published_or_final_version / Surgery / Master / Master of Philosophy

Genetic recombination is an important process that generates new combinations of genes on which natural selection can operate. As such, an understanding of recombination in the human genome will provide insight into the evolutionary processes that have shaped our genetic history. The aim of this thesis is to use samples of population genetic data to explore the patterns of variation in the rate of recombination in the human genome. To do this I introduce a novel means of estimating recombination rates from population genetic data. The new, computationally efficient method incorporates a model of recombination hotspots that was absent in existing methods. I use samples from the International HapMap Project to obtain recombination rate estimates for the autosomal portion of the genome. Using these estimates, I demonstrate that recombination has a number of interesting relationships with other genome features such as genes, DNA repeats, and sequence motifs. Furthermore, I show that genes of differing function have significantly different rates of recombination. I explore the relationship between recombination and specific sequence motifs and argue that while sequence motifs are an important factor in determining the location of recombination hotspots, the factor that controls motif activity is unknown. The observation of many relationships between recombination and other genome features motivates an attempt to quantify the contributions to the recombination rate from specific features. I employ a wavelet analysis to investigate scale-specific patterns of recombination. In doing so, I reveal a number of highly significant correlations between recombination and other features of the genome at both the fine and broad scales, but find that relatively little of the variation in recombination rates can be explained. I conclude with a discussion of the results contained in the body of the thesis, and suggest a number of areas for future research.

O P3HB é um tipo de poliéster sintetizado por bactérias como reserva de carbono e energia, e mobilizado na escassez destes. Um estudo com mutantes de Burkholderia sacchari, indicou o envolvimento de PhaZa1 e LonA na mobilização de P3HB. Este estudo avaliou o papel de PhaZa1 e LonA neste processo. A complementação heteróloga dos mutantes de B. sacchari, a partir dos genes phaZa1 e lonA de Ralstonia eutropha, restabeleceu a capacidade de mobilização dessas cepas, confirmando o envolvimento de seus produtos no processo. A partir de cepas recombinantes de Escherichia coli, abrigando tanto os genes de acúmulo de P3HB como de mobilização de R. eutropha, obteve-se cepas abrigando os genes phaZa1 e lonA isoladamente e outra abrigando os dois genes simultaneamente. Quando separados, tanto phaZa1 quanto lonA, não apresentaram papel significante na mobilização porém, quando os dois genes são expressos simultaneamente, as taxas de mobilização atingem mais de 50%, indicando que deva ter uma interação entre PhaZa1 e LonA para que o processo de mobilização seja efetivo. / The P3HB is a type of polyester synthesized by bacteria like carbon and energy source, and is mobilizated when there is a shortage of these. A study with mutants of Burkholderia sacchari, showed the involvement of PhaZa1 and LonA in mobilization of P3HB. The present study evaluated the role of PhaZa1 and LonA in this process. The heterologous complementation of mutants of B. sacchari, with phaZa1 and lonA genes from Ralstonia eutropha, reestablished the mobilization capacity in these strains, confirming the involvement of their products in this process. From the recombinant strain of Escherichia coli, harboring accumulation and mobilization genes from R. eutropha, we obtained strains harboring phaZa1 and lonA genes singly and another harboring both genes simultaneously. When expressed singly, both phaZa1 as lonA, had no significant role in mobilization but, when both genes were expressed simultaneously, the rates of mobilization reached more than 50%, appointing that an interaction must occur between PhaZa1 and LonA for the mobilization process to be effective.

Através da análise de microssatélites e SNPs, incluindo tanto marcadores neutros como sujeitos a seleção, neste trabalho se demonstrou que: 1) As populações brasileiras de P. vivax (Pv) são mais diversas que as populações simpátricas de P. falciparum (Pf), porém ambas apresentam desequilíbrio de ligação. 2) Os polimorfismos neutros apresentam alta variabilidade ao longo do tempo em ambas as espécies, em contraste com a estabilidade observada nos marcadores sob seleção. 3) As altas taxas de recorrências por Pv na Amazônia brasileira são causadas, em sua maioria, por parasitas geneticamente não relacionados. 4) A recombinação não meiótica contribui substancialmente à diversidade dos domínios repetitivos de PvCSP. 5) Os SNPs nos genes pvmdr1 e pvcrt-o de isolados de Pv resistentes à cloroquina não se associam ao seu fenótipo in vivo. Finalmente, através da genotipagem de 57 SNPs do cromossomo 8 de Pv em 234 isolados do Brasil e da Ásia observou-se que, em Pv, a diversidade e a recombinação mitótica não se associam aos níveis de endemicidade como acontece em Pf e que Pv apresenta estrutura populacional continental e subcontinental no Brasil. / Through the analysis of microsatellites and SNPs, including both neutral and under selection markers, this work showed that: 1) The Brazilian populations of P. vivax (Pv) are more diverse than sympatric P. falciparum (Pf) populations, but both exhibit linkage disequilibrium. 2) For both species, neutral polymorphisms showed high variability over time, contrasting with the stability of under markers under selection. 3) The high rate of Pv recurrences in the Brazilian Amazon region is mostly due to genetically unrelated parasites. 4) Non-meiotic recombination substantially contributes to PvCSP repetitive domain diversity. 5) SNPs at pvmdr1 and pvcrt-o genes of chloroquine resistant isolates of Pv are not associated with the in vivo phenotype. Finally, 57 SNP genotyping of chromosome 8 of Pv among 234 isolates from Brazil and Asia showed that, in Pv, diversity and mitotic recombination are not associated with levels of endemicity as in Pf and that Pv presents continental population structure and subcontinental structure in Brazil.

