Regulatorische Landschaften von Genen steuern das präzise transkriptionelle Programm, das für die embryonale Entwicklung notwendig ist. Transkriptionsfaktoren (TFs) interagieren dabei mit regulatorischen Elementen (REs), um die Genexpression zu kontrollieren. Zur Untersuchung der zugrundeliegenden Mechanismen konzentriere ich mich auf das Xist-Gen, den Hauptregulator der X-Chromosom-Inaktivierung (XCI) in Säugetieren. In der Embryonalentwicklung wird Xist monoallelisch in weiblichen Zellen aktiviert, woraufhin die Xist-RNA das X-Chromosom überzieht und dessen Inaktivierung einleitet. Dadurch wird die erhöhte Dosis X-chromosomaler Gene in weiblichen Zellen kompensiert. Um ein umfassendes Verständnis der Xist-Regulatoren zu erhalten, nutze ich CRISPR-Screens, um REs und TFs in weiblichen embryonalen Stammzellen zu untersuchen. Dabei identifiziere ich ein neues nicht-kodierendes Gen namens Xert. Daruberhinaus stelle ich fest, dass promotor-nahe REs auf die Anzahl der X-Chromosomen reagieren, während distale REs unbeeinflusst bleiben. Durch meine TF-Screens entdecke ich zwei Gruppen von Aktivatoren: Die frühe Gruppe, darunter der X-chromosomale Faktor ZIC3, zeigt in weiblichen Zellen erhöhte Expression, was darauf hindeutet, dass sie die Xist-Expression auf weibliche Zellen beschränken. Die späte Gruppe, einschließlich OTX2, agiert geschlechtsunabhängig und stellt nach der initialen Xist-Aktivierung ein hohes Transkriptionslevel sicher. Mit weiteren CRISPR-Screens verknüpfe ich TFs mit REs und zeige, dass frühe Aktivatoren promotor-nahe REs beeinflussen, während späte Aktivatoren distale REs stärker regulieren. Diese Arbeit liefert eine systemische Perspektive des trans- und cis-regulatorischen Netzwerks, das die Xist-Aktivierung während der Differenzierung koordiniert und die Beschränkung auf weibliche Zellen gewährleistet. / The regulatory landscapes of developmental genes orchestrate precise and coordinated transcriptional programs required for embryonic development. During this process, transcription factors (TFs) interact with regulatory elements (RE) to finely tune gene expression. To study the regulatory principles acting in this context, I focus on the Xist gene, the master regulator of X-chromosome inactivation (XCI) in mammals. During early development, Xist is upregulated in a monoallelic fashion specifically in females. The Xist RNA then coats the X chromosome in cis, resulting in its inactivation. In this manner, female cells compensate for their increased X-chromosomal dosage in comparison to males. To obtain a complete understanding of Xist regulation, I first perform two CRISPR screens targeting REs and TFs during the early differentiation of female mouse embryonic stem cells. I identify Xist-controlling REs within the locus, unveiling a novel non-coding gene Xert. I further demonstrate the sensitivity of promoter-proximal REs to X-dosage, contrasted by the behavior of distal REs. In the TF screen, I detect two sets of activators which undergo transient upregulation at the onset of XCI. The early group of activators, including the X-linked TF ZIC3, exhibits higher expression levels in XX cells, indicating a role in restricting Xist expression to females. The late group of activators, including the master regulator of the epiblast OTX2, drives high transcript levels following Xist activation. Subsequently, I use a series of CRISPR screens targeting individual reporter constructs to map TF-RE wiring at the locus. I find that the early activators primarily act on the XX-dependent proximal REs. Contrary, the late activators interact with the sex-independent distal REs. With this study, I provide a systems level perspective of the trans- and cis-regulatory network that links Xist activation to early differentiation and ensures female-specificity.

