Por conseguinte, a metodologia de extração por partículas magnéticas é apropriada para a automatização dos processos de extração.

A genética forense vem se desenvolvendo cada vez mais, com novas tecnologias e implementação de novos conjuntos de marcadores de DNA com maiores níveis de informatividade. Os marcadores genéticos são amplamente usados na identificação humana, pois permitem distinguir indivíduos com alta acurácia. Duas classes de marcadores muito utilizadas atualmente são os STRs (Short Tandem Repeats) e os SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms). Os STRs são altamente informativos e, portanto, úteis para a prática forense. Kits mais novos como GlobalFiler (Thermo Fisher Scientific) e PowerPlex Fusion System (Promega) apresentam a análise de mais de 20 loci STRs de uma só vez. Já os SNPs, por possuírem sua informatividade mais reduzida (necessita de mais loci analisados), são menos utilizados, porém apresentam vantagem em amostras degradadas de DNA; assim, conjuntos de identificação como o 52-plex desenvolvido pelo consórcio SNPforID e o conjunto IISNPs, vêm sendo estudados em várias populações do mundo. Com o desenvolvimento de técnicas de sequenciamento de nova geração (NGS Next Generation Sequencing) para análise de DNA, a obtenção de perfis de DNA se tornou mais acurada. Algumas plataformas permitem gerar perfis de até 96 indivíduos simultaneamente. Este estudo tem por objetivo principal analisar 171 marcadores genéticos (Amelogenina, Y-INDEL, 30 STRSs e 139 SNPs) em 340 indivíduos miscigenados da região da cidade de Ribeirão Preto (SP) utilizando a plataforma de sequenciamento de nova geração MiSeq Personal Sequencer (Illumina Inc.), bem como calcular as frequências alélicas e genotípicas, verificar a aderência ao equilíbrio de HardyWeinberg e estimar parâmetros forenses para os diferentes conjuntos de marcadores. Análises de ancestralidade foram realizadas para os conjuntos de SNPs. Para o preparo das bibliotecas de amostras a serem sequenciadas, foi utilizado o kit HaloPlex (Agilent Technologies, Inc), onde foram incluídos os marcadores dos kits GlobalFiler e PowerPlex Fusion System, e os SNPs existentes no conjunto do consórcio SNPforID (52-plex) e IISNPs (92 SNPs). De todos os marcadores incluídos no ensaio, apenas um SNP (rs763869) presente no conjunto SNPforID não pôde ser analisado devido a questões técnicas. Dos 139 SNPs analisados apenas seis apresentaram desvios significativos em relação ao equilíbrio de Hardy-Weinberg,número este esperado devido ao acaso. Os conjuntos de SNPs apresentam elevada informatividade com Probabilidade de Match de 6,48 x 10-21 (52-plex) a 4,91 x 10-38 (IISNP), e Poder de Exclusão de 0,9997 (52-plex) e 0,99999997 (IISNP). De modo geral, as inferências de ancestralidade obtida utilizando estes conjuntos, indicaram elevada contribuição europeia (superior a 70%) e baixa contribuição ameríndia (inferior a 10%) na população, enquanto que as análises de mistura individual se mostraram consistentes, com a maioria dos indivíduos apresentando elevada ancestralidade europeia. Os resultados dos marcadores relativos ao sexo (Amelogenina, Y-INDEL e DYS391) foram consistentes com o sexo dos doadores das amostras. As frequências alélicas e parâmetros forenses foram calculados para os STRs, revelando uma alta informatividade. A Probabilidade de Match combinada e o Poder de Exclusão combinado foram de 1,19 x 10-36 e 0,999999999997 respectivamente. Dos 29 STRs autossômicos presentes, seis apresentaram desvios ao equilíbrio de Hardy-Weinberg, refletindo possíveis falhas no sequenciamento e genotipagem destes marcadores / The field of forensic genetics has developed increasingly with the implementation of new sets of DNA markers with higher levels of informativeness. The genetic markers are widely used in human identification as they allow distinguishing individuals with high accuracy. Two of the most commonly used markers are the Short Tandem Repeats (STRs) and the Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs). Newer kits such as GlobalFiler (Thermo Fisher Scientific) and PowerPlex Fusion System (Promega) can analyze more than 20 STRs loci at once. When comparing with STRs, the SNPs are less informative and many more loci are needed to reach the same informativeness of STR kits. However, they are advantageous when using degraded DNA samples. The identification sets such as the 52-plex developed by the SNPforID Consortium and the IISNPs have been analyzed in many worldwide populations. With the development of next generation sequencing techniques (NGS Next Generation Sequencing), obtaining DNA profiles has become more accurate and some platforms allow generating profiles of up to 96 individuals simultaneously. The main goal of this study is to analyze 171 markers (Amelogenin, Y-INDEL, 30 STRs and 139 SNPs) in 340 admixed individuals from Ribeirão Preto, SP, using the NGS platform MiSeq Personal Sequencer (Illumina Inc.). This will allow the calculation of allele and genotype frequencies, the verification of adherence to Hardy-Weinbergs equilibrium and the estimation of forensic parameters for each set of marker. Ancestry analysis was performed for the sets of SNPs. The HaloPlex kit (Agilent Technologies, Inc) was used for library preparation including the STRs from the kits GlobalFiler and PowerPlex Fusion System and the SNPs from the SNPforID consortium (52-plex) and IISNPs (92 SNPs) identification sets. A single SNP (rs763869) from the SNPforID set was not analyzed due to technical issues. Only six of the 139 analyzed SNPs presented significant deviation from the Hardy-Weinberg equilibrium expectations, which is expected by chance alone. The SNPs sets exhibited high informativeness, with matchprobability ranging from 6.48 x 10-21 (52-plex) to 4.91 x 10-38 (IISNPs) and exclusion power of 0.9997 (52-plex) and 0.99999997 (IISNPs). In general, ancestry estimates obtained using these sets indicated a high European contribution (higher than 70%) and low Amerindian contribution (less than 10%) in the population sample, while the individual admixture analyses exhibited were highly consistent, with the majority of individuals presenting high European ancestry. The results of the sex markers (Amelogenin, Y-INDEL and DYS391) were in agreement with the reported sexes from sample donors. The allele frequencies and forensic parameters calculated for the STRs revealed high informativeness. The combined match probability and the combined exclusion power were 1.19 x 10-36 and 0.999999999997 respectively. Six of the 29 autosomal STRs presented significant deviations from the HardyWeinberg equilibrium expectations, reflecting possible failures in sequencing and genotyping of these markers