Entre cepas diferentes de P. falciparum existe uma grande variação entre as sequências das famílias de genes variantes. Um motivo para esta grande variedade é o fato que a maioria dos genes variantes se encontra em regiões subteloméricas e que o parasita é capaz de recombinar telômeros heterólogos durante a meiose (recombinação ectópica), levando a uma nova distribuição e a criação de novos genes variantes. Além desse fenômeno que ocorre durante a fase sexual do parasita, foi considerado que recombinações também podem ocorrer durante a fase mitótica na fase assexuada sanguínea. Neste estudo, procuramos monitorar a importância desta recombinação ectópica na geração de novos genes var em amostras de campo da Amazônia brasileira. Em experimentos paralelos elucidamos se existe recombinação ectópica também durante divisões puramente mitóticas. Observamos que muitos genes var que são compartilhados entre isolados mudam raramente ou não mudam de posição cromossômica. Observamos que no caso de mudança de posição cromossômica muitas vezes ocorreu duplicação do lócus. Muitos dos genes var compartilhados se encontraram em cromossomos 5-6 e 9-7. Por monitoramento de clones de 3D7 após 180 gerações não observamos nenhuma translocação de genes var subtelomérico ou telomérico indicando que a recombinação ectópica em mitoses é de fato um evento raro. / Different strains of the causative agent of malaria, Plasmodium falciparum, possess greatly varying repertoires of variant antigen encoding gene families. One reason for this variety lies in the fact that most of the variant gene families are found in subtelomeric regions. The parasite is able to recombine heterologous telomers during meiosis through a process coined ectopic recombination, potentially leading to a new distribution and creation of variant genes. Due to morphological similarities of chromosome end clustering in sexual as well as in asexual forms, it was hypothesized that ectopic recombination may also occur in mitotic asexual blood stage parasites. Herein we monitor the occurrence of ectopic recombination in field samples from the Brazilian Amazon. In parallel, we elucidated whether ectopic recombination also takes place in purely mitotic divisions. We observed that many var genes which are shared among isolates rarely change their chromosomal position. When a change occurred, we often observed chromosomal locus duplication and many of the shared genes were found on chromosomes 5-9 or 5-10. After outgrowth of the 3D7 strain for 200 generations with intermittent cloning we did not observe any translocation of telomeric or subtelomeric var genes, indicating that ectopic recombination in mitosis is a rare event.