YB-1, ein Y-Box-Protein in Säugerzellen, konnte sowohl im Zytoplasma als auch in den Zellkernen von HeLa-Zellen nachgewiesen werden. Es wurde eine Abhängigkeit der intrazellulären Lokalisation von YB-1 vom Verlauf des Zellzyklus beobachtet. In jeder Phase des Zellzyklus war YB-1 im Zytoplasma zu finden. Eine Kernlokalisation von YB- 1 konnte nur in den HeLa-Zellen festgestellt werden, die sich im Übergang von der G1- in die S-Phase oder in der frühen S-Phase des Zellzyklus befanden. Die Abhängigkeit der Lokalisation von YB-1 vom Verlauf des Zellzyklus unterstützt die These, daß YB-1 und andere Y-Box-Proteine an der Regulation der Zellproliferation beteiligt sind. Es wurden verschiedene Proteine identifiziert, die im Zytoplasma von HeLa-Zellen mit YB-1 assoziiert vorkommen. Alle identifizierten Proteine erfüllen Aufgaben im RNA-Metabolismus, was auf eine Beteiligung dieser Proteinkomplexe an der Regulation der mRNA hinweist. Die Interaktion von P32/SF2 (P35) mit YB-1 erwies sich als abhängig vom Zellzyklus, wobei eine maximale Assoziation dieser beiden Proteine beim Übergang der HeLa-Zellen von der G1- in die S-Phase zu beobachten war. In Multidrug-resistenten MCF7/ADR-Zellen konnte eine deutlich verstärkte Interaktion von P32/SF2 mit YB-1 im Vergleich zu den sensitiven MCF7-Zellen festgestellt werden. Im Zytoplasma von HeLa-Zellen konnte YB-1 in Verbindung mit membrangebundenen Polysomen nachgewiesen werden. Eine Assoziation von YB-1 mit freien oder zytoskelettgebundenen Polysomen konnte nicht festgestellt werden. Damit wurde erstmalig gezeigt, daß YB-1 eine Spezifität für eine bestimmte Gruppe von Polysomen besitzt. Die Assoziation mit membrangebundenen Polysomen legte die Vermutung nahe, daß YB-1 an der Translationskontrolle von Polypeptiden beteiligt ist, die am rauhen endoplasmatischen Retikulum synthetisiert werden. Es konnte gezeigt werden, daß YB-1 die Translation von P-Glykoprotein, einem integralen Membranprotein, positiv reguliert. Ein Einfluß auf die Translation der untersuchten sekretorischen Proteine (a-Faktor und Präprolactin) konnte nicht beobachtet werden. Diese Ergebnisse belegen, daß YB-1 ein spezifischer Regulator der Translation bestimmter Membranproteine ist. Am Hand von P-Glykoprotein konnte des weiteren demonstriert werden, daß YB-1 sowohl die Transkription als auch die Translation dieses Proteins positiv reguliert. Die in den Zellkulturen beobachtete Korrelation von YB-1 mit der Expression von P-Glykoprotein konnte auch in primären Mammakarzinomen nachgewiesen werden. Somit ist YB-1 ein entscheidender Faktor bei der Ausbildung einer intrinsischen multiplen Resistenz von Mammakarzinomen gegen die Behandlung mit Chemotherapeutika. Aus diesem Grunde könnte YB-1 einen Ansatzpunkt für die künftige Diagnose und Therapie von Mammakarzinomen und eventuell auch von anderen Tumoren bieten. / YB-1, a mammalian Y-box protein was detected in the cytoplasm as well as in the nuclei of HeLa cells. The intracellular localisation of YB-1 depends on the cell cycle. In every part of the cell cycle, YB-1 was found in the cytoplasm. A nuclear localisation of YB-1 was only detectable in the G1- to S-phase transition and in the early S-phase. These observations underline the hypothesis, that Y-box proteins are envolved in the regulation of cell proliferation. Different proteins interacting with YB-1 were identified in the cytoplasm of HeLa cells. All identified poteins are envolved in the RNA metabolism, indicating a role of these protein complexes in the regulation of mRNA. The interaction of P32/SF2 (P35) with YB-1 alternates during the cell cycle with a maximum at the G1- to S-phase transition. A remarkable increase of the association of YB-1 and P32 was observed in the multidrug-resistant MCF7 cells compared with the parental cell line. Furthermore, YB-1 was detected in association with membrane-bound polysomes, suggesting a role of YB-1 at the translational regulation of the synthesis of polypeptides at the rough endoplasmic reticulum. It was shown, that YB-1 stimulate the translation of P-glycoprotein. This influence is specific, beause the translation of a set of control proteins (alpha factor, preprolactin, luciferase) was not effected by YB-1. It was shown, that YB-1 stimulate the expression of P-glycoprotein at the level of transcription as well as at the level of translation. This indicates a central role of YB-1 in the regulation of the biosynthesis of this protein. The correlation of the nuclear expression of YB-1 and the expression of P-glycoprotein was demonstrated in primary breast cancers. Taken together, YB-1 is a important factor for the development of a resistant phenotyp and therefore a possible new target for anti-cancer therapy.

