Das humane LIN-9 wurde zuerst als pRB-interagierendes Protein beschrieben und spielt eine Rolle als Tumorsuppressor im Kontext des pRB-Signalweges. Über die molekulare Funktion von LIN-9 ist jedoch wenig bekannt. Die Homologe von LIN-9 in D. melanogaster und in C. elegans, sind an der transkriptionellen Regulation verschiedener Genen beteiligt. Dies und die Tatsache, dass LIN-9 mit pRB in der Aktivierung differenzierungspezifischer Gene kooperiert, ließ vermuten, dass humanes LIN-9 einen bedeutenden Einfluss auf die transkriptionelle Regulation von Genen haben könnte. Primäres Ziel dieser Arbeit war daher die Identifizierung LIN-9 regulierter Gene. Dazu sollte mit Hilfe von cDNA-Microarray Analysen, das Genexpressionsprofil LIN-9 depletierter primärer humaner Fibroblasten (BJ ET Zellen) im Vergleich zu Kontrollzellen untersucht werden. Hierfür wurde zunächst ein RNAi-basierendes System etabliert, um die posttranskriptionelle Expression von LIN-9 in BJ-ET Zellen effizient zu reprimieren. Auf dem Ergebnis der cDNA-Microarray Analysen aufbauende Untersuchungen sollten Aufschluss über die molekularbiologische Funktion von LIN-9 geben. In dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass der Verlust von LIN-9 zu einer verminderten Expression einer Gruppe G2/M-spezifischer Gene führt, deren Produkte für den Eintritt in die Mitose benötigt werden. Bekannt war, dass ein Teil dieser Gene durch den Transkriptionsfaktor B-MYB koreguliert wird. Zudem konnten Untersuchungen in unserem Labor eine Interaktion von LIN-9 und B-MYB auf Proteinebene, sowie die Bindung beider Proteine an die Promotoren der LIN-9 regulierten G2/M-Gene nachweisen. Dies lässt vermuten, dass LIN-9 und B-MYB gemeinsam die Expression der G2/M-Gene kontrollieren. Die verminderte Expression von G2/M-Genen in LIN-9 bzw. B-MYB depletierten Zellen geht mit einer Reihe phänotypischer Veränderungen einher, wie einer deutlich verlangsamten Proliferation und einer Akkumulation der Zellen in der G2/M-Phase. Mit Hilfe eines Durchflusszytometers erstellte Zellzykluskinetiken ergaben, dass die Progression LIN-9 bzw. B-MYB depletierter Fibroblasten von der S-Phase durch die G2/M-Phase und in die nächste G1-Phase deutlich verzögert ist. Es konnte weder ein Arrest dieser Zellen in der Mitose noch eine veränderte Länge der S-Phase nach LIN-9 oder B-MYB Depletion festgestellt werden. Daher ist die verlangsamte Zellzyklusprogression nach LIN-9 bzw. B-MYB Verlust höchstwahrscheinlich auf einen Defekt in der späten G2-Phase zurückzuführen, welcher in einem verzögerten Eintritt in die Mitose resultiert. In D. melanogaster und in C. elegans sind die Homologe von LIN-9 und B-MYB zusammen, als Bestandteile hoch konservierter RB/E2F-Komplexe, an der Regulation von Genen entscheidend beteiligt. Daher liegt es nahe, dass im humanen System LIN-9 und B MYB ebenfalls Bestandteile eines ähnlichen Komplexes sind und dadurch die Aktivierung der LIN 9 abhängigen G2/M-Gene vermitteln. Die Tatsache, dass LIN-9 sowohl als Tumorsuppressor, als auch als positiver Regulator des Zellzyklus fungiert, lässt vermuten, dass LIN-9 zu einer stetig größer werdenden Gruppe von Proteinen gehört, welche in Abhängigkeit vom zellulären und genetischen Kontext sowohl tumorsuppressive als auch onkogene Funktionen besitzen. / The human LIN-9 Protein was first identified as a novel pRB-interacting Protein which acts as a tumorsuppressor in context of the pRB-pathway. But the molecular function of LIN-9 is poorly unterstood. The homologs of LIN-9 in D. melanogaster and C. elegans are required for the transcriptional regulation of different genes. This and the fact, that LIN 9 cooperates with pRB in the activation of differentiation specific genes let to the hypothesis, that human LIN-9 could play an important role in the transcriptional regulation of genes. Thus, the primary goal of this thesis was to identify genes which are regulated by LIN-9. For that purpose, the genexpression profiles of LIN-9 depelted primary human fibroblasts (BJ ET cells) in comparison to control cells should be analyzed by a cDNA-microarray approach. Therefor an RNAi-based system was established, that efficiently represses the posttranscriptional expression of LIN-9 in BJ-ET cells. Based on the outcome of the cDNA microarray analysis, further studies should provide more informations about the molecular function of LIN-9. It was possible to show, that the loss of LIN-9 leads to a reduced expression of a cluster of G2/M-specific genes, whose products are required for timely entry into mitosis. It was known, that some of these genes are coregulated by the transcriptionfactor B-MYB. Moreover, studies in our lab account for the interaction of LIN-9 and B-MYB on protein level and the binding of both proteins to the promotors of LIN-9 regulated G2/M-genes. The reduced expression of these genes is accompanied by phenotypically changes, such as strongly impaired proliferation and an accumulation of these cells in the G2/M-Phase. Cell cycle kinetics generated by flowcytometry revealed that the progression of LIN-9 or B MYB depleted cells from S-phase to G2/M-phase and into the next G1-Phase is significantly delayed. Depletion of LIN-9 or B-MYB results neither in an arrest in mitosis nor in a significantly changed S-phase length of these cells. This indicates that the slowed progression is most likely due to a defect in the late G2-phase, which results in a delayed entry into mitosis. The homologs of LIN-9 and B-MYB in D. melanogaster and C. elegans act together as subunits of highly conserved RB/E2F-complexes in the regulation of genes. This let to the suggestion, that LIN-9 and B-MYB are also components of a similar complex in humans and thereby mediate the activation of LIN-9 regulated G2/M-genes. Because LIN-9 acts as a tumorsuppressor in the pRB-pathway as well as an positive regulator of the cell cycle, it seems that LIN-9 belongs to an increasing group of proteins, which function as context dependent tumorsuppressors and oncogenes.

Listeria monocytogenes ist ein weit verbreitetes, Gram-positives humanpatho-genes Bakterium, welches in immunsupprimierten Personen das Krankheitsbild der Listeriose auslösen kann. Der Infektionszyklus der Listerien im Wirt ist im Hinblick auf die Pathogenese dieses Erregers intensiv untersucht worden. Die Regulation der verschiedenen beteiligten Virulenzfaktoren unterliegt in L. monocytogenes einer starken Kontrolle, die einerseits durch regulatorische Proteine aber auch durch Umweltfaktoren beeinflusst wird. Die Mechanismen, die auf transkriptionaler wie auch auf translationaler Ebene die Expression verschiedener listerieller Virulenzgene regulieren, wurden kürzlich näher charakterisiert. Es wurden für verschiedene listerielle Virulenzgene Riboswitch-mechanismen zur Expressionskontrolle in Listerien neu beschrieben. Durch Vorarbeiten wurde auch für das inlAB-Operon ein posttranskriptionaler Regu-lationsmechanismus postuliert. Dabei wurde der anaerobe Stoffwechsel der Listerien als möglicher Auslöser für die beobachtete Translationssteigerung des inlA- und inlB-Gens diskutiert. Innerhalb der vorliegenden Arbeit sollte nun weitergehend untersucht werden, in welchem Bereich der Sequenz des inlAB-Operons sich regulatorische Strukturen zur posttranskriptionalen Regulation unter anaeroben Wachstumsbedingungen befinden. Dazu wurden verschiedene Mutanten mit unterschiedlichen Deletionen im inlAB-Operon konstruiert und die Transkription und Translation sowohl des inlA-, als auch des inlB-Gens betrachtet. Eine Deletion im aroA-Gen bewirkt das Wachstum der Bakterien bei anaerobem Stoffwechsel. Diese Deletion wurde in die konstruierten Stämme eingefügt, um die Expression der Gene unter den verschiedenen Wachstumsbedingungen vergleichen zu können. Außerdem wurden verschiedene gus-Reportergen-Fusionsmutanten und Promotor-austauschmutanten konstruiert, um quantitativ aussagekräftigere Daten zu erheben. Die Charakterisierung der Mutanten ließ erkennen, dass keiner der deletierten Bereiche des inlAB-Operons von L. monocytogenes für die beobachtete Translationssteigerung im inlA-Gen bei anaerobem Stoffwechsel verantwortlich zu sein scheint. Das inlB-Gen war innerhalb der hier gezeigten Experimente nicht posttranskriptional reguliert, wie im Vorfeld