Giardia duodenalis é um protozoário de distribuição mundial responsável por causar infecções entéricas em uma grande variedade de mamíferos, incluindo os humanos. Mesmo apresentando pouca variação em sua morfologia, os isolados podem ser diferenciados, de acordo com análises de proteína e polimorfismo de DNA, em pelo menos oito agrupamentos genéticos distintos, denominados assemblages (A-H). Apenas os assemblages A e B têm sido reportados em humanos e outros mamíferos. Isolados de assemblage A podem, ainda, ser divididos em quatro sub-assemblages (AI, AII, AIII e AIV). Sequencias heterogêneas têm sido frequentemente identificadas em estudos de caracterização molecular envolvendo amostras contendo múltiplos cistos do parasita. Buscando estudar a ocorrência dos eventos de heterozigose de sequencia alélica (ASH) e recombinação gênica, o presente trabalho teve como objetivo isolar cistos de G. duodenalis empregando-se a técnica de micromanipulação e caracterizá-los molecularmente através da análise multilócus envolvendo os genes gdh, tpi, orfC4 e bg. Dez cistos foram individualizados e utilizados na pesquisa. Todos foram igualmente identificados por todos os genes, nove cistos caracterizados como assemblage AII e um cisto caracterizado como assemblage B. Os cromatogramas oriundos do cisto identificado como assemblages B apresentaram diversos sítios heterogêneos nos genes gdh, bg e orfC4, sendo que, nesses dois últimos, observaram-se sobreposições dos alelos AII e B no produto sequenciado (heterozigose inter assemblage). Os produtos de PCR foram clonados e as sequencias obtidas revelaram a ocorrência dos dois alelos neste único cisto. Os sítios polimórficos encontrados nas sequencias do gene gdh indicaram heterozigose intra assemblage B. Embora ASH já tenha sido relatada em cistos individualizados de G. duodenalis, estes são os primeiros resultados indicando a presença dos dois alelos, simultaneamente, em um único indivíduo. Esses resultados demonstram fortes evidências que ocorre troca genética entre indivíduos geneticamente distintos de G. duodenalis / Giardia duodenalis is a worldwide distribution enteric protozoan responsible for causing infections in a wide variety of mammals, including humans. Even showing little change in their morphology, isolates can be distinguished, according to the analysis of proteins and DNA polymorphisms in at least eight distinct genetic groups, known assemblages (A - H). Only assemblages A and B have been reported in humans and other mammals. Isolates of assemblage A also can be divided into four sub-assemblages (AI, AII, AIII and AIV). Heterogeneous sequences have been frequently identified in studies involving molecular characterization of samples containing multiple cysts of the parasite. Seeking to study the occurrence of allelic sequence heterozygosity (ASH) and genetic recombination events, the present study aimed to isolate G. duodenalis cysts employing the micromanipulation technique and characterize them molecularly through multilocus analysis involving gdh, tpi, orfC4 and bg genes. Ten cysts were individualized and used in the research. All cysts were equally identified for all genes; nine cysts were characterized as assemblage AII and one characterized as assemblage B. The chromatograms derived from the cyst identified as assemblage B presented many heterogeneous sites in gdh, bg and orfC4 genes, and in these last two, there were overlaps of alleles AII and B in the sequenced product (heterozygous inter assemblage). PCR products were cloned and the sequences obtained revealed the occurrence of two alleles at this single cyst. The polymorphic sites found in the sequences of the gdh gene indicated intra heterozygosity assemblage B. Although ASH has already been reported in G. duodenalis individualized cysts, these are the first results indicating the presence of two alleles simultaneously in a single individual. These results demonstrate strong evidence that genetic exchange occurs between individuals genetically distinct of G. duodenalis

A leptospirose é uma doença endêmica causada por Leptospiras. O genoma da Leptospira interrogans sorovar Copenhageni foi analisado para seleção de potenciais antígenos vacinais. Oito genes foram selecionados e clonados para expressão e purificação dos antígenos. A salmonela SL3261 foi usada como carregadora dos genes de leptospira em vetor pAEsox para expressão das proteínas in vivo. As salmonelas recombinantes induziram resposta imune quando administradas em camundongos por via intraperitoneal. Hamsters foram imunizados com as salmonelas, observando-se que a SLLIC10191 induziu proteção parcial no desafio com L. interrogans sorovar Pomona. Vetores híbridos foram construídos para expressão simultânea de dois antígenos em salmonelas in vivo. Observamos indução de anticorpos específicos, porém, os ensaios de desafio não foram conclusivos. Vários parâmetros do desafio com sorovar Copenhageni foram estudados, como contagem das bactérias e ajuste de dose, variação de virulência por passagens em cultivo e interferência da idade dos animais. / Leptospirosis is an endemic disease caused by Leptospira. The genome of Leptospira interrogans serovar Copenhageni was analyzed for screening potential vaccine antigens. Eight genes were selected and cloned for expression and purification. Salmonella SL3261 was used as carrier of the genes of leptospira in pAEsox vector for in vivo proteins expression of proteins in vivo. Recombinant Salmonella induced immune response when administered intraperitoneally in mice intraperitoneally. Hamsters were immunized with salmonella, resulting we observed that the SLLIC10191 induced partial protection against on challenge with L. interrogans serovar Pomona. Hybrid vectors were constructed for expression of two antigens simultaneously by salmonella in vivo. We observed induction of specific antibodies, however, the challenge tests were not conclusive. Several parameters of the challenge assay with serovar Copenhageni were studied, such as the counting of bacteria count and dose adjustment, changes in virulence by passages in culture and interference backgroundof from the age of animals.

Abstract not available

Thesis (Ph. D.)--West Virginia University, 2001. / Title from document title page. Document formatted into pages; contains viii, 174 p. : ill. Vita. Includes abstract. Includes bibliographical references.

Thesis (Ph. D.)--University of Chicago, Department of Organismal Biology and Anatomy, June 2001. / Includes bibliographical references. Also available on the Internet.