Meine Arbeit beschäftigt sich mit der Rekonstruktion genregulatorischer Netze, um die Funktionalität von Organismen und ihre Reaktionen auf die vielfältigen externen Einflussfaktoren besser zu verstehen. Die Analyse kurzer, zeitaufgelöster Daten mit Hilfe von Assoziationsmaßen kann dabei erste wesentliche Einblicke in mögliche Wechselwirkungskreisläufe liefern. In einer umfangreicher Vergleichstudie untersuche ich die Effizienz der Netzwerkrekonstruktion bei der Anwendung verschiedener Maße und Bewertungsschemata. Weiterhin führe ich IOTA (inner composition alignment) als ein neues asymmetrisches, permutationsbasiertes Ähnlichkeitsmaß ein, welches ein effektives Werkzeug zur Rekonstruktion gerichteter Netzwerke ohne die Verwendung zusätzlicher Bewertungsschemata darstellt. In meiner Arbeit betrachte ich verschiedene Modifikationen dieses Maßes und untersuche deren Eigenschaften. Dabei zeige ich, dass IOTA geeignet ist, um statistisch signifikante gerichtete, nichtlineare Kopplungen in verschiedenen Zeitreihen (autoregressive Prozesse, Michaelis-Menten Kinetik und chaotische Oszillatoren in verschiedenen Regimen) und Autoregulation zu untersuchen. Weiterhin erlaubt IOTA, ebenso wie die Korrelationsmaße, die Spezifizierung des Types der Regulation (Aktivierung oder Repression), was es zu dem einzigen Maß macht, dass die Ableitung aller für die Rekonstruktion genregulatorischer Netzwerke erforderlichen Kenndaten ermöglicht. Schließlich nutze ich das neuen Ähnlichkeitsmaß IOTA, um ein genregulatorisches Netzwerk für die Grünalgenart Chlamydomonas reinhardtii unter Kohlenstoffmangel aus experimentellen Daten abzuleiten. / My thesis is about reconstructing gene regulatory networks in order to better understand the functionality of organisms and their reactions to various external influences. In this context, the analysis of short, time-resolved measurements with association measures can yield crucial insights into possible interactions. In an extensive comparison study, I examine the efficiency of different measures and scoring schemes for solving the network reconstruction problem. Furthermore, I introduce IOTA (inner composition alignment), a novel asymmetric, permutation-based association measure, as an efficent tool for reconstructing directed networks without the application of additional scoring schemes. In my thesis, I analyze the properties of various modifications of the measure. Moreover, I show that IOTA is valuable to study significant, directed, nonlinear couplings in several time series (autoregressive processes, Michaelis-Menten kinetics and chaotic oscillators in different dynamical regimes) , as well as autoregulation. In addition, IOTA, similar to correlation measures, permits to identify the type of regulation (activation or repression). Hence, it is the only measure that can determine all necessay characteristics when reconstruction regulatory networks. Finally, I apply the novel association measure IOTA to infer a gene regulatory network for the green algae Chlamydomas reinhardtii under carbon deprivation from experimally obtained data.

