Freie Universiẗat, Diss., 2005--Berlin. / Dateiformat: zip, Dateien im PDF-Format. Erscheinungsjahr an der Haupttitelstelle: 2005.

Bacterial small non-coding RNAs (sRNAs) play fundamental roles in controlling and finetuning gene expression in a wide variety of cellular processes, including stress responses, environmental signaling and virulence in pathogens. Despite the identification of hundreds of sRNA candidates in diverse bacteria by genomics approaches, the mechanisms and regulatory capabilities of these posttranscriptional regulators have most intensively been studied in Gram-negative Gammaproteobacteria such as Escherichia coli and Salmonella. So far, almost nothing is known about sRNA-mediated regulation (riboregulation) in Epsilonproteobacteria, including the major human pathogen Helicobacter pylori. H. pylori was even thought to be deficient for riboregulation as none of the sRNAs known from enterobacteria are conserved in Helicobacter and since it lacks the major RNA chaperone Hfq, which is crucial for sRNA function as well as stability in many bacteria. Nonetheless, more than 60 cis- and trans-acting sRNA candidates were recently identified in H. pylori by a global RNA sequencing approach, indicating that this pathogen, in principle, has the capability to use riboregulation for its gene expression control. However, the functions and underlying mechanisms of H. pylori sRNAs remained unclear. This thesis focused on the first functional characterization and target gene identification of a trans-acting sRNA, RepG (Regulator of polymeric G-repeats), in H. pylori. Using in-vitro and in-vivo approaches, RepG was shown to directly base-pair with its C/Urich terminator loop to a variable homopolymeric G-repeat in the 5’ untranslated region (UTR) of the tlpB mRNA, thereby regulating expression of the chemotaxis receptor TlpB. While the RepG sRNA is highly conserved, the length of the G-repeat in the tlpB mRNA leader varies among different H. pylori isolates, resulting in a strain-specific tlpB regulation. The modification of the number of guanines within the G-stretch in H. pylori strain 26695 demonstrated that the length of the homopolymeric G-repeat determines the outcome of posttranscriptional control (repression or activation) of tlpB by RepG. This lengthdependent targeting of a simple sequence repeat by a trans-acting sRNA represents a new twist in sRNA-mediated regulation and a novel mechanism of gene expression control, since it uniquely links phase variation by simple sequence repeats to posttranscriptional regulation. In almost all sequenced H. pylori strains, tlpB is encoded in a two gene operon upstream of HP0102, a gene of previously unknown function. This study provided evidence that HP0102 encodes a glycosyltransferase involved in LPS O-chain and Lewis x antigen production. Accordingly, this glycosyltransferase was shown to be essential for mice colonization by H. pylori. The coordinated posttranscriptional regulation of the tlpB-HP0102 operon by antisense base-pairing of RepG to the phase-variable G-repeat in the 5’ UTR of the tlpB mRNA allows for a gradual, rather than ON/OFF, control of HP0102 expression, thereby affecting LPS biosynthesis in H. pylori. This fine-tuning of O-chain and Lewis x antigen expression modulates H. pylori antibiotics sensitivity and thus, might be advantageous for Helicobacter colonization and persistence. Whole transcriptome analysis based on microarray and RNA sequencing was used to identify additional RepG target mRNAs and uncover the physiological role of this riboregulator in H. pylori. Altogether, repG deletion affected expression of more than 40 target gene candidates involved various cellular processes, including membrane transport and adhesion, LPS modification, amino acid metabolism, oxidative and nitrosative stress, and nucleic acid modification. The presence of homopolymeric G-repeats/G-rich sequences in almost all target mRNA candidates indicated that RepG hijacks a conserved motif to recognize and regulate multiple target mRNAs in H. pylori. Overall, this study demonstrates that H. pylori employs riboregulation in stress response and virulence control. In addition, this thesis has successfully established Helicobacter as a new model organism for investigating general concepts of gene expression control by Hfq-independent sRNAs and sRNAs in bacterial pathogens. / Bakterielle kleine, nicht-kodierende RNAs (sRNAs, engl. für small RNAs) spielen eine fundamentale Rolle in der Kontrolle und Feinabstimmung der Genexpression in Bakterien. Sie sind an einer Vielzahl von zellulären Prozessen, einschließlich der Adaption an unterschiedliche Stress- sowie Umweltbedingungen und der Virulenz von bakteriellen Pathogenen, beteiligt. Trotz der Identifizierung von Hunderten von sRNA-Kandidaten in diversen Bakterien durch genomweite Untersuchungsmethoden, wurden die regulatorischen Eigenschaften und Mechanismen dieser posttranskriptionellen Regulatoren bisher hauptsächlich in Gram-negativen Gammaproteobakterien wie Escherichia coli und Salmonella untersucht. Bislang ist nur wenig über sRNA-basierte Regulation (Riboregulation) in Epsilonproteobakterien, einschließlich dem weitverbreiteten Humanpathogen Helicobacter pylori, bekannt. Es wurde sogar angenommen, dass H. pylori über keine Art der Riboregulation verfügt, da keine der enterobakteriellen sRNAs in Helicobacter konserviert sind. Zudem konnte in diesem Erreger kein Homolog für das RNAChaperon Hfq, welches in vielen Bakterien essentiell für die Funktion und Stabilität von sRNAs ist, identifiziert werden. Nichtsdestotrotz wurden mit Hilfe einer globalen RNASequenzierungsstudie,die auf der Sequenzierung primärer Transkripte in einem Hochdurchsatzverfahren basiert, kürzlich mehr als 60 in cis- und in trans-agierende sRNAKandidaten in H. pylori identifiziert. Diese Transkriptomanalyse deutet darauf hin, dass H. pylori prinzipiell die Fähigkeit hat Riboregulation zur Kontrolle seiner Genexression zu nutzen. Die Funktionen und Mechanismen von sRNAs in H. pylori sind jedoch immer noch unklar. In der vorgelegten Arbeit wurde erstmals eine in trans-agierende sRNA, RepG (Regulator of polymeric G-repeats), in Helicobacter charakterisiert sowie dessen zelluläre Zielgene identifiziert. Mit Hilfe diverser in-vitro und in-vivo Analysen konnte gezeigt werden, dass der C/U-reiche Transkriptionsterminatorloop von RepG direkt an eine variable, repetitive G-Sequenz in der 5‘ untranslatierten Region (UTR) der tlpB mRNA bindet. Durch diese direkte sRNA-mRNA Interaktion wird die Expression des Chemotaxis Rezeptors TlpB reguliert. Im Gegensatz zu einer hohen Konservierung der Sequenz der RepG sRNA, variiert die Länge des G-Stretches im 5‘ UTR der tlpB mRNA zwischen unterschiedlichen H. pylori Isolaten. Diese Längenvariation resultiert in einer Stamm-spezifischen Regulation der TlpB Expression. Die Modifikation der Anzahl der Guanin-Basen im G-Stretch des H. pylori Stammes 26695 demonstrierte, dass die Länge der repetitiven G-Sequenz das Ergebnis der posttranskriptionellen Regulation (Repression oder Aktivierung) von tlpB durch RepG beeinflusst. Die hier beschriebene Längen-abhängige Interaktion zwischen einer in transagierenden sRNA und einer einfachen, repetitiven Sequenz repräsentiert nicht nur ein neues Konzept für die Genregulation durch sRNAs, sondern stellt auch einen neuen Mechanismus der Genexpressionskontrolle dar. Darüber hinaus, veranschaulicht die hier beschriebene sRNA-mRNA Interaktion eine bislang einzigartige Verknüpfung von Phasenvariation durch hochvariabel, repetitive Sequenzen mit Genregulation durch sRNAs. In nahezu allen sequenzierten H. pylori Stämmen ist das tlpB Gen in einem Operon zusammen mit einem Gen mit bisher unbekannter Funktion, HP0102, kodiert. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass HP0102 für eine Glykosyltransferase kodiert, die an der Synthese der O-Seitenketten des LPS und des Lewis x Antigens in H. pylori beteiligt ist. Darüber hinaus konnte demonstriert werden, dass diese Glykosyltransferase für die Kolonisierung des murinen Magens durch H. pylori essentiell ist. Die koordinierte, posttranskriptionelle Regulation des tlpB-HP0102 Operons, welche durch antisense Basenpaarung zwischen RepG und der phasen-variablen, repetitiven G-Sequenz im 5‘ UTR der tlpB mRNA vermittelt wird, ermöglicht eine graduelle Kontrolle der Genexpression von HP0102, und somit Einflussnahme auf die LPS Biosynthese in H. pylori. Diese Feinabstimmung der LPS O-Seitenketten und Lewis x Antigen Expression beeinflusst die Resistenz von H. pylori gegen diverse Antibiotika und könnte somit sowohl für die Kolonisierung als auch für die persistente Infektion des Wirts durch H. pylori vorteilhaft sein. Um Einblicke in die physiologische Funktion von RepG zu gewinnen, wurden in einer genom-weiten Transkriptomanalyse mittels Microarray und RNA-Sequenzierung weitere Zielgene von RepG bestimmt. Insgesamt beeinflusste die Deletion von repG die Expression von mehr als 40 potentiellen Zielgenen, welche an diversen zellulären Prozessen beteiligt sind, wie z.B. Membrantransport und Adhäsion, Aminosäure- und Nukleinsäure-Metabolismus, oxidative und nitrosative Stressantwort sowie LPS Modifizierung. Die Identifizierung von homopolymeren G-Stretchen bzw. G-reichen Sequenzen in allen ZielmRNAs deutet darauf hin, dass RepG ein konserviertes Motiv bindet, um mehrere Zielgene in H. pylori zu erkennen und zu regulieren. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass H. pylori Riboregulation basierend auf sRNAs nutzt, um seine Genexpression in unterschiedlichen Stress- und Virulenzbedingungen zu regulieren. Darüber hinaus hat diese Studie Helicobacter als neuen Modelorganismus für die Untersuchung genereller Wirkungsweisen Hfq-unabhängiger sRNAs und sRNAs in bakteriellen Pathogenen etabliert.

