Darmstadt, Techn. Univ., Diss., 2002.

Universiẗat, Diss., 2000--Dortmund. / Dateiformat: PDF.

University, Diss., 2004--Köln.

Techn. Hochsch., Diss., 2005--Aachen.

CD97, ein Mitglied der Adhäsions-G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (adhesion-GPCR), wird auf hämatopoetischen, muskulären und epithelialen Zellen exprimiert. Humanes und murines CD97 zeigen ein vergleichbares Expressionsmuster. Funktionell ist CD97 an Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen, der Kanzerogenese und der Migration von Tumorzellen beteiligt. Um die molekulare Regulation von CD97 zu untersuchen, wurde der murine (m)CD97 Promotor charakterisiert. Unter verschiedenen murinen Zelllinien zeigten RAW264.7 (Makrophage), C2C12 (Myoblast) und C3H10T1/2 (Fibroblast) eine starke CD97 Expression. Der Transkriptionsstartpunkt des murinen (m)Cd97 Gens wurde -46bp upstream des ATG Startcodons lokalisiert. Es wurden Promotorplasmide hergestellt, welche aus verschieden langen Fragmenten der 5’ untranslatierten Region (5‘ UTR) von mCd97 und dem Reportervektor pGL3-Basic (pGL3) bestehen. Nach transienter Transfektion in die Zelllinien wurde mit einem Luziferasereportergenassay die Luziferaseaktivität bestimmt und damit der Nukleotidbereich -78 bis +29 bp der 5‘ UTR als minimaler Promotor definiert. Die evolutionär konservierten Nukleotide CACTT (-93/-89) konnten mittels Mutationsanalyse in den Zelllinien RAW264.7, C2C12 und C3H10T1/2 als aktivierende Sequenz im mCD97 Promotor identifiziert werden. Mit Hilfe vergleichender Bioinformatik und electrophoretic mobility shift assay (EMSA) gelang es nicht, den hier bindenden Transkriptionsfaktor zu bestimmen. In C2C12 zeigte die Differenzierung vom Myoblasten zum Myozyten eine Regulation von mCD97. Durch EMSA wurde in vitro die Bindung des serum response factor (SRF) an ein CArG-Element innerhalb der 5‘ UTR nachgewiesen. Zusammengefasst wurde der mCD97 Promotor erstmalig beschrieben und der Einfluss von SRF auf die mCD97 Expression in C2C12 nachgewiesen.

In this dissertation, the author describes the creation of a basic bioinformatic model of human enamel maturation. Supported by the interactions found in the KEGG Pathway database, we were able to establish a gene regulatory network (GRN) that focuses primarily on the signal transduction pathways apoptosis, cell cycle, hedgehog signaling pathway, MAP kinase pathway, mTOR signaling pathway, Notch signaling pathway, TGF-β signaling pathway and Wnt signaling pathway. We extended this through further verified interactions and implicated the tooth-specific genes AMELX, AMELY, AMBN, ENAM and DSPP. In the subsequent simulation of the network by the simulation tool Jimena, six stable states could be identified. These are examined in more detail and juxtaposed with results of a GEO dataset. The long-term goal is to draw conclusions about the odontogenesis of humans through consistent optimization of the bioinformatics network. / In dieser Dissertation beschreibt der Autor die Erstellung eines grundlegenden bioinformatischen Modelles der menschlichen Zahnschmelzreifung. Mithilfe der KEGG Pathway-Datenbank wurde ein genregulatorisches Netzwerk (GRN) erstellt, welches maßgeblich auf den Signaltransduktionswegen Apoptose, Zellzyklus, Hedgehog-Signalweg, MAP-Kinase-Weg, mTOR-Signalweg Notch-Signalweg Signalweg, TGF-β-Signalweg und Wnt-Signalweg basiert. Im Weiteren wurde dieses Netzwerk durch zahlreiche verifizierte Wechselwirkungen erweitert und die zahnspezifischen Gene AMELX, AMELY, AMBN, ENAM und DSPP implementiert. In der anschließenden Simulation des Netzwerks mit dem Simulations-Tool Jimena konnten sechs stabile Zustände identifiziert werden. Diese wurden genauer untersucht und den Erkenntnissen eines GEO-Datensatzes gegenübergestellt. Langfristiges Ziel ist es, durch konsequente Optimierung des bioinformatischen Netzwerks Rückschlüsse auf die Odontogenese des Menschen zu ziehen.