Die Genregulation ist ein komplexer Prozess, bei dem Zellen die Menge der Genprodukte steuern, um ihre Identität auszubilden und auf Umweltveränderungen zu reagieren. Die CRISPR-Technologie hat genetische Screens revolutioniert und ermöglicht es, mehrere Transkripte gleichzeitig zu untersuchen. In dieser Arbeit werden die Vorteile und Herausforderungen gepoolter CRISPR-Screens zur Erforschung der Genregulation untersucht. Es wird ein CRISPR-ko-Screen in embryonalen Mausstammzellen (mESCs) beschrieben, der pluripotenzerhaltende Transkriptionsfaktoren identifiziert. Es zeigte sich, dass ein Screening mit einer kleinen Bibliothek den Großteil des biologischen Signals eines genomweiten Screens erfasst und die Identifizierung von Genkandidaten mit kleinen Effektgrößen verbessert. Nachfolgend wird CRISPTimeR, eine neue Methode für die Analyse von Zeitreihen von CRISPR-Screens, vorgestellt. Sie basiert auf gemischten linearen Modellen und ermöglicht es, Treffer zu identifizieren und gleichzeitig zeitlich zu klassifizieren. Als Nächstes wurde CRISPRi verwendet, um für die Pluripotenz von mESCs relevante lncRNAs zu untersuchen, was aufgrund ihrer schlechten Annotation und niedrigen Expressionsniveaus schwierig ist. Eine mögliche Lösung ist eine manuell verfeinerte Annotation von Transkriptionsstartstellen und kleinere Bibliotheks-Screens mit empfindlicherer phänotypischer Auslesung. Zudem wurde ein Sättigungsscreen genomischer Regionen rund um den PHOX2B-Lokus, zur Identifikation cis-regulierender Elemente, durchgeführt. Dabei wurden CRISPRa-reaktive Elemente identifiziert, die Gene in der PHOX2B-TAD regulieren, und mit diesen mittels Einzelzell RNA-seq in Verbindung gebracht. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit den Wert gepoolter CRISPR-Screens für die Erforschung der Genregulation und Herausforderungen der Analyse nicht-kodierender Elemente. Zusätzlich beschreibt sie ein neues Tool für die Analyse von kodierenden und nicht-kodierenden CRISPR-Screens in Zeitreihen. / Gene regulation is a complex process in which cells control gene product levels to establish identity and respond to environmental changes. CRISPR technology has revolutionized genetic screening, enabling researchers to study multiple transcripts simultaneously. This thesis explores the advantages and challenges of using pooled CRISPR screens to study gene regulation. First, I describe a CRISPR-ko screen in mouse embryonic stem cells (mESCs) to identify transcription factors involved in pluripotency maintenance. I show that a small-library screen captures most of the biological signal observed in a genome-wide screen, and it improves the identification of candidate genes with small effect sizes. Next, introduce CRISPTimeR, a novel method for the analysis time-series CRISPR screens. CRISPTimeR is based on mixed linear models; it allows to use information from a time-series experiment to identify, and simultaneously perform temporal classification on, hits. Next, I use CRISPRi to study lncRNAs relevant to pluripotency in mESCs. Targeting lncRNAs poses challenges due to poor annotation and low expression levels. I suggest to address these issues by using a hand-refined annotation of transcription start sites and by designing small-library screens with more sensitive phenotypic readout. Finally, I describe a saturation screen targeting large genomic regions around the PHOX2B locus, to identify putative cis-regulatory elements. I identified CRISPRa responsive elements involved in regulating the expression of genes within the PHOX2B TAD, which were then matched with the genes they control using single-cell RNA-seq. Overall, in this thesis I demonstrate the value of CRISPR pooled screens for studying gene regulation, while highlighting the challenges associated with targeting non-coding elements and suggesting possible approaches to address these challenges. Moreover, I introduce a novel tool for the analysis of both coding and non-coding time-series CRISPR screens.

Die Untersuchung von Proteininteraktionen ist unerlässlich um die komplexen Mechanismen der epigenetischen Kontrolle von Zugänglichkeit zum Chromatin und dessen Struktur zu verstehen. Zellspezifizierung während der Entwicklung von Organismen kann nur durch strikte Regulation von Chromatin gewährleistet werden, was auch für den Schutz von Zellenidentitäten im späteren Lebensverlauf wichtig ist. Die Modifizierung von Histon-Proteinen, welche integrale Komponenten des Chromatins sind, fördert entweder positive oder negative Genregulation. Eine Vielzahl von Chromatin regulierenden Proteinen hat jedoch keine enzymatische Aktivität für Histon- Modifikationen, so dass sie nur such Interaktionen mit anderen Proteinen regulatorisch einwirken können. Der Nematode Caenorhabditis elegans eignet sich als ein in vivo System, um die Schutzmechanismen der Zellen basierend auf Chromatinfaktoren zu untersuchen, indem systematisch Protein-Interaktionsnetzwerke bestimmt werden. Diese Dissertation beschriebt zunächst die Etablierung eines optimierten Verfahrens für die quantitative Analyse ohne Markierung von Proteinen in C. elegans, die mittels CRISPR mit einem Epitop fusioniert wurden. Mit Hilfe dieses Verfahrens wurden fünf Chromatin regulierende Proteine, die eine wichtige Rolle beim Schutz von Zellidentitäten spielen, charakterisiert. Es wurden in vivo Proteininteraktions-Netzwerke erstellt und dabei neue funktionsrelevante Interaktionspartner identifiziert. Darüber hinaus wurde eine vertiefende Analyse der Interaktionen des Chromatinfaktors MRG- 1 durchgeführt, das homolog zum humanen MRG15 ist. MRG-1 besitzt eine sogenannte Chromodomäne, um an methylierte Histone zu binden. Diese Studie zeigt, dass die Untersuchung der Proteininteraktionen von epigenetischen Faktoren in einem in vivo System ein bedeutendes Verfahren ist, um wichtige biologische Mechanismen der Schutzfunktion