The transcription factor MYC is deregulated in over 70% of all human tumors and, in its oncogenic form, plays a major role in the cancer metabolic reprogramming, promoting the uptake of nutrients in order to sustain the biosynthetic needs of cancer cells. The research presented in this work aimed to understand if MYC itself is regulated by nutrient availability, focusing on the two major fuels of cancer cells: glucose and glutamine. Initial observations showed that endogenous MYC protein levels strongly depend on the availability of glutamine, but not of glucose. Subsequent analysis highlighted that the mechanism which accounts for the glutamine-mediated regulation of MYC is dependent on the 3´-untranslated region (3´-UTR) of MYC. Enhanced glutamine utilization by tumors has been shown to be directly linked to MYC oncogenic activity and MYC-dependent apoptosis has been observed under glutamine starvation. Such effect has been described in experimental systems which are mainly based on the use of MYC transgenes that do not contain the 3´-UTR. It was observed in the present study that cells are able to survive under glutamine starvation, which leads to cell cycle arrest and not apoptosis, as previously reported. However, enforced expression of a MYC transgene, which lacks the 3´-UTR, strongly increases the percentage of apoptotic cells upon starvation. Evaluation of glutamine-derived metabolites allowed to identify adenosine nucleotides as the specific stimulus responsible for the glutamine-mediated regulation of MYC, in a 3´-UTR-dependent way. Finally, glutamine-dependent MYC-mediated effects on RNA Polymerase II (RNAPII) function were evaluated, since MYC is involved in different steps of global transcriptional regulation. A global loss of RNAPII recruitment at the transcriptional start site results upon glutamine withdrawal. Such effect is overcome by enforced MYC expression under the same condition. This study shows that the 3´UTR of MYC acts as metabolic sensor and that MYC globally regulates the RNAPII function according to the availability of glutamine. The observations presented in this work underline the importance of considering stress-induced mechanisms impinging on the 3´UTR of MYC. / In über 70% aller Krebserkrankungen ist der Transkriptionsfaktor MYC dereguliert. Dabei spielt onkogenes MYC unter anderem eine wichtige Rolle bei der Umprogrammierung metabolischer Prozesse indem es z.B. die Aufnahme von Nährstoffen wie Glutamin oder Glukose fördert, um den veränderten Bedürfnissen an den Stoffwechsel der Krebszellen Rechnung zu tragen. Die im Rahmen dieser Arbeit erzielten Ergebnisse zeigen, dass auch das MYC-Protein selbst durch die Verfügbarkeit von Nährstoffen in der Zelle reguliert werden kann. Erste Beobachtungen zeigten, dass die endogenen MYC Proteinlevel stark von der Verfügbarkeit von Glutamin, jedoch nicht von Glucose, abhängen. Weiterführende Experimente ergaben außerdem, dass der Mechanismus, der der Glutamin vermittelten Regulation von MYC zugrunde liegt, abhängig von der 3´-untranslatierten Region (3´-UTR) der MYC-mRNA ist. Es konnte bereits gezeigt werden, dass in Tumoren die verstärkte Nutzung von Glutamin in direktem Zusammenhang mit der onkogenen Aktivität von MYC steht und Zellen unter Glutaminentzug MYC-abhängig Apoptose einleiten. Diese Effekte wurden in experimentellen Systemen beschrieben, die auf einer Überexpression eines MYCTransgenes basierten, welches keine 3´-UTR enthält. In dieser Arbeit konnte jedoch beobachtet werden, dass Zellen, die ohne Glutamin kultiviert wurden, in der Lage waren zu überleben, da entgegen den Resultaten vorausgegangener Studien, ein Arrest des Zellzyklus und nicht Apoptose eingeleitet wurde. Die verstärkte Expression eines MYCTransgenes ohne 3´-UTR, erhöhte jedoch auch unter diesen Bedingungen die Anzahl apoptotischer Zellen. Weiterhin war es möglich Adenosin, für dessen Biosynthese Glutamin notwendig ist, als Stimulus zu identifizieren, der für die 3´-UTR abhängige Regulation von MYC verantwortlich ist. Da MYC in verschiedene Schritte der globalen Regulation der Transkription eingebunden ist, wurden abschließend die durch MYC vermittelten Glutaminabhängigen Effekte auf die RNA-Polymerase II (RNAPII) untersucht. Dabei zeigte sich, dass es nach Glutaminentzug zu einem globalen Verlust der Rekrutierung von RNAPII zu den Transkriptionsstartstellen kommt, was durch eine verstärkte MYC-Expression wieder aufgehoben werden kann. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die 3´-UTR von MYC als metabolischer Sensor fungiert und dass MYC in Abhängigkeit der Verfügbarkeit von Glutamin global die RNAPII Funktion reguliert. Diese Studie hebt weiterhin die Bedeutung der 3´-UTR von MYC für die Vermittlung stressinduzierter Feedback-Mechanismen hervor.