postuliert. Nach plasmidkodierter Expression verschiedener Bereiche des inlAB-Operons konnte, verglichen mit genomischer Expression, keine Veränderung in der inlA-Expression beobachtet werden. Die mögliche Beteiligung eines potentiellen Regulatorproteins konnte innerhalb dieser Arbeit daher nicht näher eingegrenzt werden. Auch ein Einfluss der regulatorischen Faktoren Hfq und CcpA auf die Expression des InlA Proteins in der L. monocytogenes ΔaroA-Mutante konnte nicht gefunden werden. Es zeigte sich interessanterweise außerdem, dass weitere Virulenzgene wie actA und hly unter den anaeroben Bedingungen ebenfalls eine Translations-steigerung zeigten. Somit stellt sich abschließend die Frage, ob es sich bei der beobachteten Translationssteigerung des inlA-Gens wirklich um einen durch bestimmte Strukturen in der inlAB-mRNA ausgelösten Mechanismus handelt. L. monocytogenes ist als intrazellulär replizierendes, Gram-positives Bakterium interessant für den Einsatz in immun- und tumortherapeutischen Anwendungen. Attenuierte L. monocytogenes-Stämme wurden dazu bereits erfolgreich im Mausmodell als Trägerbakterien für Impfstoffstrategien eingesetzt. Die gezielte Infektion von Geweben ist jedoch aufgrund des wenig ausgeprägten Zelltropismus der Listerien im Wirt bisher ein Problem für einen Einsatz in bakterienbasierten Anwendungen, wie z.B. der Tumor- oder Gentherapie. Innerhalb dieser Arbeit wurden L. monocytogenes-Stämme konstruiert, bei denen chromosomal das für die Integrase codierende Gen gegen das Gen für das Staphylokokken Protein A (SPA) unter der Kontrolle listerieller Promotoren ausgetauscht wurde. Die erfolgreiche Oberflächenlokalisation von Protein A in der Zellwand von Listerien konnte im Western Blot oder in funktionellen Immunfluoreszenzfärbungen in Mikroskop- und FACS-Analysen nachgewiesen werden. Diese Stämme sollen im Cell Targeting zur gezielten Infektion von Geweben eingesetzt werden. Dazu konnten die Bakterien über Herceptin®-HER2/neu-vermittelte Adhäsion an SK-BR-3-Zellen erfolgreich in diese aufgenommen werden und innerhalb dieser replizieren. Die neu konstruierten Listeria-Stämme zeigten im Mausmodell keine Veränderung in ihrer Virulenz verglichen mit nicht-SPA-exprimierenden Stämmen. Die in dieser Arbeit vorgestellte Antikörper-Rezeptor-vermittlelte Aufnahme der Listerien in Zellen stellt einen neuen, bisher nicht beschriebenen Mechanismus dar, der in vielen therapeutischen Anwendungen zur Infektion spezifischer Gewebe durch Listerien genutzt werden kann. / Listeria monocytogenes is a widely distributed gram-positive pathogenic bacterium, that causes the disease listeriosis in immunocompromised persons. The infectious cycle of this pathogen has been well investigated concerning the mechanisms of pathogenesis. The regulation of the involved virulence factors underlie strong control mechanisms both by regulatory proteins and environmental conditions. The mechanisms that control the expression of listerial virulence genes on the transcriptional and translational level have recently been characterized more closely. For some of these virulence factors, regulatory posttranscriptional riboswitch control mechanisms have recently been newly described in Listeria. In studies prior to this work, a posttranscriptional regulation mechanism has been postulated for the inlAB-Operon, also. As a trigger for the enhanced translation of the inlA and inlB gene the anaerobic metabolism of Listeria has been discussed. In the here presented work, it should be further investigated which part of the inlAB operon comprises regulatory structures for the posttranscriptional regulation at anaerobic growth conditions. To this purpose, different mutants with varying deletions in the inlAB operon have been constructed and transcription and translation of both the inlA and inlB genes observed. A deletion in the aroA gene provokes growth of the bacteria at anaerobic metabolism. This deletion was introduced in the newly constructed strains to be able to compare the different growth conditions. Additionally, gus-reportergene fusion as well as promoter exchange mutants were constructed to be able to raise quantitatively significant data. The characterization of the deletion mutants showed that none of the introduced deletions in the inlAB operon seems to be responsible for the enhanced expression of inlA in anaerobically growing Listeriae. In the here presented experiments, the inlB-gene was not found to be posttranscriptionally regulated, in accordance with a previous report. The plasmid encoded expression of different parts of the inlAB operon did not lead to an alteration in the inlA expression compared to genomically encoded inlA. The possible interaction of a potential regulator protein could thus not be further elucidated. Also, the engagement of the regulators like Hfq or CcpA could not be found. Interestingly, also the virulence genes actA and hly showed an enhanced translational efficiency under the given conditions. Thus, in the herein presented work, the question is raised, whether the observed translation enhancement of the inlA gene is really due to regulatory structures within the inlAB-mRNA. As an intracellularly replicating, Gram positive bacterium, L. monocytogenes is a very interesting means to be used in immuno- or tumortherapeutic applications. Attenuated L. monocytogenes strains have already been successfully applied as carrier strains in vaccine strategies in the mouse model. Due to the distinct cell tropism of Listeriae in the host, the targeted infection of tissue has so far been a problem regarding the use in bacteria-based applications like tumor or gene therapy. In this work, L. monocytogenes strains have been constructed, that contain the chromosomal integrase gene exchanged for the staphylococcal Protein A (SPA) gene under the control of different listerial promoters. The successful translocation and anchoring of SPA in the cell wall was confirmed by either western blot or functionally by immunofluorescence staining using microscopic and FACS analysis. These strains should be used to specifically infect tissues via cell targeting. Through Herceptin®-HER2/neu-mediated adhesion to SK-BR-3 cells the bacteria could be successfully taken up and replicate in these cells. The newly constructed Listeria strains did not show any alteration in virulence in the mouse model when compared to non-SPA-expressing strains. The herein presented antibody-receptor-mediated uptake of the Listeriae in cells demonstrates a new, so far not described mechanism, that can be used in many therapeutic applications involving the infection of specific tissues by Listerae.

Bakterien sind in der Lage, sich schnell an wechselnde Umweltbedingungen anzupassen. Eine wichtige Rolle bei der Wahrnehmung von verschiedensten Umweltreizen und der zellulären Antwort spielt die Genregulation durch Zweikomponenten-Systeme. Gut charakterisiert ist das ArsRS Zweikomomponenten-System in H. pylori, welches an der Ausbildung der Säureresistenz beteiligt ist und dem Bakterium so die Kolonisierung der Magenschleimhaut ermöglicht. Die Histidin-Kinase ArsS wird in Gegenwart von Säure aktiviert und phosphoryliert den Response-Regulator ArsR, der die Transkription von Target-Genen reguliert. In der periplasmatischen Sensordomäne der Histidin-Kinase ArsS sind sieben Histidinreste vorhanden, die aufgrund ihres pKa-Wertes von 6,0 bei Absenken des pH Wertes von pH 7 auf pH 5, was eine Aktivierung der Histidin-Kinase zur Folge hat, protoniert werden könnten. Es konnte gezeigt werden, dass der Histidinrest H94 der periplasmatischen Sensordomäne einen wesentliche Rolle bei der Säurewahrnehmung durch die Histidin-Kinase ArsS spielt. Die Einführung einer positiv geladenen AS an dieser Position allein reicht jedoch nicht aus, um die Kinase zu aktivieren, weshalb unklar bleibt, ob eine Protonierung des Histidinrestes H94 in vivo die Säurewahrnehmung vermittelt. Weiterhin konnten Indizien darauf erhalten werden, dass neben dem Histidinrest H94 noch weitere Aminosäuren an der Säurewahrnehmung durch die Histidin-Kinase beteiligt sind. Der Aspartatrest D124 leistet unter den negativ geladenen AS vermutlich den größten Beitrag zur Säurewahrnehmung. In den mit H. pylori nahe verwandten Arten Helicobacter hepaticus, Wolinella