Meine Arbeit beschäftigt sich mit der Rekonstruktion genregulatorischer Netze, um die Funktionalität von Organismen und ihre Reaktionen auf die vielfältigen externen Einflussfaktoren besser zu verstehen. Die Analyse kurzer, zeitaufgelöster Daten mit Hilfe von Assoziationsmaßen kann dabei erste wesentliche Einblicke in mögliche Wechselwirkungskreisläufe liefern. In einer umfangreicher Vergleichstudie untersuche ich die Effizienz der Netzwerkrekonstruktion bei der Anwendung verschiedener Maße und Bewertungsschemata. Weiterhin führe ich IOTA (inner composition alignment) als ein neues asymmetrisches, permutationsbasiertes Ähnlichkeitsmaß ein, welches ein effektives Werkzeug zur Rekonstruktion gerichteter Netzwerke ohne die Verwendung zusätzlicher Bewertungsschemata darstellt. In meiner Arbeit betrachte ich verschiedene Modifikationen dieses Maßes und untersuche deren Eigenschaften. Dabei zeige ich, dass IOTA geeignet ist, um statistisch signifikante gerichtete, nichtlineare Kopplungen in verschiedenen Zeitreihen (autoregressive Prozesse, Michaelis-Menten Kinetik und chaotische Oszillatoren in verschiedenen Regimen) und Autoregulation zu untersuchen. Weiterhin erlaubt IOTA, ebenso wie die Korrelationsmaße, die Spezifizierung des Types der Regulation (Aktivierung oder Repression), was es zu dem einzigen Maß macht, dass die Ableitung aller für die Rekonstruktion genregulatorischer Netzwerke erforderlichen Kenndaten ermöglicht. Schließlich nutze ich das neuen Ähnlichkeitsmaß IOTA, um ein genregulatorisches Netzwerk für die Grünalgenart Chlamydomonas reinhardtii unter Kohlenstoffmangel aus experimentellen Daten abzuleiten. / My thesis is about reconstructing gene regulatory networks in order to better understand the functionality of organisms and their reactions to various external influences. In this context, the analysis of short, time-resolved measurements with association measures can yield crucial insights into possible interactions. In an extensive comparison study, I examine the efficiency of different measures and scoring schemes for solving the network reconstruction problem. Furthermore, I introduce IOTA (inner composition alignment), a novel asymmetric, permutation-based association measure, as an efficent tool for reconstructing directed networks without the application of additional scoring schemes. In my thesis, I analyze the properties of various modifications of the measure. Moreover, I show that IOTA is valuable to study significant, directed, nonlinear couplings in several time series (autoregressive processes, Michaelis-Menten kinetics and chaotic oscillators in different dynamical regimes) , as well as autoregulation. In addition, IOTA, similar to correlation measures, permits to identify the type of regulation (activation or repression). Hence, it is the only measure that can determine all necessay characteristics when reconstruction regulatory networks. Finally, I apply the novel association measure IOTA to infer a gene regulatory network for the green algae Chlamydomas reinhardtii under carbon deprivation from experimally obtained data.