During infection, bacteria need to adapt to a changing environment and have to endure various stress conditions. Small non-coding RNAs are considered as important regulators of bacterial gene expression and so allow quick adaptations by altering expression of specific target genes. Regulation of gene expression in the human-restricted pathogen Neisseria gonorrhoeae, the causative agent of the sexually transmitted disease gonorrhoea, is only poorly understood. The present study aims a better understanding of gene regulation in N. gonorrhoeae by studying small non-coding RNAs. The discovery of antisense RNAs for all opa genes led to the hypothesis of asRNA-mediated degradation of out-of-frame opa transcripts. Analysis of asRNA expression revealed a very low abundance of the transcripts and inclusion of another phase-variable gene in the study indicates that the asRNAs are not involved in degradation of out-of-frame transcripts. This doctoral thesis focuses on the analysis of trans-acting sRNAs. The sibling sRNAs NgncR_162 and NgncR_163 were discovered as post-transcriptional regulators altering expression of genes involved in metabolic processes, amino acid uptake and transcriptional regulation. A more detailed analysis by in silico and transcriptomic approaches showed that the sRNAs regulate a broad variety of genes coding for proteins of central metabolism, amino acid biosynthesis and degradation and several transport processes. Expression levels of the sibling sRNAs depend on the growth phase of the bacteria and on the growth medium. This indicates that NgncR_162 and NgncR_163 are involved in the adaptation of the gonococcal metabolism to specific growth conditions. This work further initiates characterisation of the sRNA NgncR_237. An in silico analysis showed details on sequence conservation and a possible secondary structure. A combination of in silico target prediction and differential RNA sequencing resulted in the identification of several target genes involved in type IV pilus biogenesis and DNA recombination. However, it was not successful to find induction conditions for sRNA expression. Interestingly, a possible sibling sRNA could be identified that shares the target interaction sequence with NgncR_237 and could therefore target the same mRNAs. In conclusion, this thesis provides further insights in gene regulation by non-coding RNAs in N. gonorrhoeae by analysing two pairs of sibling sRNAs modulating bacterial metabolism or possibly type IV pilus biogenesis. / Bakterien müssen sich während des Infektionsprozesses an eine sich veränderte Umgebung anpassen und sind dabei zahlreichen Stressfaktoren ausgesetzt. Kleine, nicht-kodierende RNAs gelten als wichtige Regulatoren der bakteriellen Genexpression und ermöglichen daher eine schnelle Anpassung durch eine Veränderung der Expression spezifischer Ziel-Gene. Die Regulation der Genexpression des Humanpathogens Neisseria gonorrhoeae, Auslöser der Geschlechtskrankheit Gonorrhö, ist bis jetzt kaum verstanden. Die vorliegende Studie soll durch die Analyse kleiner, nicht-kodierender RNAs zum besseren Verständnis der Genregulation in Gonokokken beitragen. Durch die Entdeckung von antisense-RNAs für alle opa Gene wurde die Hypothese entwickelt, dass diese für den Abbau von opa Transkripten außerhalb des Leserahmens verantwortlich sind. Eine Analyse der asRNA Expression zeigte jedoch, dass diese sehr wenig exprimiert werden und auch die Untersuchung eines anderen phasenvariablen Gens weist darauf hin, dass die asRNAs keine Bedeutung für den Abbau von Transkripten außerhalb des Leserahmens haben. Der Schwerpunkt der Doktorarbeit liegt auf der Untersuchung trans-codierter sRNAs. Die Zwillings-sRNAs NgncR_162 und NgncR_163 agieren als post-transkriptionelle Regulatoren, die die Expression von Genen verändern, die bei Stoffwechselprozessen, Aminosäureaufnahme und transkriptioneller Regulation eine Rolle spielen. Eine detailliertere Analyse durch in silico- und Transkriptom-Studien zeigte, dass die sRNAs ein großes Spektrum an Genen regulieren, die für Proteine des Zentralstoffwechsels, der Aminosäurebiosynthese und des –abbaus, sowie zahlreicher Transportprozesse kodieren. Die Expressionslevel der Zwillings-sRNAs hängen von der Wachstumsphase der Bakterien und dem Wachstumsmedium ab. Das weist darauf hin, dass NgncR_162 und NgncR_163 eine Rolle bei der Adaptation des Stoffwechsels von Gonokokken zu bestimmten Wachstumsbedingungen spielen. In dieser Arbeit wird zudem die Charakterisierung der sRNA NgncR_237 initiiert. Im Rahmen von in silico Analysen wurde die Sequenzkonservierung und mögliche Sekundärstruktur untersucht. Eine Kombination aus in silico Zielgen-Vorhersage und differentieller RNA Sequenzierung führte zur Identifizierung zahlreicher Zielgene, die in der Biogenese von Typ IV Pili und DNA Rekombination eine Rolle spielen. Allerdings konnten keine Induktionsbedingungen für die sRNA Expression gefunden werden. Interessanterweise konnte eine mögliche Zwillings-sRNA identifiziert werden, die dieselbe Targetinteraktionsdomäne wie NgncR_237 hat und somit dieselben Zielgene regulieren könnte. Zusammenfassend ermöglicht diese Arbeit neue Einblicke in die Genregulation durch nicht-kodierende RNAs in Gonokokken, indem zwei Paare Zwillings-sRNAs analysiert wurden, die den bakteriellen Stoffwechsel anpassen oder möglicherweise eine Rolle in der Typ IV Pilus Biogenese spielen.

Die Regulation der Expression des myokardialen Na+/Ca2+-Austauschers spielt eine entscheidende Rolle in der Genese von kontraktiler Dysfunktion und Arrhythmie bei der Herzinsuffizienz. Ein besseres Verständnis dieser Regulationsprozesse könnte neue Angriffspunkte für Präventions- und Therapiestrategien liefern. In der vorliegenden Arbeit wurden die Effekte von α1-adrenerger-Stimulation und mechanischer Last, auf die mRNA-Transkription des NCX 1-Gens und weiterer Gene des Kalziumtransportes untersucht. Es wurden elektrisch stimulierte (1 Hz, 1,75 mmol/l Ca2+, optimale Vorlast), rechtsventrikuläre Trabekelpräparate des Kaninchens nach 3, 6, und 10 h kontinuierlicher α1-adrenerger Stimulation durch 10 umol/L PE untersucht. Diese Trabekel zeigten eine Abnahme der NCX- mRNA im Vergleich zur Kontrolle (gleiche Bedingungen, kein PE) auf 77,5 ± 3,2% nach 10h (p<0,05). Dieser Effekt war sowohl in Anwesenheit des selektiven α1-Rezeptorblocker Prazosin (Praz) (13 umol/L), als auch des PKC-Inhibitors GF 109203X (1 umol/l) nicht zu beobachten. Darüber hinaus konnte keine Regulation des NCX durch PE in nicht gedehnten Trabekeln beobachtet werden. Da vermutet wurde, dass der α1-adrenerge Effekt Ca2+-abhängig sein könnte, wurde die Wirkung erhöhter extrazellulärer Ca2+-Konzentrationen (3 mmol/l) untersucht und eine Abnahme der NCX-mRNA auf 77,4 ± 7,8 % (p<0.02) beobachtet. Des Weiteren wurden in Zellkulturexperimenten über 24 h, isolierte Kardiomyozyten von der Ratte und dem Kaninchen α1-adrenerger Stimulation durch 10 umol/l Phenylephrin ausgesetzt. Die mRNA der Gene von NCX 1, SERCA 2a und BNP wurden mit der real-time PCR bestimmt und gegen das Transkriptionsprodukt des GaPDH-Gens normiert. Bei den Kaninchenmyozyten waren keine signifikante Expressionsänderungen der Gene NCX 1 und SERCA 2a gegenüber der Kontrolle (Kultur ohne PE) zu beobachten, während die mRNA von BNP auf 257,7 ± 47,9% (p<0,03) der Kontrolle anstieg. In Rattenmyozyten wurden signifikante Veränderungen für NCX 1 (117.8 ± 7,9%, p<0,035), SERCA 2a (89,3 ± 3,4%, p<0,012), und BNP (284,2 ± 82,4%, p<0.016) beobachtet. Die genannten Befunde lassen erkennen, dass α1-adrenerge Stimulation die NCX-Transkription in isometrisch kontrahierenden, multizellulären Herzmuskelstreifen bei optimaler Vorlast über die Aktivierung der PKC vermindert. Die verminderte NCX-Transkription scheint durch Kalzium vermittelt und hängt von den Lastbedingungen ab. Die vorliegenden Ergebnisse lassen vermuten, dass endokrine und mechanische Faktoren über eine ineinander greifende intrazelluläre Signalkaskade und Endstrecke, die Regulation der NCX 1-Expression beeinflussen. Unterschiedlich starke Veränderungen dieser Faktoren könnten die unterschiedlichen Phänotypen der Herzinsuffizienz erklären und nach besserem Verständnis neue Möglichkeiten für Prävention und Therapie eröffnen.