succinogenes und Campylobacter jejuni sind Orthologe zu dem ArsRS Zweikomponenten-System vorhanden. Um zu untersuchen, ob es sich bei der Säurewahrnehmung durch die Histidin-Kinase ArsS um eine spezifische Anpassung von H. pylori an sein Habitat handelt oder ob Säure einen allgemeinen Stimulus der ArsS-orthologen Kinasen darstellt, wurden Mutanten im genetischen Hintergrund von H. pylori G27 konstruiert, in welchen die Histidin-Kinase ArsS durch die orthologen Kinasen HH1608, CJ1262 und WS1818 substituiert wurde. Durch Transkriptionsstudien konnte gezeigt werden, dass die Kinase WS1818 eine gesteigerte Aktivität bei saurem pH-Wert aufweist. Auch die Kinase HH1607 kann Säure als einen Umweltreiz wahrnehmen, jedoch deutlich weniger effektiv als die Kinasen ArsS und WS1818. Ob die Zweikomponenten-Systeme HH1608/HH1607 und WS1817/WS1818 in vivo in H. hepaticus und W. succinogenes an der Wahrnehmung von Säure und evtl. an der Ausbildung einer Säureresistenz beteiligt sind, ist unklar, da über die Funktion dieser Zweikomponenten-Systeme bisher nichts bekannt ist. Die Kinase CJ1262 ist nicht in der Lage, Säure als einen Umweltreiz wahrzunehmen. Die beiden Response-Regulatoren HP1043 und HP1021 spielen vermutlich eine Rolle bei der Regulation von Genen, deren Produkte eine wichtige Funktion für das vegetative Zellwachstum haben. Die Aktivität der beiden RR wird entgegen dem gängigen Zweikomponenten-System-Paradigma nicht über eine Phosphorylierung moduliert. In der vorliegenden Arbeit wurde analysiert, ob eine strikte Expressionskontrolle für die wachstumsassoziierten Funktion dieser Response-Regulatoren von Bedeutung ist. Zu diesem Zweck wurden verschieden Mutanten konstruiert, in welchen die Transkription der Gene hp1021 und hp1043 unter der Kontrolle von unterschiedlich regulierten Promotoren stattfindet. Es konnte gezeigt werden, dass die Expression des Gens hp1043 sowohl transkriptionell als auch posttranskriptionell und/oder posttranslational strikt reguliert wird. Es kann deshalb postuliert werden, dass die Aktivität des RR HP1043 über die vorhandene Konzentration an Regulator in der Bakterienzelle beeinflusst wird. Die Expression des Gens hp1021 wird nicht strikt reguliert. Auf welche Weise die Aktivität des RR HP1021 moduliert wird, bleibt unklar. / Bacteria are able to adapt rapidly to alternating environmental conditions. Two component systems play a predominant role in sensing environmental stimuli and triggering a proper cellular response. The genome of Helicobacter pylori harbours only a few genes encoding for two component system proteins. The ArsRS two component system of H. pylori which controls the acid response and therefore is required for colonization of the mucus is well characterized. The kinase ArsS is activated under acidic conditions and phosphorylates the response regulator ArsR resulting in activation or repression of transcription of ArsRS-dependent target genes. The acid response of H. pylori is triggered when the pH drops from 7 to 5. Therefore, due to their side chain pKa-value of 6 seven histidine residues in the periplasmic sensor domain of the kinase ArsS were hypothesized to be involved in acid sensing. It was shown that the histidine residiue H94 is involved in the acid sensing by the histidine kinase ArsS. Substitution of H94 by the positively charged amino acid arginine did not result in a constitutively active ArsS protein. Therefore it remains unclear whether H94 contributes to the acid-sensing via protonation. Furthermore it was speculated that apart from histidine H94 other other amino acids contribute to the acid sensing of ArsS. Amongst them the aspartic acid residue D126 seems to play a predominant role. The closely related epsilon-proteobacteria Helicobacter hepaticus, Wolinella succinogenes and Campylobacter jejuni express ArsRS orthologs. Mutants of H. pylori G27 expressing the orthologous hisitine kinases WS1818, HH1607, and CJ1262 instead of the ArsS protein where constructed to investigate whether acidic pH is a common stimulus sensed by ArsS orthologs. Transcriptional analysis of the mutants revealed that the kinase WS1818 is activated under acidic conditions. The histidine kinase HH1607 also responds to acid as an environmental signal though less efficient than ArsS and WS1818. Since nothing is known about the function of the kinases HH1607 and WS1818 it remains unclear whether these proteins contribute to acid sensing and mounte an acid response in vivo in W. succinogenes and H. hepaticus. The kinase CJ1262 is not activated under acidic conditions. The response regulators HP1021 and HP1043 presumably play a role in the regulation of genes whose protein products have a fundamental function in vegetative cell growth. In contrast to the well established two component system paradigm their activity is not modulated via phosphorylation. In this work it was analyzed whether a strict control of their expression is required for the growth associated function of the respective response regulators. For this purpose several mutants were constructed in which the transcription of the genes hp1021 and hp1043 was placed under the control of different promoters. It was demonstrated that the expression of the gene hp1043 is controlled both on the transcriptional and posttranscriptional and/or posttranslational level and that this expression control is important for response regulator function. In contrast, strict expression control is not a prerequisite for the function of response regulator HP1021.

Hintergurnd: Erhöhte glomeruläre Filtration von Proteinen im Rahmen chronoischer Nierenenerkrankungen geht mit tubulointerstitiellem Schaden einschließlich Entzündung und fortschreitendem Funktionsverlust der Nierenfunktion einher. Proteine wie Albumin scheinen dabei per se eine pathogenetische Rolle zu spielen. Der Transkriptionsfaktor nuclear factor kappa B (NF-kB) scheint an den durch Proteinüberladung verursachten Pathomechanismen der Nierenentzündung beteiligt zu sein. Um die Albumin-induzierte Expression von NF-kB sowie die Expression des NF-kB-regulierten proinflammatorischen Zytokins Tumor Necrosis Faktor alpha (TNF-a) nach Exposition mit Albumin in humanen proximalen Tubuluszellen zu überprüfen, exponierten wir humane, von proximalen Tubuluszellen abstammende Zellen (IHKE-1) mit bovinem Serumalbumin (BSA: 50 und 500 microg/ml). Die NF-KB- und TNF-a-spezifische mRNA-Expression wurde durch RT-PCR bestimmt. NF-kB-spezifische Proteinexpression wurde mit Western-Blot-Verfahren analysiert. Ergebnisse: Albumin-induziert einen Anstieg der NF-kB-spezifischen mRNA-Expression und NF-kB-spezifischen Proteinexpression. Diese Effekte werden durch den Protein Kinase C-Inhibitor Bisindolylmaleimid und den Tyrosin Kinase Inhibitor Herbimycin A gehemmt. Ein Albumin.induzierter Anstieg der TNF-a-spezifischen mRNA-Expression als biologischer inflammatorischer Parameter war als mit der NF-B-Aktivität assoziiert messbar. / Background: Enhanced glomerular filtration of proteins in the setting of chronic renal diseases is accopmpagnied by tubulointerstitial damage including inflammation and renal function deterioration. Proteins such as albumin seem to be a pathogenetic factor per se in this setting. The nuclear transcription factor kappa B (NF-KB) seems to be involved in protein-overload stimulated renal inflammatory pathomechanisms. To investigate albumin-induced NF-kappaB expression as well as the expression of the NF-KB-regulated pro-inflammatory cytokine Tumor necrosis factor alpha (TNF-a) upon exposure to albumin in human proximal tubular cells, we exposed human renal proximal tubule-derived cells (IHKE-1) to bovine serum albumin (BSA: 50 and 500 microg/ml). The NF-KB and TNF-alpha specific mRNA expression was detected by RT-PCR. NF-kappaB specific protein expression was analysed by Western blot. RESULTS: Albumin-exposure induced an increase in NF-kappaB specific mRNA expression and NF-kappaB protein expression. These effects are decreased by the protein kinase C (PKC) inhibitor bisindolylmaleimide I (BIM) and the tyrosine kinase inhibitor herbimycin A. An albumin-induced increase in TNF-alpha specific mRNA expression as biological, inflammatory parameter associated with the albumin-induced NF-kappaB activity was detectable.