von Zellen zu entschlüsseln. / Elucidating protein-protein interactions has been instrumental to understand the complex mechanisms underlying epigenetic regulations to control chromatin accessibility and structure. Proper development and cell fate specification are established under strict chromatin regulation to safeguard cellular identities throughout an organism's life. Modifications of histone proteins as an integral component of chromatin can promote either positive or negative gene regulation. However, many chromatin-regulation proteins lack enzymatic activity and depend on protein-protein interaction to cooperate with other factors to regulate chromatin through histone modifications. The nematode Caenorhabditis elegans can be used as an in vivo system to study chromatin regulators that safeguard cell identity and offers an attractive model system for mapping in vivo protein interactions. The presented thesis includes establishment of an optimized protocol for a quantitative approach based on label-free interaction proteomics to accurately identify interactions of chromatin-regulating proteins, which were epitope-tagged using CRISPR in C. elegans. This protocol was utilized to reveal the interaction partners of five bait proteins involved in essential chromatin regulation mechanisms during cell fate maintenance. The present study generated an in vivo protein interaction network identifying new interactions of high functional relevance. Moreover, in-depth protein-protein interaction analysis of the chromodomain protein MRG-1, homolog of human MRG15, detected a strong association with the Small Ubiquitin-like Modifier (SUMO), besides previously described and novel interactions with other proteins. In summary, in vivo interactome mapping of epigenetic regulators is a powerful approach that can reveal crucial biological insights into how cell fate decisions are regulated.

Die Regulation der Genexpression ist einer der wichtigsten zellulären Prozesse und steht in Zusammenhang mit der Entstehung diverser Krankheiten. Regulationsmechanismen können mit einer Vielzahl von Methoden experimentell untersucht werden, zugleich erfordert die Integration der Datensätze in umfassende Modelle stringente rechnergestützte Methoden. Ein Teil dieser Methoden modelliert die genomweite Genexpression als (lineares) Gleichungssystem über die Aktivität und Beziehungen von Transkriptionsfaktoren (TF), Genen und anderen Faktoren und optimiert die Parameter, sodass die gemessenen Expressionsintensitäten möglichst genau wiedergegeben werden. Trotz ihrer gemeinsamen Wurzeln in der mathematischen Optimierung unterscheiden sich die Methoden stark in der Art der integrierten Daten, im für ihre Anwendung notwendigen Hintergrundwissen, der Granularität des Regulationsmodells, des konkreten Paradigmas zur Lösung des Optimierungsproblems, und der zur Evaluation verwendeten Datensätze. In dieser Arbeit betrachten wir fünf solcher Methoden und stellen einen qualitativen und quantitativen Vergleich auf. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Überschneidungen der Ergebnisse sehr gering sind, was nicht auf die Stichprobengröße oder das regulatorische Netzwerk zurückgeführt werden kann. Ein Grund für die genannten Defizite könnten die vereinfachten Modelle zellulärer Prozesse sein, da diese vorhandene Rückkopplungsschleifen ignorieren. Wir schlagen eine neue Methode (Florae) mit Schwerpunkt auf die Berücksichtigung von Rückkopplungsschleifen vor und beurteilen deren Ergebnisse. Mit Floræ können wir die Identifizierung von Knockout- und Knockdown-TF in synthetischen Datensätzen verbessern. Unsere Ergebnisse und die vorgeschlagene Methode erweitern das Wissen über genregulatorische Aktivität können die Identifizierung von Ursachen und Mechanismen regulatorischer (Dys-)Funktionen und die Entwicklung von medizinischen Biomarkern und Therapien unterstützen. / Gene regulation is one of the most important cellular processes and closely interlinked pathogenesis. The elucidation of regulatory mechanisms can be approached by many experimental methods, yet integration of the resulting heterogeneous, large, and noisy data sets into comprehensive models requires rigorous computational methods. A prominent class of methods models genome-wide gene expression as sets of (linear) equations over the activity and relationships of transcription factors (TFs), genes and other factors and optimizes parameters to fit the measured expression intensities. Despite their common root in mathematical optimization, they vastly differ in the types of experimental data being integrated, the background knowledge necessary for their application, the granularity of their regulatory model, the concrete paradigm used for solving the optimization problem and the data sets used for evaluation. We review five recent methods of this class and compare them qualitatively and quantitatively in a unified framework. Our results show that the result overlaps are very low, though sometimes statistically significant. This poor overall performance cannot be attributed to the sample size or to the specific regulatory network provided as background knowledge. We suggest that a reason for this deficiency might be the simplistic model of cellular processes in the presented methods, where TF self-regulation and feedback loops were not represented. We propose a new method for estimating transcriptional activity, named Florae, with a particular focus on the consideration of feedback loops and evaluate its results. Using Floræ, we are able to improve the identification of knockout and knockdown TFs in synthetic data sets. Our results and the proposed method extend the knowledge about gene regulatory activity and are a step towards the identification of causes and mechanisms of regulatory (dys)functions, supporting the development of medical biomarkers and therapies.