In jeder menschlichen Zelle entstehen täglich ca. 10.000 – 150.000 endogene DNA Schäden. Eine Anhäufung dieser Läsionen kann zu genetischer Instabilität führen und dadurch zur Krebsentwicklung beitragen. Daher ist eine schnelle DNA Schadensantwort nötig, um schwerwiegende Folgen für die Zelle zu vermeiden. Da bekannt ist, dass der Multiproteinkomplex LINC (auch humaner dREAM-Komplex genannt) an der transkriptionellen Regulation mitotischer und G2-spezifischer Gene beteiligt ist, sollte in dieser Arbeit seine Beteiligung an der DNA Schadensantwort genauer untersucht werden. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass in normal wachsenden Zellen B-MYB an den LINC-Kernkomplex bindet, welcher sich aus 5 Proteinen zusammensetzt: LIN-9, LIN-54, LIN-52, LIN-37 und RbAp48. Treten DNA Schäden auf, dissoziiert B-MYB vom LINC Kernkomplex wobei gleichzeitig die Bindung von p130 und E2F4 an LINC induziert wird. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass der Signalweg, der die LINC Umlagerung vermittelt, sowohl p53- als auch p21-abhängig ist. p53 negative Zellen können nach Schädigung der DNA weder einen G1 Block induzieren noch einen G2 Block langfristig aufrechterhalten. Eine Erklärung für diese Schwächung des G2 Arrests liefern Daten dieser Arbeit: Da in DNA geschädigten p53 -/- Zellen keine LINC Umlagerung beobachtet werden kann und zusätzlich B-MYB verstärkt an LINC und die Zielpromotoren bindet, kommt es zu einer erhöhten G2/M Genexpression. Dies resultiert häufig in einem verfrühten Wiedereintritt in den Zellzyklus („checkpoint adaptation“). Eine Daten-Analyse primärer Brustkrebstumore zeigte außerdem, dass erhöhte B-MYB Genexpressionslevel mit einer erhöhte Rückfallgefahr und einer schlechten Prognose korrelieren, was möglicherweise auf die Funktion von B-MYB während der „checkpoint adaptation“ zurückzuführen ist. Schlussendlich lassen die Ergebnisse dieser Arbeit vermuten, dass die Hemmung der B-MYB Funktion in solchen Tumoren, die p53 Mutationen tragen, die Wahrscheinlichkeit eines Behandlungserfolges vergrößern und die Wahrscheinlichkeit eines Rückfalls senken könnte. / Around 10.000 – 150.000 endogenous DNA damage-induced lesions occur in a human body per day and cell. Accumulation of unrepaired lesions can lead to aneuploidy and the loss of genomic integrity which in turn contributes to tumor formation. Therefore, an efficient DNA damage response has to be initiated, in the end leading to cell cycle inhibition and induction of repair. Since it is known that a recently characterized human multiprotein complex named LINC (or human dREAM) together with B-MYB is involved in the regulation of G2/M gene expression (Plk1, cyclin B1, cdc2 etc.), its function in the DNA damage response was analyzed in this study. In growing cells B-MYB is associated to the LIN core complex which consists of 5 different proteins named LIN-9, LIN-54, LIN-52, LIN-37 and RbAp48. After induction of DNA damage B-MYB leaves the complex and binding of E2F4 and p130 to LINC is induced. Importantly, the upstream pathway leading to LINC rearrangement is dependent on the activation of p53 and p21. Interestingly, p53 -/- cells solely have the potential to block in the G2 phase of the cell cycle, thereby making them vulnerable for errors during G2 arrest induction or maintenance. Here I demonstrate that LINC rearrangement is absent in p53 -/- cells and that B-MYB/LINC binding to target gene promoters is increased. This in turn leads to an increased G2/M gene expression after DNA damage induction and triggers premature cell cycle re-entry (checkpoint adaptation). Significantly, B-MYB expression is increased in p53 mutated primary breast cancer tumors and correlates with poor prognosis and reoccurrence probably due to its function in checkpoint adaptation. This study gives evidence that inhibition of B-MYB gene expression or B-MYB function in p53 mutant tumors could be a good choice for adjuvant therapy.

Die Gattung Bordetella, die phylogenetisch in die Gruppe der β-Proteobakterien eingeordnet und zur Familie der Alcaligenaceae gezählt wird, umfasst nach heutigem Wissenstand neun Gram-negative Arten. Die klassischen Bordetella-Arten B. pertussis, B. parapertussis und B. bronchiseptica werden im sogenannten B. bronchiseptica-Cluster zusammengefasst. Der strikt humanpathogene Erreger B. pertussis stellt als Verursacher des Keuchhustens das wohl bedeutendste Mitglied der Gattung dar. B. parapertussis ist der Verursacher von respiratorischen Erkrankungen in Menschen und Schafen, während B. bronchiseptica für Atemwegserkrankungen in verschiedenen Säugetieren verantwortlich gemacht wird. Zudem kann B. bronchiseptica für einen längeren Zeitraum in der Umwelt überleben. Die in den letzte Jahren identifizierten „neuen“ Bordetella-Arten, B. avium, B. hinzii, B. holmesii, B. trematum und B. ansorpii, wurden alle human- oder tierassoziiert isoliert und besitzen unterschiedliches pathogenes Potential, das zum Teil noch näher untersucht werden muss. Eine Ausnahme stellt der aus einer anaeroben dechlorinierten Flusssediment-Anreicherungskultur isolierte Keim B. petrii dar. Dieser ist bis zum heutigen Zeitpunkt der einzige Umweltkeim der Gattung Bordetella (von Wintzingerode, Schattke et al. 2001). In evolutionärer Hinsicht ist B. petrii besonders interessant, da er sowohl für orthologe Gene einiger Virulenzfaktoren der pathogenen Bordetellen kodiert, als auch die typischen Eigenschaften eines Umweltkeims aufweist und somit als Bindeglied zu fungieren scheint. Ein solcher Virulenzfaktor ist das BvgAS-System, das in den pathogenen Bordetellen den Hauptregulator der Virulenzgenexpression darstellt, aber in B. petrii strukturell komplexer aufgebaut ist. Neben dem auf Aminosäureebene hoch konservierten Response Regulator bvgA, finden sich in B. petrii Gene für zwei Histidinkinasen, bvgS1 und bvgS2, sowie eine unabhängige hpt-Domäne. Eine periplasmatische Sensordomäne fehlt in beiden Kinasen, und nur in BvgS1 konnte eine PAS-Domäne identifiziert werden. In den letzten Jahren wurden zunehmend B. petrii-Isolate aus den verschiedensten Habitaten isoliert, wie z.B. das Schwammisolate R521 (Sfanos, Harmody et al. 2005) und das klinisches Isolat aus einem Patienten mit mandibulärer Osteomyelitis (Fry, Duncan et al. 2005). Im Rahmen dieser Arbeit wurde über einen PCR-Ansatz versucht, mit aus der Wildtypsequenz abgeleiteten Oligonukleotiden das BvgAS1,2-System der Isolate zu sequenzieren, aber nur im klinischen Isolat konnte ein orthologes Genfragment zum Response Regulator bvgA identifiziert werden. Ein Nachweis der Histidinkinasen sowie der hpt-Domäne schlug in allen untersuchten Isolaten fehl. Die vergleichenden Genomanalysen mittels DNA-Microarrays konnten aufgrund fehlender Hybridisierungen keine weiteren Gemeinsamkeiten und Unterschiede auf DNA-Ebene zwischen den Isolaten und B. petrii DSM 12804 aufzeigen. B. petrii ist ein hoch variabler Umweltkeim, der sich an verschiedene Lebensbedingungen anpassen kann. Dies konnte auch durch die Isolation dreier phänotypisch unterscheidbare Varianten während eines Langzeitwachstumsversuches gezeigt werden (Lechner 2008). Durch die Genomsequenzierung von B. petrii DSM 12804 konnten wenigsten sieben genomischen Inseln beschrieben werden (Gross, Guzman et al. 2008), die durch unterschiedliche Exzision für die Entstehung der Varianten und daraus resultierend für die Variabilität in B. petrii verantwortlich sind. Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Größe der einzelnen genomischen Inseln im Genom von B. petrii durch vergleichende Genomanalysen mittels DNA-Microarrays, mit Ausnahme von GI1, GI5 und GI6, im Vergleich zu den bioinformatischen Vorhersagen bestätigt werden. Diese Inseln zeigten in den Microarray-Analysen eine Vergrößerung bzw. Verkleinerung im Vergleich zu den zuvor beschrieben putativen Grenzen. Die große Instabilität des Genoms von B. petrii DSM 12804 konnte in dieser Arbeit auch durch Microarray-Analysen einzelner Klone aufgezeigt werden, die unterschiedliche Variationen im Bereich der genomischen Inseln aufwiesen. In den Analysen von B. petrii 12804 ΔbvgA bzw. ΔbvgAS konnten zusätzlich zu den gezielten Manipulation im BvgAS1,2-Lokus weitere Deletionen im Bereich von bpet0196-0200, bpet4219-4235 und bpet4176 detektiert werden. Die Re-Integration dieser Genbereiche nach Klonierung einer BvgA-Komplementationsmutante deutet auf eine extrachromosomale plasmid-ähnliche Struktur dieser Bereiche hin. Dies konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht abschließend bestätigt werden und bleibt weiter zu untersuchen. Im Verlauf der evolutionären Entwicklung der Bordetellen wurde das BvgAS-System, das ursprünglich für die Adaption an Umweltbedingungen mit verschiedenen Sauerstoff-konzentrationen und/oder Temperaturen zuständig war, mit der Regulation der Expression der Virulenzgene verknüpft (von Wintzingerode, Gerlach et al. 2002). In den Transkriptomanalysen zur Untersuchung der Funktionalität des BvgAS1,2-Systems in B. petrii konnte aufgezeigt werden, dass die Temperatur ein wichtiger Signalgeber für die Expression des Flagellen- und Chemotaxisoperons ist. In B. bronchiseptica wird die Motilität, bei Temperaturen unter 25°C, negativ durch das BvgAS-System reguliert. Auch in B. petrii konnte in den Untersuchungen eine negative Regulation der Flagellen- und Chemotaxisgene durch das BvgAS1,2-System unter diesen Bedingungen detektiert werden. Ob aber in B. petrii die gleiche hierarchische Struktur zur Regulation der Motilität besteht wie in B. bronchiseptica, bleibt zu untersuchen. Im Verlauf der Untersuchungen konnte dem BvgAS-Zwei-Komponentensystem in B. petrii auch eine Funktion im Energiestoffwechsel eingeräumt werden, um auf wechselnde Sauerstoffbedingungen reagieren zu können. Die Messung des Sauerstoffgehaltes der Umgebung und damit eine Regulation der aeroben bzw. anaeroben Atmung erfolgt in B. petrii wahrscheinlich ebenfalls über das BvgAS1,2-System. Die in der Histidinkinase BvgS1 vorhergesagte PAS-Domäne scheint laut den Analysen für diesen Vorgang von großer Bedeutung zu sein. Desweiteren scheint das System auch die Zusammensetzung der Cytochromoxidase zur optimalen Anpassung an aerobe, mikroaerophile und anaerobe Bedingungen zu regulieren. / The genus Bordetella phylogenetically grouped within the beta-subclass of Proteobacteria and belonging to the family of the Alcaligenaceae comprises to date nine gram negative species. The classical Bordetella species B. pertussis, B. parapertussis and B. bronchiseptica are integrated in the so called B. bronchiseptica-cluster. The obligate human pathogen B. pertussis, as the agent of whooping cough, is the most important member of the genus. B. parapertussis is the agent of respiratory diseases in humans and sheep, whereas B. bronchiseptica causes respiratory diseases in various mammalian species. In addition, B. bronchiseptica has the ability to survive in the environment for a certain period of time. The in recent years identified “new” Bordetella species, B. avium, B. hinzii, B. holmesii, B. trematum and B. ansorpii, have all been isolated in association with humans and animals and exhibit different pathogenic potential, which partly have to be examined further. An exception is the species B. petrii, which was isolated from an anaerobic dechlorinating bioreactor culture enriched by river sediment. Up to date B. petrii represents the first environmental isolate of the genus Bordetella (von Wintzingerode, Schattke et al. 2001). B. petrii encodes both for several orthologous genes to virulence factors of the pathogenic Bordetellae and also shows the typical features of environmental bacteria, it might represent some sort of evolutionary missing link. A putative virulence factor is the BvgAS-systems, which demonstrates to be the master regulator for virulence gene expression in the pathogenic Bordetellae, but in B. petrii this system built-on in a much more complex way. In B. petrii could be identified a response regulator bvgA, which is conserved on amino acid level, two histidine kinase genes, bvgS1 and bvgS2, and a separate gene for the hpt-domain. A periplasmatic sensing domain is missing in both kinases and a PAS-domain could only identified in BvgS1. In the recent years an increasing number of B. petrii isolates could be isolated from various habitats, for example the sponge isolate R521 (Sfanos, Harmody et al. 2005) and the clinical isolate from a patient with mandibular osteomyelitis (Fry, Duncan et al. 2005). In this work a PCR approach, with oligonucleotides derived from the B. petrii wildtyp sequence, was used to sequence the BvgAS1,2-system of the isolates but only in the clinical isolate an orthologous gene fragment of the Response Regulator bvgA could be identified. A detection of the histidine kinases or the hpt-domain failed in all investigated isolates. The comparative genome analysis with DNA-microarrays showed no further similarities and differences between the isolates and B. petrii DSM 12804 because of missing hybridization. B. petrii is a highly variable environmental bacterium capable of adapting to different living conditions. This could be demonstrated by isolation of three phenotypically distinguishable variants during a long-term growth experiment (Lechner 2008). By genome sequencing of B. petrii DSM 12804, at least seven genomic islands could be described (Gross, Guzman et al. 2008), which are responsible for the development of variants and therefore for the variability of B. petrii by different excision. During this study, the size of each genomic island of B. petrii could be confirmed by comparative genome analysis with DNA-microarrays with the exception of GI1, GI5 und GI6 compared to bioinformatic predictions. These islands showed an extension and reduction in the microarray analysis, respectively. The high instability of the genome of B. petrii DSM 12804 could also be demonstrated by microarray analysis of individual clones in this doctorate, which show variations in the area of the genomic island. The analysis of B. petrii 12804 ΔbvgA and ΔbvgAS, respectively, illustrate the specific manipulations in the BvgAS1,2 locus and additional deletions in the area of bpet0196-0200, bpet4219-4235 and bpet4176. The re-integration of these genes into genome after cloning of a BvgA complement thereupon points to that these areas build a plasmid structure. During this work this could not be confirmed and needs to be investigated exhaustively. In progress of the evolutionary development of the Bordetellae, the BvgAS-system, originally envolved in adaption to environmental conditions with different concentrations of oxygen and/or temperatures, was connected with the regulation of the virulence gene expression (von Wintzingerode, Gerlach et al. 2002). In the transcriptomic analysis to evaluate the functionality of the BvgAS1,2-system of B. petrii it could be proofed that the temperature is an important factor for the expression of the flagella and chemotaxis operon. In B. bronchiseptica, the motility is negatively regulated by the BvgAS-system by temperatures below 25°C. Also, a negative regulation of the flagella and chemotaxis genes was detected in the investigation of B. petrii under these conditions. If there is the same hierarchic structure of the regulation of the motility in B. petrii like in B. bronchiseptica may be investigated. During the investigations the BvgAS two-component-system of B. petrii could admit a function in the respiratory control to respond to changing oxygen conditions. The sensing of the environment´s oxygen content and a regulation of the aerobic and anaerobic respiration, respectively, can be awarded to the BvgAS1,2-system in B. petrii. The predicted PAS-domain in the histidine kinase BvgS1 are obviously important during this process according to the analysis. In addition, the system seems to regulate the composition of the cytochrome oxidase well for optimal adaption to aerobic, microaerophilic and anaerobic environmental conditions.