Fanconi Anämie (FA) ist eine autosomal rezessive, im Falle der Untergruppe FA-B X-chromosomale Erbkrankheit, die mit chromosomaler und genomischer Instabilität verbunden ist und sich durch große phänotypische und genetische Heterogenität auszeichnet. Symptomatisch sind Knochenmarksversagen, eine Vielfalt angeborener Fehlbildungen, die weit überdurchschnittliche Disposition für akute myeloische Leukämie (AML), Plattenepithelkarzinome (SCC) sowie eine zelluläre Hypersensitivität gegenüber DNA Doppelstrangvernetzenden Substanzen. FA wird kompliziert durch ein progressives Knochenmarksversagen. Die FA Proteine sind essentiell für die interstrand crosslink (ICL) repair sowie an anderen DNA Reparatursystemen, beteiligt. Bisher wurden hauptsächlich Regulationsmechanismen untersucht, die die FA Proteine betreffen. Die Regulation der Transkripte war bisher nahezu unbekannt. In der vorliegenden Arbeit wurde die transkriptionelle Regulation der sogenannten FA core complex Gene untersucht. Dabei handelt es sich um acht Gene, deren Produkte im Falle eines DNA Schadens den ersten Proteinkomplex des FA/BRCA Signalweges bilden. Für diese acht Gene wurden in dieser Arbeit die Promotoren identifiziert und ihr Aktivierungspotential charakterisiert. Dabei stellte sich heraus, dass diese ein starkes Potential für die Transkriptionsinitiierung besitzen. Des Weiteren zeigten sich Gemeinsamkeiten in Form von Sequenzmotiven sowie Transkriptionsfaktorbindestellen, die in allen core complex Genen nahezu identisch waren. Durch diese Analysen ergaben sich Hinweise, dass die untersuchten Gene durch Mitglieder des JAK/ STAT (STAT1/4) sowie des TGF-b Signalwegs (SMAD1/4) reguliert werden. Funktionelle Untersuchungen mittels siRNA sowie Fibroblastenzelllinen, die biallelische FANCA Mutationen trugen, bestätigten diese Verbindungen. So hatte der knockdown der entsprechenden Transkriptionsfaktoren einen reduzierenden Einfluss auf die Transkriptmenge der core complex Gene. FANCA-mutierte Zelllinen weisen reduzierte mRNAs von STAT und SMAD auf. Darüber hinaus fanden sich signifikante Änderungen der Transkriptmenge in 112 verschiedenen Mitgliedern dieser Signalwege in den FA-A Zellinien. Eines dieser Mitglieder, IRF1, zeigte fast identische Ergebnisse wie sie bei STAT1/4 sowie SMAD1/4 beobachtet werden konnten. Die vorliegende Arbeit trägt dazu bei, die transkriptionelle Regulation der core complex Gene besser zu verstehen. Die auffälligen Gemeinsamkeiten ihrer Regulation liefern neue Argumente für eine Koevolution dieser Gene. / Fanconi anemia (FA) is an autosomal recessive, in the case of subgroup B X-linked, disease that is characterized by chromosomal and genomic instability. FA reveals remarkable phenotypic and genetic heterogeneity. Clinical symptoms include the variable presence of typical congenital malformations, progressive bone marrow failure, and a pronounced predisposition for the occurrence of malignancies such as acute myelogenous leukemia (AML) and squamous cell carcinoma (SCC). The FA proteins are essential for the repair of DNA-interstrand crosslinks and are members of the DNA damage response network. This is why FA cells are hypersensitive to agents inducing doublestrand lesions. In the past, a major topic of research was the interaction of the FA proteins. In this thesis work, transcriptional regulation of the FA core complex genes was investigated. These genes include eight members that form, in response to DNA damage, the first protein complex acting in the FA/BRCA pathway. As part of this thesis, the promoters of the FA core complex genes were identified, and their potential for transcriptional activation was studied. All of them revealed strong power for transcriptional activation. There were marked similarities among them including the presence of two shared sequence motifs, of transcription factor binding sites and in the presence of repressor elements defining them as bipartite in their nature. These analyses provided clues that these genes are regulated, in part, by components of theJAK/ STAT (STAT1/4) and the TGF-ß signaling pathways. Functional studies including knockdown experiments or using fibroblast lines with biallelic mutations in FANCA confirmed these connections. Down-regulation of the designated transcription factors decreased the transcript levels of the FA core complex genes. Likewise, FANCA-mutant cell lines showed reduced amounts of mRNA of STAT and SMAD. Moreover, there were significant changes in the expression of 112 members of the corresponding signaling pathways in FA-A cell lines. The present work contributes to a better overall understanding of the transcriptional regulation of the FA core complex genes. Shared similarities provide arguments in favor of a co-evolution of these genes.

Ein Weg, der von Rezeptor-Tyrosin-Kinasen benutzt wird um Signale auf "downstream" gelegene Effektormoleküle zu übertragen, erfolgt über Adaptorproteine, die Bindungsstellen für verschiedene Proteine zur Verfügung stellen. Das daughter of sevenless (dos) Gen wurde in einem Screen nach Downstream-Komponenten der Sevenless (Sev) Rezeptor-Tyrosin-Kinase gefunden. Dos besitzt eine N-terminale PH-Domäne und mehrere Tyrosinreste in Konsensussequenzen für SH2-Domänen Bindungsstellen von verschiedenen Proteinen. Die strukturellen Merkmale von Dos und Experimente, die zeigten, daß Tyrosine im Dos Protein nach der Aktivierung von Sev phosphoryliert werden, legen den Schluß nahe, daß Dos zur Familie der Multi-Adaptor-Proteine gehört. Zu dieser Familie werden die Insulin-Rezeptor-Substrat (IRS) Proteine, Gab1 und Gab2 gerechnet. In dieser Arbeit wurde ein monoklonaler Maus anti-Dos Antikörper etabliert. Das Epitop dieses Antikörpers liegt im Bereich der C-terminalen 416 Aminosäuren des Dos Proteins. Mittels Westernblot Analysen wurde für Dos ein Molekulargewicht von 115 kD ermittelt. Antikörperfärbungen von wildtypischen Augenimaginalscheiben dritter Larven zeigten, daß das Dos Protein in Zellen in und posterior der morphogenetischen Furche exprimiert wird und in diesen Zellen apikal lokalisiert ist. Zur Charakterisierung des homozygot letalen dosR31 Allels, wurde der genomische Bereich sequenziert und die erhaltenen Daten mit der cDNA Sequenz verglichen. Die so etablierte Aminosäuresequenz für das DosR31 Protein hat sechs Aminosäuresubstitutionen, die möglicherweise die Tertiärstruktur beeinflussen. Zusätzlich wurde ein Stopcodon in Position 463 der Aminosäuresequenz gefunden. Bei dosR31 handelt es sich um ein "loss of function" Allel, das nicht in der Lage ist, die normale Dos Funktion zu erfüllen. Um die funktionelle Rolle der potentiellen SH2-Domänen Bindungsstellen für die Dos Funktion in der Rezeptor-Tyrosin-Kinasen vermittelten Signaltransduktion zu untersuchen, wurden mutierte dos Transgene in Fliegen exprimiert. Die potentiellen Bindungsstellen für die SH2-Domänen des SH2/SH3 Adaptorproteins Shc, der PhospholipaseC-g (PLCg), der regulatorische Untereinheit der Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3Kinase) und der Corkscrew (Csw) Tyrosin Phosphatase wurden durch den Austausch des für die Bindung wichtigen Tyrosins gegen ein Phenylalanin mutiert. Die ektopische Expression der mutierten Konstrukte ohne Bindungsstellen für die Shc, PLCg und PI3Kinasen SH2-Domänen konnte in Abwesenheit von endogenem Dos die fehlende Dos Funktion während der Entwicklung vollständig ersetzen. Im Gegensatz dazu ist das Tyrosin 801 als nachgewiesene Bindungsstelle für Csw SH2-Domänen essentiell für die Funktion von Dos. Ektopische Expression von Transgene durch Hitzeschock kann zu phänotypischen Effekten führen, die nicht auf das Transgen zurückzuführen sind. Um dieses Problem zu umgehen wurde das endogene dos Enhancer/Promotor Element kloniert, damit die Funktion von mutierten Transgenen auch im endogenen Expressionsmuster untersucht werden konnte. Das klonierte genE-dos Minigen war in der Lage, den Verlust von endogenem Dos in dosR31 und dosP115 Tieren vollständig zu ersetzen und zeigte eine völlig wildtypische Expression in Augenimaginalscheiben. Zur Untersuchung, welche Rolle die mutierten SH2-Domänen Bindungsstellen bei der Dos Funktion in der Augenentwicklung spielen, wurde ein neues in vivo Testsystem basierend auf der Flp/FRT Flipase Rekombinase Technik etabliert. Dieses klonale Testsystem erlaubt die Expression mutierter Transgene unter der Kontrolle der dos Enhancer/Promotor Sequenzen in Klonen von Zellen, denen die endogene Dos Funktion fehlt. Die klonale Analyse der mutierten Konstrukte konnte zeigen, daß das Tyrosin 801, als Bindungsstelle für eine Csw SH2-Domäne, eine essentielle Rolle für die Dos Funktion spielt. Die Tyrosinreste in den potentiellen SH2-Domänen Bindungsstellen für Shc, PLCg und PI3Kinase spielen hingegen keine essentielle Rolle für die Dos Funktion bei der Augenentwicklung. Das etablierte klonale Testsystem kann allgemein zur Untersuchung der in vivo Funktion von potentiellen Protein-Protein Interaktionsregionen im Dos Protein bei der Augenentwicklung eingesetzt werden unabhängig von deren Erfordernis für andere Entwicklungsprozesse. / One mechanism used by receptor tyrosine kinases to relay a signal to different downstream effector molecules is to use adaptor proteins that provide docking sites for a variety of proteins. The daughter of sevenless (dos) gene was isolated in a genetic screen for components acting downstream of the Sevenless (Sev) receptor tyrosine kinase. Dos contains a N-terminally located PH domain and several tyrosine residues within consensus binding sites for a number of SH2 domain containing proteins. The structural features of Dos and experiments demonstrating tyrosine phosphorylation of Dos upon Sev activation suggested that Dos belongs to the family of multisite adaptor proteins that include the Insulin Receptor Substrate (IRS) proteins, Gab1, and Gab2. In this work, a monoclonal mouse anti-Dos antibody was generated. The epitope of this antibody lies within the C-terminal 416 amino acids of the Dos Protein. Western Blot analyses of the Dos protein revealed a molecular mass of 115 kD. The staining of eye imaginal discs from wildtype third instar larvae with the monoclonal antibody showed that the Dos protein is expressed in cells in and posterior to the morphogenetic furrow. In this cells Dos localizes to the apical region. For the molecular characterisation of the homozygous lethal dosR31 allele, genomic sequence analysis were performed and the sequences compared to the dos cDNA sequence. The established amino acid sequence of the DosR31 protein showed six amino acid substitutions that potentially influence the tertiary structure of the protein. In addition, a stop codon in position 463 of the amino acid sequence was found. These results confirm that dosR31 is a loss-of-function allele which does not provide normal Dos function. To study the functional requirements of the potential SH2 domain binding sites for the Dos function in receptor tyrosine kinase mediated signaling processes, mutated dos transgenes were expressed in flies. The putative binding sites for the SH2 domains of the SH2/SH3 adaptor protein Shc, PhospholipaseC-g (PLCg), the regulatory subunit of Phosphatidylinositol-3-kinase (PI3kinase) and the Corkscrew (Csw) tyrosine phosphatase were mutated by changing the invariant tyrosine within the consensus sites into phenylalanine. Ectopic expression of the mutated constructs lacking the binding sites for the Shc, PLCg, and PI3kinase SH2 domains can substitute the loss of endogenous Dos function during development. In contrast, tyrosine 801, corresponding to a Corkscrew (Csw) SH2 domain binding site, is essential for Dos function. Ectopic expression of transgenes upon heat shock induction may lead to phenotypic effects not caused by the transgene. To circumvent this problem, the endogenous dos enhancer/promotor element was cloned to study the function of the mutated transgenes expressed in a wildtype pattern. The cloned genE-dos minigene was able to fully substitute the loss of endogenous Dos function in dosR31 and dosP115 animals and shows wildtype like expression in eye imaginal discs. To study the role of the mutated SH2 domain binding sites for Dos function in eye development, a new in vivo test system based on the Flp/FRT flipase recombinase system was established. This clonal assay system allows the expression of the mutated transgenes under the control of the dos enhancer/promotor in clones of cells lacking endogenous Dos function. Expression of mutated transgenes in clones of cells lacking endogenous Dos function provided evidence that tyrosine residue Y801 that has been shown to bind a Csw SH2 domain is critical for Dos function. The tyrosine residues within the potential SH2 domain binding sites for Shc, PLCg and PI3kinase do not play an essential role for the Dos function during eye development. The established clonal test system is of general use for assaying the in vivo function of putative protein-protein interaction regions within the Dos protein for eye development irrespective of their requirement in other developmental processes.