Vitamin E wird immer noch als das wichtigste lipophile Antioxidanz in biologischen Membranen betrachtet. In den letzten Jahren hat sich jedoch der Schwerpunkt der Vitamin E-Forschung hin zu den nicht-antioxidativen Funktionen verlagert. Besonderes Interesse gilt dabei dem α-Tocopherol, der häufigsten Vitamin E-Form im Gewebe von Säugetieren, und seiner Rolle bei der Regulation der Genexpression. Das Ziel dieser Dissertation war die Untersuchung der genregulatorischen Funktionen von α-Tocoperol und die Identifizierung α-Tocopherol-sensitiver Gene in vivo. Zu diesem Zweck wurden Mäuse mit verschiedenen Mengen α-Tocopherol gefüttert. Die Analyse der hepatischen Genexpression mit Hilfe von DNA-Microarrays identifizierte 387 α-Tocopherol-sensitive Gene. Funktionelle Clusteranalysen der differentiell exprimierten Gene zeigten einen Einfluss von α-Tocooherol auf zelluläre Transportprozesse. Besonders solche Gene, die an vesikulären Transportvorgängen beteiligt sind, wurden größtenteils durch α-Tocopherol hochreguliert. Für Syntaxin 1C, Vesicle-associated membrane protein 1, N-ethylmaleimide-sensitive factor and Syntaxin binding protein 1 konnte eine erhöhte Expression mittels real time PCR bestätigt werden. Ein funktioneller Einfluss von α-Tocopherol auf vesikuläre Transportprozesse konnte mit Hilfe des in vitro β-Hexosaminidase Assays in der sekretorischen Mastzelllinie RBL-2H3 gezeigt werden. Die Inkubation der Zellen mit α-Tocopherol resultierte in einer konzentrationsabhängigen Erhöhung der PMA/Ionomycin-stimulierten Sekretion der β-Hexosaminidase. Eine erhöhte Expression ausgewählter Gene, die an der Degranulation beteiligt sind, konnte nicht beobachtet werden. Damit schien ein direkter genregulatorischer Effekt von α-Tocopherol eher unwahrscheinlich. Da eine erhöhte Sekretion auch mit β-Tocopherol aber nicht mit Trolox, einem hydrophilen Vitamin E-Analogon, gefunden wurde, wurde vermutet, dass α-Tocopherol die Degranulation möglicherweise durch seine membranständige Lokalisation beeinflussen könnte. Die Inkubation der Zellen mit α-Tocopherol resultierte in einer veränderten Verteilung des Gangliosids GM1, einem Lipid raft Marker. Es wird angenommen, dass diese Membranmikrodomänen als Plattformen für Signaltransduktionsvorgänge fungieren. Ein möglicher Einfluss von Vitamin E auf die Rekrutierung/Translokation von Signalproteinen in Membranmikrodomänen könnte die beobachteten Effekte erklären. Eine Rolle von α-Tocopherol im vesikulären Transport könnte nicht nur seine eigene Absorption und seinen Transport beeinflussen, sondern auch eine Erklärung für die bei schwerer Vitamin E-Defizienz auftretenden neuronalen Dysfunktionen bieten. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die α-Tocopheroltransferprotein (Ttpa) Knockout-Maus als genetisches Modell für Vitamin E-Defizienz verwendet, um den Effekt von Ttpa auf die Genexpression und die Gewebeverteilung von α-Tocopherol zu analysieren. Ttpa ist ein cytosolisches Protein, das für die selektive Retention von α-Tocopherol in der Leber verantwortlich ist. Die Ttpa-Defizienz resultierte in sehr geringen α-Tocopherol-Konzentrationen im Plasma und den extrahepatischen Geweben. Die Analyse der α-Tocopherol-Gehalte im Gehirn wies auf eine Rolle von Ttpa bei der α-Tocopherol-Aufnahme ins Gehirn hin. / Vitamin E is still considered the most important lipid-soluble antioxidant within biological membranes. However, in the last years the non-antioxidant functions of vitamin E have become the focus of vitamin E research. From the eight members of the vitamin E family, specific emphasis is given to α-tocopherol, the most abundant vitamin E form in mammalian tissues, and its role in the regulation of gene expression. The aim of this thesis was the analysis of the gene regulatory functions of