Bisher sind zwei Isoformen des humanen CD23 (CD23a und CD23b) beschrieben. Beide unterscheiden sich lediglich in 6-7 Resten im N-terminalen, zytoplasmatischen Anteil. CD23a wird ausschließlich auf B-Zellen exprimiert, während CD23b sowohl auf B-Zellen als auch auf Monozyten, eosinophilen Granulozyten, Makrophagen und zahlreichen anderen Zelltypen durch Stimulation mit IL-4 induziert werden kann. Die beiden Isoformen vermitteln wahrscheinlich unterschiedliche Funktionen. CD23a gilt als Isoform, welche vornehmlich mit der Endozytose von IgE-Immunkomplexen und der Vermittlung von Antigen-Präsentation auf B-Zellen assoziiert ist. CD23b besitzt ein Phagozytose-Motiv und scheint bei der Phagozytose IgE besetzter Partikel, der Freisetzung von Zytokinen und der Bildung von Peroxiden eine Rolle zu spielen. Frühere Untersuchungen legen die Vermutung nahe, dass die beiden Isoformen zwei getrennte Signalübertragungswege miteinander verbinden. Die Gegenüberstellung von Ereignissen, welche in Zellen, die nur eine einer oder beide Isoformen von CD23 besitzen, stattfinden, legt die Vermutung nahe, dass CD23b cAMP und iNOS hochreguliert, wohingegen CD23a einen Anstieg des intrazellulären Kalziums vermittelt. Im ersten Teil unserer Untersuchungen haben wir die Regulation der B-Zell-spezifischen Expression von CD23a analysiert. Pax-5 ist ein auf B-Zellen beschränkter Transkriptionsfaktor, welcher für die frühe und späte B-Zellentwicklung von entscheidender Bedeutung ist. Mögliche Pax-5 Bindungsstellen wurden in den proximalen Abschnitten des CD23a Promotors vermutet. Die Analyse des CD23a Promotors ergab drei mutmaßliche Pax-5 Bindungsstellen mit mehr als 50% Homologie zur Konsensus-Sequenz. Eine dieser Bindungsstellen, namens CD23-1, kann mit einer hochaffinen Pax-5 Bindungsstelle konkurrieren oder direkt das Pax-5 Protein in Elektromobilitäts Experimenten (EMSA) binden. Das Einfügen von Mutationen an dieser Stelle verhindert die Bindung. Ein weiterer Versuch, bei dem die gesamte Länge des CD23a Promotors durch überlappende Peptide in einem kompetitiven Verfahren gegenüber hoch affinen Bindungsstellen getestet wurde, zeigt ebenso CD23-1 als die einzige Stelle, welche direkt Pax-5 binden kann. In weiteren Experimenten führte die Expression von Pax-5 in 293 Zellen zu einer 7fachen Aktivierung eines CD23a Kernpromotor Konstrukts. Die Kotransfektion zusammen mit STAT6 zeigte, dass Pax-5 mit diesem Transkriptionsfaktor kooperiert, indem es die Transkriptionsrate eines vergrößerten CD23a Promotorkonstrukts erhöht. Von besonderer Bedeutung ist die Tatsache, dass die ektope Expression von Pax-5 in der monozytären Zelllinie U-937, die normalerweise nur die CD23b Isoform exprimiert, dann zu einer Expression von CD23a nach Stimulation mit IL-4 und PMA führte. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass Pax-5 in der auf B-Zellen beschränkten Expression der CD23 Isoform eine Schlüsselrolle zukommt. Im zweiten Teil des Projekts haben wir ein “Zwei-Hefen-Hybrid-System“ (Cyto-Trap von Stratagene) verwendet, um nach zytoplasmatischen Interaktionspartnern für den CD23 Rezeptor zu suchen. Das System wurde modifiziert um eine hohe Effizienz an Transformation zu erzielen. Unterschiedliche „Köder“-Vektorkonstrukte wurden hergestellt. Das Screening wurde mittels einer humanen Milzbibliothek mit dem Zielvektor des Systems durchgeführt. Die anfangs benutzten Konstrukte –pSosCD23a und pSosCD23b – exprimierten sehr kurze (22 Aminosäuren) zytoplasmatischen Reste der Isoformen am C-terminalen Ende des Fusionsproteins (humanes SOS). Verbesserte Konstrukte (pSos CD23a+Linker und pSosCD23b+Linker) exprimierten den zytoplasmatischen Anteil von CD23a/b am N-terminalen Ende des humanen SOS und hatten folglich den N-terminalen Anteil als Andockstelle frei, entsprechend den Bedingungen in vivo. Eine flexible Verbindungsregion trennte die Fusionsproteine, um auf diese Weise die kurze Aminosäurekette deutlich „sichtbar“ werden zu lassen. Annähernd drei Millionen Klone wurden mittels der verschiedenen Konstrukte untersucht. Dabei konnte keine tatsächlich positive Interaktion gefunden werden. Stattdessen fand sich eine vergleichsweise hohe Zahl falsch-positiver Klone. Diese wiederum wurden in einem zweiten “Zwei-Hefen-Hybrid-System“ getestet. In Zukunft wird ein neues Konstrukt als Köder verwendet werden. Hierbei wurde ein Tyrosin-Rest im zytoplasmatischen Anteil von CD23a durch Glutamat ersetzt. Das System wurde bereits dazu verwendet, die Interaktion zwischen CD23 und p59fyn - einem Mitglied der Src-Familie von Proteinkinasen, welches mit CD23a assoziiert sein soll – zu testen. Jedoch konnte im CytoTrap “Zwei-Hefen-Hybrid-System“ keine Wechselwirkung nachgewiesen werden. Zusammenfassend zeigt das zentrale Ergebnis der Arbeit, dass Pax-5 der Schlüsselregulator ist, der die B-Zell-spezifische Expression von CD23a ermöglicht. Zusätzlich wurde ein “Zwei-Hefen-Hybrid-System“ etabliert, mit dem zytoplasmatische Interaktionspartner für die CD23 Isoformen gefunden werden können. / Two isoforms of human CD23 (CD23a and CD23b) have been described. They differ by only 6-7 residues in the N-terminal cytoplasmic tail. CD23a is restrictively expressed on B-cells while CD23b is inducible on B-cells, as well as monocytes, eosinophils, macrophages and a variety of other cell types, after IL-4 stimulation. The two isoforms seems to have different functions. CD23a appears to be the isoform associated with endocytosis of IgE immune complexes and mediating antigen presentation on B-cells. CD23b has a phagocytosis motif and seems to be involved in the phagocytosis of IgE-coated particles, cytokine release and the generation of superoxides. Previous studies indicate that the two isoforms connect to different signal transduction pathways. Comparing the cells that express only one or both CD23 isoforms suggests that CD23b is involved in upregulating cAMP and iNOS, whereas CD23a mediates an increase in intracellular calcium. In the main part of the study we investigated how the CD23a B-cell specific expression is regulated. Pax-5 is a B-cell restricted transcription factor with an essential role in early and late B-cell development. Putative Pax-5 binding sites have been predicted in the CD23a proximal promoter. Analyses of the CD23a promoter revealed three putative Pax-5 binding sites with more than 50% homology to the consensus sequence. One of these sites, named CD23-1 can compete a high affinity Pax-5 binding site or can directly bind Pax-5 protein in electrophoretic mobility shift assays. Introducing mutations into this site abrogates the binding. A different approach, in which overlapping peptides covering the length of the CD23a promoter were tested in competition assays against a high affinity binding site, also revealed CD23-1 as the only site that directly binds Pax-5 protein. Expression of Pax-5 in 293 cells resulted in a 7-fold activation of a CD23a core promoter construct. Co-transfection together with STAT6 showed that Pax-5 cooperates with this transcription factor in enhancing the level of transcription of a CD23a extended promoter construct. Most importantly, ectopic expression of Pax-5 in the monocytic cell line U-937 that regularly expresses only the CD23b isoform enabled a significant CD23a expression after stimulation with IL-4 and PMA. Our results suggest that Pax-5 is a key regulator of the B-cell restricted expression of the CD23a isoform. In the second part of the project, we used a yeast two-hybrid system (CytoTrapTM from Stratagene) in order to look for cytoplasmic interaction partners for the CD23 receptor. The system was established in order to reach a high efficiency of transformation and different bait vector constructs were made. The screening was performed using a human spleen library cloned in the target vector of the system. The first bait constructs used (pSosCD23a and pSosCD23b) expressed the very short (22 amino acids) cytoplasmic tails of the isoforms at the C-terminal end of the fusion protein (human SOS). Improved bait constructs, (pSosCD23a+Linker and pSos CD23b+Linker) expressed the cytoplasmic tail of CD23a/b at the N-terminal side of the human SOS and had in consequence the N-terminal part free as a bait, as it occurs in vivo. A flexible linker region separated the fusion proteins in order to make the small amino acid bait chain more obvious. Approximately three million library clones were screened with these various constructs. No “true positive” interaction was detected. A relatively high number of “false positive” clones were obtained and checked in another two-hybrid system. A new bait construct, in which the tyrosine residue in the cytoplasmic tail of CD23a was replaced by a glutamic acid residue will be used for future screening. The system was also used in order to test the interaction between CD23 and p59fyn, a member of the Src family of protein kinases that was mentioned to associate with CD23a. No interaction was detected by using the CytoTrap two-hybrid system. In conclusion, the key result of the study demonstrates that Pax-5 is a main regulator of the B-cell specific expression of the CD23a isoform. In addition, a two-hybrid system was established and employed in order to look for cytoplasmic interaction partners for CD23.