Die Methodik und Technik der Gaswechselmessung von Pflanzen wurde für den Modellorganismus Arabidopsis thaliana optimiert und für Untersuchungen zur Beteiligung des Aquaporins PIP1b an Wassertransportvorgängen während der Stomaöffnung verwendet. Die Messungen der Transpirationsraten von PIP1b-Antisense-Pflanzen ergaben keine Hinweise auf Veränderungen des zeitlichen Verlaufs der Stomaöffnung. Die Wasserpermeabilitäten von Schließzell-Plasmamembranen scheinen somit nicht von der Expression des Aquaporins PIP1b beeinflußt zu sein. - Gaswechselmessungen an Nicotiana tabacum NtAQP1-Antisense-Pflanzen zeigten eine Verringerung der Transpirationsraten im Licht und eine geringere Grundtranspiration im Dunkeln. Dies deutet auf eine Beteiligung von NtAQP1 am Wassertransport hin. - Ausgewählte Arabidopsis thaliana-Mutanten wurden hinsichtlich ihrer stomatären Antwort auf Rot- und Rot-/Blaulicht-Bestrahlung analysiert. Hierfür wurde ein Doppelbestrahlungs-Protokoll entwickelt. Vergleiche mit den Wildtypen ergaben signifikante Unterschiede bei der Phytochrom-Mutante phyA-103, der Abscisinsäure-Mutante aba3-2 und der Auxin-resistenten Mutante axr1-3. Ferner zeigte die Mutante npq1-2 nicht die beschriebene Abweichung der stomatären Antwort auf Blaulicht. - Die Expressionsmuster eines PIP1b-GFP-Reportergens in transgenen Arabidopsis thaliana-Pflanzen wurden analysiert. Hohe Promotor-Aktivitäten konnten in meristematischen Bereichen von Wurzel und Sproß, in Elementen der Leitbündel, in jungen Kotyledonen und in Staubblättern beobachtet werden. Es zeigte sich eine enge Korrelation zwischen PIP1b-Promotoraktivität und Streckungswachstum. - Eine Sequenzanalyse des NtAQP1-Promotors ergab Übereinstimmungen mit spezifischen Bindungsmotiven von MYB-ähnlichen Transkriptionsfaktoren. Mit Promotor-Reportergenen konnte die Beteiligung eines dieser Sequenzmotive an der GA- und ABA-induzierten Aktivierung des NtAQP1-Promotors gezeigt werden. Zur Analyse der Phytohormon-Wirkungen auf deletierte Promotorbereiche wurde ein duales Vektorsystem entwickelt und bei der transienten Transformation von BY2-Protoplasten eingesetzt. - Die Expression eines GFP::NtAQP1-Fusionsgens in BY2-Zellen zeigte die subzelluläre Lokalisation des Aquaporins in der Zytoplasmamembran. Ferner wurde Fusionsprotein in Vesikel-ähnlichen Strukturen beobachtet. / Gas exchange measurement of plants was optimized for the model organism Arabidopsis thaliana. Consequently, studies on the participation of aquaporin PIP1b in water transport processes became possible. The transpiration rates obtained for PIP1b anti-sense plants revealed no differences in the time course of stomatal opening. Thus, water permeabilities of guard cell plasma membranes seem not to be influenced by the extend of PIP1b expression. - Gas exchange measurement of the Nicotiana tabacum NtAQP1 anti-sense plants showed a reduced transpiration in response to light and a reduced basal transpiration in the dark. This indicates the participation of NtAQP1 in water movement. - Selected Arabidopsis thaliana mutants were analyzed with regard to their stomatal response to red, red/blue light irradiation. For that, a dual beam protocol was developed. A comparison of the mutant lines to the wild-type revealed significant differences for the phytochrome A (phyA-103), the abscisic acid (aba3-2) and the auxin resistent (axr1-3) mutants. Furthermore, the mutant line npq1-2 did not show the abnormal stomatal response to blue light reported previously. - The expression patterns of a PIP1b-GFP-reporter gene in transgenic Arabidopsis thaliana plants were analyzed. High promotor activities were obtained in areas of meristematic tissue in roots and shoot, in vascular elements, in young cotyledons and in stamina. A close correlation between PIP1b-promoter activity and cell elongation was obvious. - Sequence analysis of the NtAQP1 promoter discovered DNA-motifs that correspond to specific binding sites of MYB-related transcriptional activators. By using promotor-reporter constructs, the involvement of one of this motifs in a GA- and ABA-induced increase of NtAQP1-promoter activity could be shown. In order to elucidate the effects of phytohormones on deleted promoter elements a dual vector system has been created, which was employed in the transient transfection of BY2-protoplasts. - The expression of a GFP::NtAQP1 translational fusion in BY2-cells revealed a subcellular location in the cytoplasmic membrane. Furthermore, the protein-fusion was recorded in small vesicle-like structures.