α-tocopherol and the identification of α-tocopherol sensitive genes in vivo. For this purpose mice were fed diets differing in α-tocopherol content. The analysis of hepatic gene expression using DNA microarrays identified 387 α-tocopherol-sensitive genes. Functional cluster analyses of these differentially expressed genes demonstrated an influence of α-tocopherol on cellular transport processes. Especially the expression of genes involved in vesicular trafficking was largely upregulated by α-tocopherol. Upregulation of syntaxin 1C, vesicle-associated membrane protein 1, N-ethylmaleimide-sensitive factor and syntaxin binding protein 1 was verified by real time PCR. A role of α-tocopherol in exocytosis was shown by the in vitro β-hexosaminidase release assay in the secretory mast cell line RBL-2H3. Incubation with α-tocopherol resulted in a concentration dependent increase of PMA/ionomycin-stimulated secretion of β-hexosaminidase. Induction of selected genes involved in degranulation was not observed at any time point. Thus, a direct gene-regulatory effect of α-tocopherol seemed rather unlikely. Since increased secretion was also observed with ß-tocopherol but not with trolox, a water-soluble analog of vitamin E, it was hypothesized that α-tocopherol might affect degranulation through its localization at the plasma membrane. Incubation of cells with α-tocopherol changed the distribution of the gangliosid GM1, a Lipid raft marker. These membrane microdomains are assumed to function as signaling platforms. An possible influence of vitamin E on the recruitment/translocation of signaling proteins into membrane microdomains could explain the observed effects. A role of α-tocopherol in the vesicular transport might not only affect its own absorption and transport but also explain the neural dysfunctions observed in severe α-tocopherol deficiency. In the second part of this dissertation the α-tocopherol transfer protein (Ttpa) knockout-mouse as a model of genetic vitamin E deficiency was used to analyze the effect of Ttpa gene expression and tissue distribution of α-tocopherol. Ttpa is a cytosolic protein, which is responsible for the selective retention of α-tocopherol in the liver. Its deficiency resulted in very low α-tocopherol concentrations in plasma and extrahepatic tissues. Analysis of α-tocopherol contents in brain indicated a role for Ttpa in the uptake of α-tocopherol into the brain.

Elevated levels of circulating asymmetric and symmetric dimethylarginines (ADMA and SDMA) predict and potentially contribute to end organ damage in cardiovascular diseases. Alanine-glyoxylate aminotransferase 2 (AGXT2) regulates systemic levels of ADMA and SDMA, and also of beta-aminoisobutyric acid (BAIB)-a modulator of lipid metabolism. We identified a putative binding site for hepatic nuclear factor 4 α (HNF4α) in AGXT2 promoter sequence. In a luciferase reporter assay we found a 75% decrease in activity of Agxt2 core promoter after disruption of the HNF4α binding site. Direct binding of HNF4α to Agxt2 promoter was confirmed by chromatin immunoprecipitation assay. siRNA-mediated knockdown of Hnf4a led to an almost 50% reduction in Agxt2 mRNA levels in Hepa 1–6 cells. Liver-specific Hnf4a knockout mice exhibited a 90% decrease in liver Agxt2 expression and activity, and elevated plasma levels of ADMA, SDMA and BAIB, compared to wild-type littermates. Thus we identified HNF4α as a major regulator of Agxt2 expression. Considering a strong association between human HNF4A polymorphisms and increased risk of type 2 diabetes our current findings suggest that downregulation of AGXT2 and subsequent impairment in metabolism of dimethylarginines and BAIB caused by HNF4α deficiency might contribute to development of cardiovascular complications in diabetic patients.