YB-1, ein Y-Box-Protein in Säugerzellen, konnte sowohl im Zytoplasma als auch in den Zellkernen von HeLa-Zellen nachgewiesen werden. Es wurde eine Abhängigkeit der intrazellulären Lokalisation von YB-1 vom Verlauf des Zellzyklus beobachtet. In jeder Phase des Zellzyklus war YB-1 im Zytoplasma zu finden. Eine Kernlokalisation von YB- 1 konnte nur in den HeLa-Zellen festgestellt werden, die sich im Übergang von der G1- in die S-Phase oder in der frühen S-Phase des Zellzyklus befanden. Die Abhängigkeit der Lokalisation von YB-1 vom Verlauf des Zellzyklus unterstützt die These, daß YB-1 und andere Y-Box-Proteine an der Regulation der Zellproliferation beteiligt sind. Es wurden verschiedene Proteine identifiziert, die im Zytoplasma von HeLa-Zellen mit YB-1 assoziiert vorkommen. Alle identifizierten Proteine erfüllen Aufgaben im RNA-Metabolismus, was auf eine Beteiligung dieser Proteinkomplexe an der Regulation der mRNA hinweist. Die Interaktion von P32/SF2 (P35) mit YB-1 erwies sich als abhängig vom Zellzyklus, wobei eine maximale Assoziation dieser beiden Proteine beim Übergang der HeLa-Zellen von der G1- in die S-Phase zu beobachten war. In Multidrug-resistenten MCF7/ADR-Zellen konnte eine deutlich verstärkte Interaktion von P32/SF2 mit YB-1 im Vergleich zu den sensitiven MCF7-Zellen festgestellt werden. Im Zytoplasma von HeLa-Zellen konnte YB-1 in Verbindung mit membrangebundenen Polysomen nachgewiesen werden. Eine Assoziation von YB-1 mit freien oder zytoskelettgebundenen Polysomen konnte nicht festgestellt werden. Damit wurde erstmalig gezeigt, daß YB-1 eine Spezifität für eine bestimmte Gruppe von Polysomen besitzt. Die Assoziation mit membrangebundenen Polysomen legte die Vermutung nahe, daß YB-1 an der Translationskontrolle von Polypeptiden beteiligt ist, die am rauhen endoplasmatischen Retikulum synthetisiert werden. Es konnte gezeigt werden, daß YB-1 die Translation von P-Glykoprotein, einem integralen Membranprotein, positiv reguliert. Ein Einfluß auf die Translation der untersuchten sekretorischen Proteine (a-Faktor und Präprolactin) konnte nicht beobachtet werden. Diese Ergebnisse belegen, daß YB-1 ein spezifischer Regulator der Translation bestimmter Membranproteine ist. Am Hand von P-Glykoprotein konnte des weiteren demonstriert werden, daß YB-1 sowohl die Transkription als auch die Translation dieses Proteins positiv reguliert. Die in den Zellkulturen beobachtete Korrelation von YB-1 mit der Expression von P-Glykoprotein konnte auch in primären Mammakarzinomen nachgewiesen werden. Somit ist YB-1 ein entscheidender Faktor bei der Ausbildung einer intrinsischen multiplen Resistenz von Mammakarzinomen gegen die Behandlung mit Chemotherapeutika. Aus diesem Grunde könnte YB-1 einen Ansatzpunkt für die künftige Diagnose und Therapie von Mammakarzinomen und eventuell auch von anderen Tumoren bieten. / YB-1, a mammalian Y-box protein was detected in the cytoplasm as well as in the nuclei of HeLa cells. The intracellular localisation of YB-1 depends on the cell cycle. In every part of the cell cycle, YB-1 was found in the cytoplasm. A nuclear localisation of YB-1 was only detectable in the G1- to S-phase transition and in the early S-phase. These observations underline the hypothesis, that Y-box proteins are envolved in the regulation of cell proliferation. Different proteins interacting with YB-1 were identified in the cytoplasm of HeLa cells. All identified poteins are envolved in the RNA metabolism, indicating a role of these protein complexes in the regulation of mRNA. The interaction of P32/SF2 (P35) with YB-1 alternates during the cell cycle with a maximum at the G1- to S-phase transition. A remarkable increase of the association of YB-1 and P32 was observed in the multidrug-resistant MCF7 cells compared with the parental cell line. Furthermore, YB-1 was detected in association with membrane-bound polysomes, suggesting a role of YB-1 at the translational regulation of the synthesis of polypeptides at the rough endoplasmic reticulum. It was shown, that YB-1 stimulate the translation of P-glycoprotein. This influence is specific, beause the translation of a set of control proteins (alpha factor, preprolactin, luciferase) was not effected by YB-1. It was shown, that YB-1 stimulate the expression of P-glycoprotein at the level of transcription as well as at the level of translation. This indicates a central role of YB-1 in the regulation of the biosynthesis of this protein. The correlation of the nuclear expression of YB-1 and the expression of P-glycoprotein was demonstrated in primary breast cancers. Taken together, YB-1 is a important factor for the development of a resistant phenotyp and therefore a possible new target for anti-cancer therapy.