Enterokokken gelten primär als opportunistische Erreger mit geringer Pathopotenz. Sie zeichnen sich allerdings durch ausgeprägte natürliche und erworbene Resistenzen gegen eine Vielzahl von Antibiotika aus. Besorgniserregend ist hierbei insbesondere das Auftreten von Vancomycin-resistenten Enterokokken. Glycopeptidantibiotika, wie Vancomycin und Teicoplanin, werden als Reserveantibiotika gegen multiresistente gram-positive Erreger, wie zum Beispiel Methicillin-resistente Staphylococcus aureus-Stämme (MRSA) eingesetzt. Der VanA-Typ der Glycopeptidresistenz, welcher zuerst in Enterococcus faecium beschrieben wurde, ist die in Zentraleuropa vorherrschende Variante der Glycopeptidresistenz. Das Transposon Tn1546, das die vanA-Resistenzdeterminante kodiert, liegt häufig auf großen konjugativen Plasmiden vor und kann zwischen Enterokokken-Stämmen transferiert werden. In dieser Arbeit wurde der direkte Einfluss von Vancomycin und eines weiteren Antibiotikums, Flavophospholipol (FPL), auf die Rate des konjugativen Transfers des vanA-Operons in E. faecium untersucht. Das Phosphoglycolipidantibiotikum FPL wird derzeit als Leistungsförderer in der Tiermast eingesetzt. Beide Antibiotika induzieren die Expression der Glycopeptidresistenz vom VanA-Typ. Es konnte gezeigt werden, dass Flavophospholipol in unterschiedlichen Konzentrationen die Häufigkeit des Transfers von konjugativen VanA-Plasmiden sowohl in klinischen E. faecium-Isolaten, als auch in E. faecium-Stämmen aus Tierfaeces signifikant hemmte. Vancomycin zeigte keinen signifikanten Effekt auf die Transferrate der VanA-Plasmide. Somit konnte nachgewiesen werden, dass in E. faecium kein funktionaler Zusammenhang zwischen der Induktion des vanA-Operons durch Vancomycin und FPL und der Transferfrequenz der konjugativen VanA-Plasmide unter dem Einfluss der beiden Antibiotika besteht. Weiterhin wurde die Induktion des vanA-Operons unter dem Einfluss verschiedener Antibiotika in einem E. faecium-Isolat näher untersucht. Hierbei wurde die Expression des 39 kDa VanA-Ligase Proteins direkt durch das Western Blot-Verfahren dargestellt. Eine Induktion der Expression des VanA-Ligase Proteins erfolgte durch Inhibitoren der späten Phase der Zellwandsynthese, wie Vancomycin, Flavophospholipol, Bacitracin und Tunicamycin. Außerdem konnte eine leichte Induktion des VanA-Ligase Proteins durch Fosfomycin, Cefalexin und Cefuroxim, Meropenem und Clindamycin nachgewiesen werden. Somit konnte gezeigt werden, dass Cefuroxim und Clindamycin zwei Antibiotika, die in klinischen Studien eine Besiedelung mit VRE begünstigen, auch eine geringe Zunahme der VanA-Ligase Expression bewirken. Zudem wurde deutlich, dass durch den Einfluss von Hitzestress und osmotischem Stress keine Induktion der 39 kDa VanA-Ligase Bande erfolgt. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung einer putativen Resistenz-determinante gegen Flavophospholipol. Die Eigenschaft der FPL-Resistenz konnte nicht durch in vitro-Filterkonjugation von FPL-resistenten auf FPL-sensitive E. faecium-Stämme übertragen werden. Zur molekularen Untersuchung der Resistenz gegen Flavophospholipol wurde ein resistenter E. faecium-Stamm durch das konjugative Transposon Tn916 mutagenisiert. In allen identifizierten FPL-sensitiven Mutanten war die Insertionstelle des Transposons und dessen Orientierung im Chromosom identisch und es deletierte ein 1,5 kb großer genomischer Bereich „downstream“ der Transposon-Insertionsstelle. Dieser Bereich umfasste das 3´-Endes des Gens für eine putative Threonyl-tRNA Synthetase und den Genlocus für einen putativen Transkriptionsregulator. Die Sequenzen in allen Mutanten begannen ca. 200 bp vor dem Startcodon eines Gens für ein putatives Penicillin-Bindeprotein (PBP). In Northern Blot-Analysen konnte gezeigt werden, dass die Transkription des putativen PBP in der Mutante 64/3-1 schwächer war als im Wildtyp 64/3. Außerdem wurden durch &#61531;3H&#61533; Penicillin-Markierung von PBP-Extrakten Unterschiede im Expressionsmuster der Penicillin-Bindeproteine im Wildtyp und in der Mutante deutlich. Während im Wildtyp fünf Penicillin-Bindeproteine zu erkennen waren, fehlten PBP2 und PBP3 in der Mutante 64/3-1. Die Größe von PBP3 entsprach hierbei der geschätzten Größe des putativen PBP von 79 kDa. In der Mutante 64/3-1 fand wahrscheinlich durch den Verlust eines putativen Regulators oder wichtiger regulatorischer Bereiche eine Veränderung im Expressionsmuster der Penicillin-Bindeproteine statt, welche zum FPL-sensitiven Phänotyp führte. In dieser Arbeit konnte zudem gezeigt werden, dass Flavophospholipol in E. faecium an PBP2 und PBP3 bindet und es sich hierbei um bifunktionale „high molecular weight“ Penicillin-Bindeproteine mit Transglycosylase- und Transpeptidase-Untereinheit handeln muss. / Enterococci are primary opportunistic pathogens. Species of this genus are inherently resistant to many antimicrobial agents and readily acquire additional resistances, which is likely the reason why enterococci have become prominent nosocomial pathogens. Glycopeptides, such as vancomycin and teicoplanin are the antibiotics of last resort for the treatment of methicillin-resistant staphylococci (MRSA). In Central Europe, the VanA-type is the most frequent genotype of acquired glycopeptide resistance. The vanA gene cluster is located on transposons of the Tn1546 type, which are integrated into conjugative plasmids, and can therefore be transferred among enterococcal strains. In this study, the influence of vancomycin and flavophospholipol (FPL) on the conjugative transfer of vanA plasmids was determined in several Enterococcus faecium strains. FPL is a phosphoglycolipid antibiotic used as a growth promoter in animal husbandry. Both antibiotics have an inducing effect on the vanA operon. We showed that subinibitory concentrations of FPL inhibit the tranfer of vanA plasmids. This inhibitory effect is dose-dependend and was observed both in clinical and animal isolates of E. faecium. Vancomycin had no significant effect on the transfer rate of vanA plasmids. These results suggest that there is no functional link between the induction of vancomycin resistance of VanA-type and the frequency of transfer of conjugative vanA plasmids in E. faecium. Furthermore, the influence of some antibiotics on the VanA ligase protein expression was examined by Western-blotting analysis. Induction of the 39 kDa protein could be detected after addition of some cell-wall active agents such as vancomycin, flavophospholipol, bacitracin and tunicamycin. Fosfomycin, cefalexine and cefuroxime as well as meropenem and clindamycin had a weaker inducing effect on the VanA ligase protein expression. Heat- and osmotic stress had no effect on the expression of the VanA ligase. A further objective of this study was the identification of a putative Flavophospholipol resistance determinant. Transfer of the FPL resistance between E. faecium strains could not be detected in filter mating experiments. For the molecular analysis of the Flavophospholipol resistance an insertional mutagenesis was carried out in a FPLr E. faecium strain using the conjugative transposon Tn916. The chromosomal insertion sites of the transposon were identical in all identified mutants with a 1.5 kb sequence deletion downstream of Tn916. Sequence analysis of the deleted area revealed homolgy to the 3´-end of a putative threonyl-tRNA synthetase gene and the gene of a putative regulator. The sequences in all mutants began about 200 bp upstream of the startcodon of a putative penicillin-binding protein (PBP) gene. The transcription of this penicillin-binding protein was weaker in the transposonmutant 64/3-1 than in the wildtype 64/3 as could be shown by Northern hybridisation. Further, binding-studies using &#61531;3H&#61533; penicillin showed differences in the expression pattern of the penicillin-binding proteins between wildtype and mutant 64/3-1. The wildtype contained five PBP, while PBP2 and PBP3 where not marked in mutant 64/3-1. The size of PBP3 corresponds with an estimated size of the putative penicillin-binding protein of 79 kDa. This results suggest that the change in the penicillin-binding protein expression pattern of FPLs mutant 64/3-1 may be caused by the loss of a putative regulator or an important regulatory sequence. The PBP studies also show that FPL binds to PBP2 and PBP3 in E. faecium and these are likely bifunctional high molecular weight penicillin-binding proteins with transglycosylase- and transpeptidase-modules.