Nach Aktivierung differenzieren B-Zellen entweder direkt zu IgM sezernierenden Plasmazellen oder treten in den Differenzierungsweg zur Gedächtniszelle ein, der sowohl durch die Affinitätsreifung als auch den Klassensprung zu sekundären Immunglobulin-Isotypen gekennzeichnet ist. Welchen Weg die B-Zelle durchläuft, ist abhängig von der Intensität und der Dauer des BZR-Signals, von der Verfügbarkeit und der Art der T-Zell-Hilfe und von weiteren Signalen in der speziellen Mikroumgebung des Keimzentrums. Der Transkriptionsfaktor Blimp-1 ("B lymphocyte induced maturation protein 1") wird als ein „Mastergen“ der terminalen B-Zell-Differenzierung betrachtet und ist in der Lage, die komplexen Differenzierungsprozesse zu Ig-sezernierenden Plasmazellen auszulösen und voranzutreiben. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit identifizieren Blimp-1 als wichtigen Regulator, der bestimmt, ob eine B-Zelle zur Plasmazelle oder zur Gedächtniszelle differenziert. Unter Verwendung ruhender, primärer B-Zellen der Maus, die in vitro mit Interleukin-4 (IL-4), anti-mF(ab´)2 oder anti-CD40 in verschiedenen Kombinationen sowohl in An- als auch in Abwesenheit von LPS stimuliert wurden, konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass die IgM-Sekretion und die Expression von Blimp-1 durch Signalgebung über den BZR oder CD40 und durch IL-4 entweder nicht induziert oder sogar unterdrückt wird. Die Zugabe von IL-2 und IL-5 induziert die Expression von Blimp-1 und erleichtert die Sekretion von IgM und IgG1 in diesem System. Gleiches kann durch direkte Transduktion der B-Zellen mit rekombinanten Retroviren erreicht werden, die für Blimp-1 codieren. Auf der anderen Seite wird der durch IL-4 induzierte Klassensprung nach IgG1 durch Blimp-1 gehemmt. Blimp-1 bewirkt daher ein Umschalten des B-Zell-Differenzierungsweges von der Gedächtniszelle zur Plasmazelle. Die Unterdrückung der Expression von Blimp-1 sowohl durch Antigen-BZR-Wechselwirkungen als auch durch die von T-Helferzellen abhängige Signalgebung über CD40 und IL-4 unterdrückt die terminale Differenzierung zur Plasmazelle und ist für den Eintritt und das Durchlaufen des Gedächtniszell-Differenzierungsweges notwendig. Zur Identifikation von Genen, deren Expression durch Blimp-1 direkt oder indirekt beeinflusst wird, wurde Blimp-1 in WEHI 231 B-Lymphomzellen unter Verwendung rekombinanter Retroviren überexprimiert. Messika et al. zeigten, dass die Überexpression von Blimp-1 in B-Lymphomzellen in Abhängigkeit vom Reifungsstadium der Zelle entweder einen Wachstumsnachteil, gefolgt vom Zelltod, induziert oder zur terminalen Differenzierung führt. Obwohl WEHI 231 Zellen unreife, d.h. sIgM+ B-Zellen repräsentieren, exprimieren Blimp-1 transduzierte WEHI 231 Zellen die J-Kette, zeigen eine erhöhte Konzentration der für die sekretorische Form der my-Kette codierenden mRNA, exprimieren den Plasmazellmarker Syndecan-1 auf ihrer Oberfläche und sezernieren für kurze Zeit IgM. Diese Differenzierungsprozesse gehen allerdings mit einem Wachstumsnachteil und Zellzyklus-Arrest, gefolgt vom Zelltod, einher. Blimp-1 exprimierende WEHI 231 Zellen zeigen somit den Phänotyp kurzlebiger Plasmazellen. Eine Langzeitkultur Blimp-1+ WEHI 231 Zellen führt zum Verlust des differenzierten Phänotyps, d.h der Erhalt IgM-sezernierender WEHI 231 Zellen ist nicht ohne weitere Maßnahmen möglich. Auf molekularer Ebene hemmt Blimp-1 die Expression von c-myc und diejenige des antiapoptotischen Bcl-2 Familienmitgliedes A1, stimuliert aber die Expression von mad4. Die Verschiebung des Verhältnisses von Myc/Max- zu Mad/Max-Heterodimeren zugunsten von Mad/Max-Komplexen und die daraus resultierende Inhibition der Transkription von Myc-abhängigen, proiliferationsfördernden Genen ist in vielen Systemen als von zentraler Bedeutung für die Initiation von Differenzierungsprozessen beschrieben und wurde auch bereits für B-Zellen diskutiert. Auch in primären B-Zellen führt Blimp-1 zu einer verstärkten Expression von mad4. Wird der durch Blimp-1 bewirkte Verlust der Expression von A1 durch dessen Überexpression in Blimp-1+ WEHI 231 Zellen kompensiert, so überleben diese Zellen wieder erheblich länger, bleiben aber weiterhin im Zellzyklus arretiert. Der differenzierte Phänotyp, charakterisiert durch die verstärkte Expression von mad4 und der Sekretion von IgM, wird dabei aufrechterhalten. Wachstumsnachteil und Zelltod können in diesem System daher entkoppelt werden. In primären Zellen führt Blimp-1 ebenfalls zur Erniedrigung der A1 Expression. Da diese Zellen aber nicht in dem Maße wie WEHI 231 Zellen absterben, kann der Verlust von A1 offensichtlich besser kompensiert werden. Die Lebensdauer einer Blimp-1+ Plasmazelle ist somit durch Manipulation der Expression von antiapoptotischen Molekülen wie A1 verlängerbar. / Blimp-1 (“B lymphocyte-induced maturation protein 1”) is a zinc-finger containing transcription factor that drives B-cell terminal differentiation to immunoglobulin-secreting plasma cells. Following stimulation, primary B cells either directly undergo terminal differentiation to IgM secreting plasma cells, thus providing a rapidly established source of neutralizing antibodies, or enter the memory pathway characterized by affinity maturation and isotype switching. Which of the various fates is adopted by the B cells is determined by the strength and the duration of the BCR-signal, the availability and the quality of T cell help and other signals derived from the microenvironment of the germinal center. High rate secretion is correlated with endogenous Blimp-1 levels and can be caused by ectopic expression of Blimp-1, suggesting that Blimp-1 is a master gene which is able to initiate and maintain the complex terminal differentiation program. Using cultures of resting primary mouse B cells stimulated in vitro in various combinations with interleukin-4 (IL-4), anti-mF(ab´)2 or anti-CD40 in the absence or presence of LPS, it is shown that IgM secretion and the expression of Blimp-1 is either not induced or even suppressed by BCR or CD40 ligation and by IL-4. Additional treatment with IL-2 and IL-5 induces Blimp-1 expression and facilitates IgM and IgG1 secretion, which can also be achieved by retroviral transduction of Blimp-1. In contrast, the increase in sIgG1+ cells with time in presence of IL-4 is greatly diminished in cells forced to express Blimp-1, suggesting that Blimp-1 inhibits further class-switching. Therefore, Blimp-1 expression takes B cells out of the memory pathway and initiates the terminal differentiation program. On the other hand, suppression of Blimp-1 by antigen-BCR interaction and T helper cell dependent CD40 and IL-4 signalling is necessary to facilitate entrance into the memory pathway and to prevent terminal differentiation. To identify genes whose expression is influenced by Blimp-1, WEHI 231 B lymphoma cells were retrovirally transduced with Blimp-1. Overexpression of Blimp-1 in B lymphoma cells has been reported to induce either growth arrest and cell death or immunoglobulin secretion and terminal differentiation, depending on the developmental stage of the recipient lymphomas. Surprisingly, Blimp-1 transduced immature WEHI 231 cells produce J chain, increased levels of the secretory form of my heavy chain mRNA, express the plasma cell marker syndecan-1 on their surface and secrete IgM for a short period of time. Concomitantly, they exhibit a distinct growth disadvantage with cell cycle arrest, followed by cell death. Thus, Blimp-1+ WEHI 231 cells aquire the phenotype of short-lived plasma cells. However, this differentiated phenotype of Blimp-1+ WEHI 231 cells was transient and not longer observed after long term culture. On the molecular level, Blimp-1 transduced WEHI 231 cells exhibit altered ratios of c-myc/mad4 mRNA levels and a reduction in the expression of the anti-apoptotic bcl-2 family member A1. It is known from several experimental systems that induction of transcripts of the mad family and therefore a change in favor of mad/max rather than myc/max complexes favors differentiation over proliferation. An important role for the myc/max/mad network in B cell proliferation, differen-tiation and apoptosis has recently been discussed by Melchers. The upregulation of mad4 expression by Blimp-1 is also observed in primary B cells. To determine whether A1 downregulation is causally involved in the short live span of Blimp-1+ WEHI 231 cells, sublines overexpressing A1 were established by retroviral transduction. Additional ectopic expression of A1 greatly extends the life span of Blimp-1 expressing WEHI 231 cells but does not overcome their block in cell cycle transition. Therefore, the proliferative disadvantage of Blimp-1 transduced cells can be separated from cell death in this system. A1+ Blimp-1+ WEHI 231 cells still show the differentiated phenotype characterized by IgM secretion and increased mad4 expression. In primary B cells, Blimp-1 also leads to a decrease in the expression of A1. However, the loss of A1 can be compensated in primary B cells since Blimp-1 expression does not lead to a comparable cell death as observed in WEHI 231 cells. These data suggest that levels of A1 and other anti-apoptotic molecules may determine the checkpoint between death and survival of Blimp-1 expressing B cells.