Nahrungsinhaltsstoffe sind im Organismus an Steuerungsprozessen und Stoffwechselvorgängen beteiligt, wobei die Mechanismen ihrer Wirkung noch nicht völlig aufgeklärt sind. Wie Vitamin E zeigen auch sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe in Zellsystemen sowie <I>in vivo</I> eine Reihe biologischer Wirkungen, deren Erklärung jedoch häufig auf ihre antioxidative Eigenschaft reduziert wird. Ziel der Dissertation war es, den Einfluss von Vitamin E und anderen Pflanzeninhaltsstoffen (in Form von Pflanzenextrakten oder isolierten sekundären Pflanzeninhaltsstoffen, z.B. Polyphenole), die bisher alle hauptsächlich als Antioxidanz klassifiziert wurden, auf die transkriptionelle Regulation von Phase I- und Phase II-Enzymen zu untersuchen. Dazu wurde die Aktivierung des PXR (pregnane X receptor) und des Nrf2 (NF-E2-related factor-2) als zentrale Transkriptionsfaktoren der Phase I- bzw. Phase II-Enzyme getestet. <br><br> Der Einfluss von verschiedenen Vitamin E-Formen und antioxidativen Pflanzeninhaltsstoffen in Form von Reinsubstanzen (Curcumin, EGCG, Medox, Quercetin, Resveratrol und Sulforaphan) oder Pflanzenextrakten (aus Blaubeeren, Gewürznelken, Himbeeren, Nelkenpfeffer, Thymian oder Walnüssen) auf die Aktivierung von PXR und Nrf2 sowie des Promotors eines jeweiligen Zielgens (CYP3A4 bzw. GI-GPx) wurde <I>in vitro</I> mit Reportergenplasmiden untersucht. Es zeigte sich, dass sowohl Vitamin E-Formen als auch verschiedene sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe PXR und/oder Nrf2 sowie die Promotoren der jeweiligen Zielgene CYP3A4 bzw. GI-GPx aktivieren. In einem Tierexperiment konnte diese genregulatorische Wirkung von Vitamin E auf die <I>in vivo</I>-Situation übertragen werden. In Lebern von Mäusen, deren Futter unterschiedliche Mengen von Vitamin E enthielt (Mangel-, Normal- und Überflussdiät), wurde eine direkte Korrelation zwischen der alpha-Tocopherol-Konzentration und der Cyp3a11 mRNA-Expression nachgewiesen (Cyp3a11 ist das murine Homolog zum humanen CYP3A4). Entgegen der <I>in vitro</I>-Situation hatte gamma-Tocotrienol <I>in vivo</I> einen nur kaum nachweisbaren Effekt auf die Expression der Cyp3a11 mRNA, induzierte aber die Expression der alpha-TTP mRNA. Es konnte gezeigt werden, dass Vitamin E und sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe Phase I- und Phase II-Enzyme transkriptionell regulieren können. <br><br> Die Wirkungen des Vitamin E können sich allerdings nur entfalten, wenn die Vitamin E-Formen ausreichend vom Körper aufgenommen werden. Gegenstand der Dissertation waren daher auch Untersuchungen zur Bioverfügbarkeit (zelluläre Akkumulation und Metabolismus) verschiedener Vitamin E-Formen. Es konnte gezeigt werden, dass Unterschiede in der chemischen Struktur der Vitamin E-Formen deren zelluläre Akkumulation und Metabolisierung beeinflussen. <br><br> Unter Berücksichtigung der Ergebnisse der Dissertation lassen sich protektive Wirkungen von antioxidativen Nahrungsinhaltsstoffen auch unabhängig von ihren antioxidativen Eigenschaften über die Induktion zelleigener Schutzsysteme, einschließlich der Phase I- und Phase II-Enzyme, erklären. Die Induktion der zelleigenen Abwehr lässt sich auch als adaptive Antwort (sog. "adaptive response") des Organismus gegenüber zellschädigenden Ereignissen betrachten. / In the organism food compounds are involved in regulatory and metabolic processes although the mechanisms of their effects have not been completely elucidated yet. Like vitamin E, secondary plant compounds have diverse biological effects, both in cell systems as well as <I>in vivo</I>. However, the explanation thereof is often reduced to their antioxidative capacity. The aim of this thesis was to investigate the influence of vitamin E and other plant compounds (in form of plant extracts or isolated secondary plant compounds, e.g. polyphenols), which were up to now classified primarily as antioxidants, on the transcription of phase I- and phase II-enzymes. For this, the activation of central transcription factors of the phase I- or phase II enzymes, PXR (pregnane X receptor) and Nrf2 (NF-E2-related factor-2), was tested. <br><br> The influence of different vitamin E forms and antioxidative plant compounds in form of pure substances (curcumin, EGCG, Medox, quercetin, resveratrol, and sulforaphane) or plant extracts (from blueberries, clove, raspberries, allspice, thyme, or walnuts) on the activation of PXR and Nrf2 as well as on the promoter of a respective target gene (CYP3A4 or GI-GPx) was investigated <I>in vitro</I> by reporter gene assays. It appeared that vitamin E forms as well as different secondary plant compounds activate PXR and/or Nrf2 as well as the promoter of the respective target genes CYP3A4 and GI-GPx. The effects of vitamin E were confirmed <I>in vivo</I> by an animal experiment. In livers of mice whose diet contained different amounts of vitamin E (deficient, adequate and supra-nutritional), a direct correlation between alpha-tocopherol content and Cyp3a11 mRNA expression was shown (Cyp3a11 is the murine homolog to the human CYP3A4). In contrast to the <I>in vitro</I> observations, gamma-tocotrienol <I>in vivo</I> only had a small effect on the expression of Cyp3a11 mRNA. However, it induced the expression of alpha-TTP on mRNA level. It could be shown that vitamin E and secondary plant compounds can influence the transcriptional regulation of phase I- and/or phase II-enzymes. <br><br> However, these effects of vitamin E can only be seen if the vitamin E forms are taken up by the body sufficiently. Therefore, another aim of the thesis was to investigate the bioavailability of different vitamin E forms (i.e., cellular accumulation and metabolism). It could be shown that differences in the chemical structure of vitamin E forms influence their cellular accumulation and metabolism. <br><br> Regarding the results of this thesis, protective effects of antioxidative food compounds can be explained independent of their antioxidative properties by the induction of cellular protective systems, including phase I- and phase II-enzymes. The induction of cellular defence mechanism can also be considered as an adaptive response of the organism towards cell-damaging events.

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