Elevated levels of circulating asymmetric and symmetric dimethylarginines (ADMA and SDMA) predict and potentially contribute to end organ damage in cardiovascular diseases. Alanine-glyoxylate aminotransferase 2 (AGXT2) regulates systemic levels of ADMA and SDMA, and also of beta-aminoisobutyric acid (BAIB)-a modulator of lipid metabolism. We identified a putative binding site for hepatic nuclear factor 4 α (HNF4α) in AGXT2 promoter sequence. In a luciferase reporter assay we found a 75% decrease in activity of Agxt2 core promoter after disruption of the HNF4α binding site. Direct binding of HNF4α to Agxt2 promoter was confirmed by chromatin immunoprecipitation assay. siRNA-mediated knockdown of Hnf4a led to an almost 50% reduction in Agxt2 mRNA levels in Hepa 1–6 cells. Liver-specific Hnf4a knockout mice exhibited a 90% decrease in liver Agxt2 expression and activity, and elevated plasma levels of ADMA, SDMA and BAIB, compared to wild-type littermates. Thus we identified HNF4α as a major regulator of Agxt2 expression. Considering a strong association between human HNF4A polymorphisms and increased risk of type 2 diabetes our current findings suggest that downregulation of AGXT2 and subsequent impairment in metabolism of dimethylarginines and BAIB caused by HNF4α deficiency might contribute to development of cardiovascular complications in diabetic patients.

Understanding the connection between an organism’s genotype and its phenotype is a key question in evolutionary biology and genetics. It has been shown that many changes of morphological or other complex phenotypic traits result from changes in the expression pattern of key developmental genes rather than from changes in the genes itself. Such altered gene expression arises often from changes in the gene regulatory regions. That usually means the loss of important transcription factor (TF) binding sites within these regulatory regions, because the interaction between TFs and specific sites on the DNA is a key element of gene regulation. An established approach for the genome-wide mapping of genomic regions to phenotypes is the Forward Genomics framework. This approach compares the genomic sequences of species with and without the phenotype of interest based upon two ideas. First, the initial loss of a phenotype relaxes selection on all phenotypically related genomic regions and, second, this can happen independently in multiple species. Of interest are such regions that diverged specifically in phenotype-loss species. Although this principle is general, the current implementation is only well-suited for the identification of phenotype related gene-coding regions and has a limited applicability on regulatory regions. The reason is its reliance on sequence conservation as divergence measure, which does not accurately measure functional divergence of regulatory elements. In this thesis, I developed REforge, a novel implementation of the Forward Genomics principle that takes functional information of regulatory elements in the form of known phenotype-related TF into account. The consideration of the flexible organization of TF binding sites within a regulatory region, both in terms of strength and order, allows the abstraction from the region’s sequence level to its functional level. Thus, functional divergence of regulatory regions is directly compared to phenotypical divergence, which tremendously improves performance compared to Forward Genomics, as I demonstrated on synthetic and real data. Additionally, I developed TFforge which follows the same approach but aims at identifying the TFs relevant for the given phenotype. Given a multi-species alignment with a phenotype annotation and a set of regulatory regions, TFforge systematically searches for TFs whose changes in binding affinity between species fit the phenotype signature. The reported output is a ranking of the TFs according to their level of correspondence. I prove the concept of this approach on both biological data and artificially generated regions. TFforge can be used as a standalone analysis tool and also to generate the input set of TFs for a subsequent REforge analysis. I demonstrate that REforge in combination with TFforge is able to substantially outperform standard Forward Genomics, i.e. even without foreknowledge of relevant TFs. Overall, the in this thesis introduced methods are examples for the power of computational tools in comparative genomics to catalyze biological insights. I did not only show a detailed description of the methods but also conducted a real data analysis as validation. REforge and TFforge have a wide applicability on endless phenotypes, both on their own in the association of TF and regulatory region to a phenotype. Moreover, particularly their combination constitutes in respect to gene regulatory network analyses a valuable tool set for evo-devo studies.