The gram-positive, facultative intracellular pathogen Listeria monocytogenes is the causal agent of listeriosis. Most of well-known virulence genes are controlled by PrfA that belongs to the Crp-Fnr family of transcriptional activators. A PrfA-mediated transcription initiating at a virulence gene promoter, inlC promoter (PinlC) that regulates the expression of the small, secreted internalin C, was in-depth characterized by an in vitro transcription system to unravel the essential features of a PrfA-dependent promoter in this study. The obtained results indicate a dual promoter for inlC that leads to PrfA-dependent and -independent transcription in vitro and in vivo. The PrfA-dependent transcription requires, as expected, the PrfA-box, a conserved 14 bp sequence of dyad symmetry located about 40 bp upstream of the transcriptional start site of each PrfA-regulated gene. Another important structural feature for this PrfA-dependent promoter is the distance between the 3´-end of the PrfA-box and the 5´-end of the SigA-recognized –10 box fixed to 22 or 23 bp, which is observed in the interspace regions of the other known PrfA-dependent promoters, e.g. PactA, PplcA, Phly and Pmpl. The –35 box of PinlC is not necessary for PrfA-dependent transcription. The –10 box of PinlC and also that of the other PrfA-dependent promoters of L. monocytogenes closely resemble SigA-recognized –10 promoter sequences of the well-characterized gram-positive bacterium B. subtilis. Even the extended –10 motif (5´-TRTG-3´) considered to be a basic element for many SigA-recognized promoters in B. subtilis is present in PinlC. Primer extension studies reveal that both the PrfA-dependent and the independent promoter share the same –10 box. The PrfA-independent transcription of inlC depends on a –35 box located directly downstream of the PrfA-box, and the close proximity of the two sites inhibits strongly the transcription activity of the PrfA-independent promoter when the PrfA-RNA polymerase complex binds to the PrfA-box. Deletion of the PrfA-box results in PrfA-independent transcription from PinlC, which is no longer inhibited by PrfA. High concentration of GTP appears to be necessary for PrfA-dependent transcription initiated at the inlC promoter and at other PrfA-dependent promoters. Based on transcriptome analysis, Milohanic and his co-workers identified three groups of genes that were regulated differently by PrfA. Some of these genes containing putative PrfA-boxes in their 5´-upstream regulatory regions were selected for analysis of their transcriptional dependency on PrfA using again the in vitro transcription system. The data show that among these “PrfA-regulated” promoters tested, only the promoter of the hpt gene belonging to group I is clearly activated by PrfA. This promoter is also the only one that exhibited all essential features of a typical PrfA-dependent promoter as described above. In vitro transcription starting at most of the other promoters was neither positively nor negatively affected by PrfA. Transcription initiated at some of the promoters of group III genes (lmo0596 and lmo2067) is rather inefficient with SigA-loaded RNA polymerase, but is highly activated with RNA polymerase loaded with purified SigB. Addition of purified PrfA protein has no effect on the SigB-dependent transcription. These in vitro transcription results indicate that the in vivo observed PrfA effect on the expression of most of the new genes is either indirect or PrfA-mediated transcription of these genes requires - in contrast to the PrfA-dependent transcription of the known virulence genes (including hpt) - additional factors not present in the in vitro transcription assay. In addition to these new genes described by Milohanic, the promoters of two genes (lmo2420 and lmo2840) that contain putative PrfA-boxes with only a single mismatch in their upstream regulatory regions were analyzed in this study. However, transcription of none of these genes is regulated by PrfA, suggesting that these genes are either not truly regulated by PrfA or regulated by other global transcription activators that interact with PrfA by yet unknown mechanisms. By exchanging corresponding sequences between a functionally inactive promoter ParoAP2 and a typical PrfA-dependent promoter PplcA, it is found that PrfA-dependent in vitro transcription can be initiated from the hybrid promoter containing the putative PrfA-box and the SigA-recognized –10 box (TTTAAT) from the putative PrfA-dependent aroAP2 promoter, but it is inhibited strongly by the interspace sequence between these two sites apparently due to an additional RNA polymerase binding site [the –10 box (TAATAT) for the PrfA-independent transcription of ParoAP1)] within this region. Furthermore, a symmetric sequence downstream of the –10 box (TTTAAT) is also shown to be a strongly inhibitory for PrfA-dependent transcription from the putative PrfA-dependent aroAP2 promoter. / Listeria monocytogenes, ein gram-positives, fakultativ intrazelluläres Bakterium. Die meisten bekannten listeriellen Virulenzgene werden durch den positiven Regulationsfaktor PrfA, der zur Crp-Fnr-Familie von Transkriptionsfaktoren zählt, reguliert. Zu den durch PrfA regulierten Genen zählt auch inlC, das das kleine sekretierte Internalin C kodiert. Mit Hilfe des in vitro Transkriptionssystems wurde in dieser Arbeit die PrfA-abhängige Transkription des inlC-Promotors (PinlC) untersucht, um die essentiellen Eigenschaften eines PrfA-abhängigen Promotors zu charakterisieren. Die hier erhaltenen Ergebnisse deuten auf einen dualen Promotor für inlC hin, der für eine PrfA-abhängige und -unabhängige Transkription in vitro und in vivo verantwortlich ist. Ein weiteres wichtiges Merkmal für diesen PrfA-abhängigen Promotor ist der Abstand zwischen dem 3'-Ende der PrfA-Box und dem 5'-Ende der SigA-abhängigen –10 Box, der 22 oder 23 bp beträgt und auch bei anderen bekannten PrfA-abhängigen Promotoren wie PactA, PplcA, Phly und Pmpl zu finden ist. Untersuchungen zeigten, dass die –35 Box von PinlC nicht notwendig für eine PrfA-abhängige Transkription ist. Die –10 Box von PinlC und anderen PrfA-abhängigen Promotoren von L. monocytogenes ähnelt stark den SigA-abhängigen –10 Promotorsequenzen des gut untersuchten gram-positiven Bakteriums B. subtilis. Sogar das erweiterte –10 Motiv (5'-TRTG-3'), das in B. subtilis als Hauptbestandteil vieler SigA-abhängiger Promotoren betrachtet wird, ist auch in PinlC zu finden. Untersuchungen mit Primer Extension zeigten, dass der PrfA-abhängige und PrfA-unabhängige inlC-Promotor die gleiche –10 Box verwenden. Die PrfA-unabhängige Transkription von inlC ist abhängig von einer –35 Box, die direkt downstream der PrfA-Box liegt. Durch die enge Nachbarschaft dieser beiden Sequenzen wird die Transkriptionsaktivität des PrfA-unabhängigen Promotors stark inhibiert, wenn der PrfA-RNA-Polymerase-Komplex an die PrfA-Box bindet. Deletion der PrfA-Box führt zu einer PrfA-unabhängigen Transkription von PinlC, die nicht länger durch PrfA inhibiert wird. Hohe Konzentration an GTP scheint zudem für die PrfA-abhängige Transkripitonsinitiation am inlC-Promotor und anderen PrfA-abhängigen Promotoren notwendig zu sein. Basierend auf Transkriptomanalysen identifizierte Milohanic et al. drei Gruppen von Genen, die differentiell durch PrfA reguliert werden. Einige dieser Gene besitzen putative PrfA-Boxen in ihren Promotorbereichen und wurden in dieser Arbeit mit Hilfe des in vitro Transkriptionssystems auf ihre PrfA-Abhängigkeit untersucht. Die hier erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass unter allen untersuchten "PrfA-regulierten" Promotoren nur der Promotor des hpt-Gens - einem Mitglied der Gruppe I - deutlich durch PrfA aktiviert wird. Die meiste andere Promotoren wurde weder positiv noch negativ durch PrfA beeinflusst. Die Transkription von einigen Promotoren der Gruppe III Gene (lmo0596 und lmo2067) ist relativ ineffizient mit SigA-beladener RNA-Polymerase, wird aber stark aktiviert, wenn RNA-Polymerase mit gereinigtem SigB beladen wird. Zugabe von gereinigtem PrfA-Protein hat keinen Einfluss auf die SigB-abhängige Transkription. Diese in vitro-Transkriptionsergebnisse deuten darauf hin, dass der in vivo beobachtete PrfA-Effekt auf die Expression der meisten neu identifizierten Gene entweder indirekt ist oder die PrfA-vermittelte Transkription dieser Gene im Gegensatz zur PrfA-abhängigen Transkription der bekannten Virulenzgene (einschließlich hpt) zusätzliche Faktoren benötigt, die im in vitro Transkriptionsansatz nicht vorhanden sind. Neben diesen neuen von Milohanic et al. beschriebenen Genen wurden die Promotoren von zwei weiteren Genen (lmo2420 und lmo2840) untersucht, die putative PrfA-Boxen mit nur einem Mismatch aufwiesen. Die Transkription dieser beiden Gene zeigte jedoch keine Abhängigkeit von PrfA. Durch Austausch entsprechender Sequenzen zwischen einem funktionell inaktiven Promotor ParoAP2 und einem typischen PrfA-abhängigen Promotor PplcA konnte gezeigt werden, dass PrfA-abhängige in vitro Transkription von einem Hybridpromotor initiiert werden kann, der die putative PrfA-Box und SigA-abhängige –10 Box (TTTAAT) des möglicherweise PrfA-abhängigen aroAP2-Promotors besitzt. In vitro Transkription wird allerdings durch die zwischen PrfA und –10 Box liegende Sequenz des aroAP2-Promotors stark inhibiert, da offensichtlich eine zusätzliche RNA-Polymerase-Bindungsstelle [die –10 Box (TAATAT) für die PrfA-unabhängige Transkription von ParoAP1] in dieser Region vorliegt. Außerdem konnte gezeigt werden, dass eine symmetrische Sequenz downstream der –10 Box (TTTAAT) die PrfA-abhängige Transkription vom aroAP2-Promotor stark inhibiert.