Helicobacter pylori ist ein an seine ökologische Nische hochgradig angepasstes Bakterium, das den Magen von mehr als 50% der Weltbevölkerung chronisch besiedelt. Bei 10 bis 20% der Infizierten können schwerere Krankheitsverläufe von Magengeschwüren bis hin zu Karzinomen auftreten. Die Chemotaxis-gesteuerte Motilität von H. pylori, vermittelt durch ein Bündel von 2-8 polaren Flagellen, ist für die Besiedelung und persistente Infektion des Wirtes essenziell. Mehr als 40 Komponenten des Flagellen- und Chemotaxissystems konnten mit Hilfe der beiden sequenzierten H. pylori-Genome identifiziert werden, wobei die Gene einzeln oder in kleinen transkriptionellen Einheiten über das gesamte Genom verteilt angeordnet sind. Mit der vorliegenden Arbeit sollte die Organisation und Vernetzung der transkriptionellen Regulation der Flagellenbiogenese und mögliche Querverbindungen zu anderen zellulären Funktionen in H. pylori umfassend charakterisiert werden. H. pylori verfügt über zwei unterschiedliche Flagellingene, flaA und flaB, deren Transkription von den beiden alternativen Sigma-Faktoren Sigma28 und Sigma54 kontrolliert wird. Um die transkriptionelle Regulation der beiden Gene in zwei unterschiedlichen Flagellenregulons zu untersuchen, wurde die Genexpression von flaA und flaB abhängig von der Wachstumsphase analysiert. Mit flaA- und flaB-Promotorfusionen wurde hier erstmalig ein sensitives, Biolumineszenz-basiertes Reportersystem für Expressionsstudien in H. pylori etabliert und genutzt. Die Transkriptmengen der beiden Flagellingene wurden weiterhin direkt mittels Northern Blot-Hybridisierungen und RT-PCR bestätigt. Es ergab sich eine Wachstumsphasen-abhängige, differentielle Regulation, bei der in Übereinstimmung mit der strukturellen Anordnung der Flagelline im Filament und der Zugehörigkeit der Gene zu zwei Regulationsklassen, das Verhältnis der flaA- zur flaB-Expression im Verlauf der Wachstumskurve stark anstieg. Um genomweite Analysen durchführen zu können, wurde in dieser Arbeit zunächst eine Plattform zur Untersuchung von H. pylori mit DNA-Microarrays etabliert. Hierzu wurde in Kooperation mit dem Max-Planck-Institut für Infektionsbiologie in Berlin ein PCR-Produkt-Microarray mit 1590 H. pylori-spezifischen Sonden produziert. Zusätzlich wurde ein industriell gefertigter, Oligonukleotid-basierter, H. pylori-Microarray erstmalig verwendet und validiert. Mit Hilfe der Microarray- Technologie wurden verschiedene zentrale Regulatoren der H. pylori-Flagellenbiogenese zum ersten Mal auf genomweiter Ebene untersucht. Hierzu zählten die beiden alternativen Sigma-Faktoren FliA und RpoN, der Anti-Sigma28-Faktor FlgM, das RpoN-spezifische Zwei-Komponenten System FlgS/FlgR und die Flagellen-Basalkörperkomponenten FlhA und FlhF. Bis auf die fliA- und flgM-Mutanten, die, in Übereinstimmung mit ihrer antagonistischen Funktion, Stummelflagellen bzw. eine leicht erhöhte Flagellenzahl aufwiesen, bewirkten die Mutationen in allen anderen untersuchten Genen einen flagellenlosen unbeweglichen Phänotyp. Die Klassen 2 und 3 des H. pylori-Flagellenregulons konnten durch die Analysen des FliA- und des RpoNRegulons neu definiert und um zehn neue Gene ergänzt werden. Für FlhA und FlhF konnte eine Funktion als übergeordnete Regulatoren der Klassen 2 und 3 des Flagellenregulons gezeigt werden. Des Weiteren wurden 24 Gene einer neuen regulatorischen Zwischenklasse zugeordnet. Diese Gene werden von mehr als einem Promotor kontrolliert und umfassen Flagellen- sowie Nicht-Flagellengene. Durch globale Untersuchungen von Doppelmutanten wurde die komplexe Einbindung des Anti-Sigma-Faktors FlgM in die FlhA- und FlhF-vermittelte transkriptionelle Rückkopplung nachgewiesen. Basierend auf den Ergebnissen der Arbeit konnte ein neues Modell der Regulation der Flagellenbiogenese für H. pylori entwickelt werden. Es beinhaltet drei regulatorische Genklassen mit einer intermediären Klasse, die von den drei H. pylori-Sigma-Faktoren Sigma80, Sigma54 und Sigma28 zusammen mit den assoziierten Regulatoren FlgS/FlgR und FlgM kontrolliert werden. FlgM vermittelt als Anti-Sigma28-Faktor die transkriptionelle Rückkopplung auf die Klasse 3- und, im Zusammenspiel mit FlhA, auch auf die Klasse 2-Flagellengene. FlhF kontrolliert die Expression der Klasse 2-Flagellengene durch einen FlgM-unabhängigen, bislang ungeklärten Mechanismus. Die Sigma80-abhängigen Klasse 1-Flagellengene werden, anders als bei vielen anderen Bakterien, mit Stoffwechselgenen koreguliert und beinhalten auch die Flagellenmotor- und Chemotaxisgene. Dies spiegelt die Anpassung von H. pylori an seine spezifische ökologische Nische wieder, mit der Notwendigkeit, während der gesamten Infektion die Motilität aufrecht zu erhalten. / The gastric human pathogen Helicobacter pylori is a fastidious bacterium, chronically colonizing the stomach of more than half of the world population, leading to severe diseases in some individuals such as ulcers or gastric cancer. H. pylori flagella-driven motility has been shown to be essential for the initial colonization of the human gastric mucosa and for the long-term persistence of the infection. The 2-8 flagella are arranged at one pole of the bacterium and covered by a membranous sheath. The flagella and chemotaxis system comprises more than forty genes. In contrast to the highly ordered gene organization in other organisms, they are scattered along the genome. The aim of this study was to comprehensively characterize the network of transcriptional regulation of flagellar biogenesis with possible links to other cell functions in H. pylori. H. pylori possesses two different flagellin genes, flaA and flaB, the transcription of the corresponding genes is controlled by sigma28 and sigma54 promoters respectively. To characterize the specific transcriptional regulation of these flagellar genes, which belong to two different regulons, transcript levels were monitored throughout the growth curve of H. pylori. A bioluminescence-based reporter gene system was successfully established in H. pylori for the first time. It was utilized to measure the activity of the newly constructed flaA- and flaB-promoter fusions. Furthermore growth-phase dependent transcript levels of the two flagellin genes were confirmed by Northern blot hybridizations and RT-PCR analysis. The results revealed a growthphase dependent differential transcriptional control of flaA and flaB in H. pylori. In agreement with the structural succession of FlaB and FlaA in the filament, as well as the affiliation of the genes to different flagellar regulons, flaA to flaB expression ratio was strongly increasing with the progression of the growth curve. An H. pylori microarray working platform was established to be able to perform genome-wide analyses on this organism. A custom made PCR-product microarray with 1590 H. pylori specific probes was constructed in cooperation with the Max-Planck-Institute for Infection Biology in Berlin. In addition, a commercially available H. pylori-specific oligonucleotide based microarray system was utilized for the first time and validated. By using the microarray technology, a set of different key regulators of the H. pylori flagellar system was analysed on a genome-wide scale for the first time. They are comprising the alternative sigma factors FliA and RpoN, the anti-sigma-factor FlgM, the RpoN specific two component system FlgS/R and the components of the flagellar basal body, FlhA and FlhF. While the fliA mutant revealed a phenotype with truncated flagella, the flgM mutant had a slightly enhanced number of flagella, correlating with their antagonistic function. Mutations in all other regulators lead to loss of flagella and motility. Based on the microarray analyses of the FliA and RpoN regulons, the flagellar regulatory classes 2 and 3 could be newly defined and enlarged by ten additional genes. The microarray studies on early flagellar components revealed a role for FlhA and FlhF as functional equivalents to master regulators. They are governing the transcription of flagellar regulatory classes 2 and 3 and a newly defined intermediate regulon. The latter comprised 24 flagellar and non-flagellar genes controlled by more than one promoter. Furthermore, studies on double mutants of the early regulators with the flagellar antisigma factor FlgM provided evidence for the complex regulatory interconnection of this factor with the determined flagellar feedback regulation of FlhA and FlhF. Based on the results of this study, a revised model of regulation pathways of flagellar biogenesis in H. pylori could be constructed. It is composed of three regulatory classes of flagellar genes and one intermediate class, governed by the three H. Pylori specific sigma factors sigma80, sigma54 and sigma28 and the associated regulators FlgS/R and FlgM. The transcriptional feedback regulation on class 3 genes is mediated by the anti-sigma factor FlgM, which is also involved in FlhA-dependent transcriptional control of class 2 flagellar genes. FlhF-dependent transcriptional control on class 2 genes is independent from FlgM. In contrast to other organisms, flagellar class 1 genes in H. pylori include flagellar motor and chemotaxis components and are coregulated with housekeeping genes. This coincides with the specific ecological adaptation of H. pylori to its niche and the necessity for the pathogen to be continuously motile to maintain a persistent infection.