Wachstum und Entwicklung pflanzlicher Gewebe bedingen eine fortwährende Veränderung von Source-Sink Beziehungen. Gewebe mit einem Nettoexport (Source) oder - import (Sink) von Kohlenhydraten müssen ihren aktuellen Bedarf an Assimilaten entsprechend dem Entwicklungsstadium anpassen. Darüber hinaus haben Pflanzen als ortsgebundene Lebewesen Regulationsmechanismen entwickelt, die eine flexible Antwort der Assimilatverteilung auf spezielle Anforderungen des Habitats, wie biotische oder abiotische Stressfaktoren und wechselnde Lichtbedingungen, ermöglichen. Die Assimilatverteilung ist vielfältig reguliert und erfordert spezifische Enzymfunktionen, wie Zuckertransporter und saccharosespaltende Enzyme. Extrazelluläre Invertasen nehmen eine essentielle Funktion in der apoplastischen Phloementladung und in der Regulation von Source-Sink Übergängen ein. Dies spiegelt sich in dem Auftreten verschiedener Invertase- Isoenzyme mit speziellen Expressions- und Regulationsmustern wider, welche eine Koordination des Kohlenhydratmetabolismus in unterschiedlichen Geweben, zu unterschiedlichen Entwicklungsstufen und unter sich ändernden Umweltbedingungen ermöglichen. Ein detailliertes Wissen über die Funktion extrazellulärer Invertasen könnte eingesetzt werden, um Wachstum, Entwicklung oder Pathogenresisitenz von Nutzpflanzen gezielt zu verändern. In der vorliegenden Studie wurden die Regulationsmuster und die Funktion dreier extrazellulärer Invertasen aus Tomate, Lin5, Lin6 und Lin7 untersucht. Durch umfangreiche Promotorstudien konnte eine gewebe- und entwicklungsspezifische Expression dieser Isoenzyme und entsprechende Regulationsmuster offengelegt werden. Lin5 zeigt eine entwicklungsabhängige Expression in Früchten. Lin6 wird in frühen Entwicklungsstadien, beginnend mit der Samenkeimung, exprimiert; in ausgewachsenen Pflanzen ist eine Lin6 Expression nur in Pollen oder nach Verwundungsinduktion nachweisbar. Lin7 wird ausschließlich in Tapetum-Gewebe und Pollen exprimiert. Die hormonelle Regulation der Isogene wurde im Detail untersucht, hierbei konnten bekannte Phänotypen, welche durch Gibberellinsäure und Jasmonate bedingt werden, mit Invertasefunktionen in Korrelation gebracht werden. Darüber hinaus konnte in einem funktionalen Ansatz gezeigt werden, dass Lin7 eine wichtige Rolle in der Pollenkeimung zukommt. Die vorliegende Arbeit stellt die umfassendste Untersuchung extrazellulärer Invertasen während der Blütenentwicklung dar, an der drei Isoenzyme aus Tomate beteiligt sind. Dadurch, dass den einzelnen Invertasen Lin5, Lin6 und Lin7 individuelle Funktionen zugewiesen werden konnten, eröffnen sich neue Erkenntnisse über die Kohlenhydratversorgung während der Blüten- und Fruchtentwicklung. Für die untersuchten gewebespezifischen Promotoren eröffnen sich zudem Anwendungsmöglichkeiten in der Biotechnologie, was insbesondere für den pollenspezifischen Lin7 Promotor zutrifft. Es konnte gezeigt werden, dass der Lin6 Promotor das Ziel von hormon-, zucker- und verwundungsvermittelten Signalwegen ist. Darüber hinaus konnte nachgewiesen werden, dass Elemente des circadianen Oszillators von A. thaliana mit dem Lin6 Promotor funktionell interagieren und die Lin6 Expression einem diurnalen Rhythmus unterliegt. Dieses komplexe Regulationsmuster spiegelt sich in vielen cis-aktiven Elementen wider, die im Lin6 Promotor vorgefunden wurden. Durch dieses Merkmal wird die These gestützt, dass verschiedene Stimuli über die extrazelluläre Invertase integriert werden und so eine koordinierte Zellantwort auf sich ändernde interne und externe Bedingungen ermöglicht wird. Nachdem Zuckermoleküle ihrerseits die Expression von Lin6 induzieren, wird dadurch eine Amplifikation von Signalen über eine positive Rückkopplungsschleife ermöglicht. Die Vielzahl an cis-aktiven Elementen und deren Anordnung im Lin6 Promotor stellen ein ideales Modellsystem dar, um Fragen in Bezug auf Signalinteraktion und -integration zu untersuchen. In einer umfangreichen Studie wurde der Lin6 Promotor erfolgreich als induzierbares Expressionssystem eingesetzt. Hierbei wurde ein Invertaseinhibitor unter der Kontrolle des cytokinininduzierbaren Lin6 Promotors in transgenen Tabakpflanzen exprimiert. Mit diesem Ansatz ist es gelungen einen kausalen Zusammenhang zwischen dem Hormon Cytokinin und extrazellulären Invertasen in der Seneszenzverzögerung herzustellen. Diese Studie zeigt, dass induzierbare Expressionssysteme essentiell sind, um spezifische Fragestellungen auf molekularer Ebene klären zu können. Bei der Klonierung obig genannter Promotorsequenzen haben sich zudem zwei interessante strukturelle Besonderheiten ergeben. Zum einen sind die Gene von Lin5 und Lin7 in einem Tandem auf dem Genom angeordnet, zum anderen konnte eine Transposoninsertion im Intron I des Lin5 Gens gezeigt werden. Mit einem Primerpaar, das aus der Transposaseregion dieses Transposons abgeleitet wurde, konnten entsprechende Sequenzen von mehreren Solanaceae Spezies gewonnen werden. / Because of growth and development, plant tissues are characterised by a permanent change in source-sink relations. Tissues with a net carbohydrate export (source) or import (sink) have to adopt their actual demand for assimilates according to the developmental status. Furthermore, plants, as sessile life forms, have developed regulatory mechanisms that enable a flexible response of assimilate partitioning to specific requirements of the habitat, like biotic and abiotic stress factors and changing light conditions. The distribution of assimilates involves specific enzyme functions including sugar transporters and sucrose cleaving enzymes and is regulated by a variety of stimuli. Extracellular invertases cover an essential function in apoplastic phloem unloading and play an important role in regulating source-sink relations. This property is reflected by the occurrence of different invertase isoenzymes with specific expression and regulation patterns that enable a co-ordination of the carbohydrate metabolism in diverse tissues, at different developmental stages, and under varying environmental conditions. Improved knowledge of extracellular invertase function might allow altering growth, development or pathogen resistance of crop plants in a specific way. The present study is aimed at elucidating the regulation patterns and functions of three members of the extracellular invertase gene family of tomato, Lin5, Lin6, and Lin7. Detailed promoter analysis revealed a tissue- and developmental-specific expression of isoenzymes and corresponding regulation patterns. Lin5 shows a developmental regulated expression in fruits. Lin6 is expressed in early developmental stages starting in germinating seeds; in grown up plants Lin6 is solely expressed in pollen and upon wound-stimulation. Lin7 is exclusively expressed in tapetum and pollen tissue. The hormonal regulation of all three isogenes was analysed in detail, whereby known GA- and JA-mediated flower phenotypes could be correlated with invertase functions. In addition, an important role of Lin7 invertase in pollen germination was demonstrated in a functional approach. This is the most profound analysis of extracellular invertases in the delicate process of floral organ development that includes three tomato isoenzymes. In particular, dissection of the individual roles of Lin5, Lin6, and Lin7 reveals novel insights in carbohydrate supply during flower and fruit development. The analysed tissue-specific promoters are profitable tools in plant biotechnology, which in particular applies to the pollen-specific Lin7 promoter. It has been demonstrated that the Lin6 promoter serves as target for hormonal-, sugar-, and wound-mediated signalling pathways. Moreover, a functional interaction of circadian oscillator elements of A. thaliana with the Lin6 promoter and a diurnal rhythm of Lin6 expression have been substantiated. This complex regulation pattern is reflected by the identification of many well-defined cis-acting elements within the Lin6 promoter. This feature supports an integration of various stimuli mediated via extracellular invertase expression resulting in a co-ordinated cellular response to changing internal and external conditions. As sugars on their part induce Lin6 expression, this could result in signal amplification via a positive feedback loop. Furthermore, the extensive appearance and constellation of cisacting elements within the Lin6 promoter provides the basis to answer questions in signal cross-talk and signal integration in plant gene expression. In addition, the Lin6 promoter was successfully used as an inducible expression system. In transgenic tobacco lines an invertase inhibitor was expressed under control of the cytokinin-inducible Lin6 promoter. Thereby, a causal relationship between cytokinin and extracellular invertase for the delay of senescence was demonstrated. This study emphasises the importance of inducible expression systems to address specific questions on a molecular basis. The above-mentioned promoter sequences were obtained via sequential genome walks. Hereby two interesting structural features appeared. First, Lin5 and Lin7 genes are arranged in a direct tandem repeat on the genome. Second, a CACTA-like transposon insertion in intron I of the Lin5 gene was revealed. A primer pair deduced from the transposase region of this transposon allowed the amplification of similar sequences of various Solanaceae species.