Infectious bronchitis virus (IBV) is the causative agent of an economically important disease of poultry. In Brazil this disease causes respiratory, renal and reproductive problems in birds of all ages, despite constant vaccination with the Massachusetts strain H120. This lack of immunological protection is known to be due the genetic variation in the spike glycoprotein of IBV, which is involved in host cell attachment, neutralization and the induction of protective immunity. Brazilian IBV variants resulting of this genetic variation are present since the 80s and this study aimed to epidemiologicaly analyze and molecularly characterize the existing variants during 2010-2015 and perform a bioinformatics analysis of the available sequences of IBV variants in a 40 year period. Of the 453 samples tested, 61.4% were positive for IBV and 75.9% of them were considered variants and were detected in birds of all ages, distributed in all five Brazilian regions. A fragment of 559-566 bp was obtained from 12 isolates, where BR-I was the predominant variant while only one isolate belonged to the BR-II genotype. Bioinformatics analysis of the sequences of 40 years of Brazilian IBV variants was performed and the ratio of non-synonymous substitutions per non-synonymous site (dn) to synonymous substitutions per synonymous site (ds) dN/dS was calculated. It revealed a predominance of codons with non-synonymous substitutions in the first third of the S1 gene and a dN/dS ratio of 0.6757, indicating that this portion of the gene was under negative selection. Additionally prediction of N-glycosilation sites showed that most of the BR-I variants (from 2003 to early 2014) present an extra site at animoacid position 20, while the newest ones lack this feature.Together these results suggest that IBV Brazilian variants had probably suffered drastic mutations in some points between the years 1983 to 2003 and after achieving an antigenic structure effective enough for invasion and replication in their hosts, the selection processes became silent. / O vírus da bronquite infecciosa das galinhas (IBV) é o agente causador de uma doença aviária economicamente importante. No Brasil, esta doença ocasiona problemas respiratórios, renais e reprodutivos em aves de todas as idades, apesar da vacinação constante com a cepa Massachusetts H120. Esta falha na proteção conferida pela vacina é ocasionada por mutações nos nucleotídeos do gene da glicoproteína da espícula, a qual está envolvida no processo de interação comas células do hospedeiro, a neutralização e a indução de imunidade protetora. As variantes brasileiras resultantes dessa mutação genética estão presentes desde os anos 80 e este estudo teve como objetivo analisar epidemiologicamente e caracterizar molecularmente os vírus variantes existentes durante 2010-2015 e realizar uma análise bioinformática das sequências disponíveis no GenBank em um período de 40 anos. Das 453 amostras analisadas, 61,4% foram positivas para IBV e 75,9% delas foram consideradas variantes e foram detectados em aves de todas as idades, distribuídos em todas as 5 regiões do Brasil. Um fragmento de 559-566 pb foi obtido a partir de 12 isolados, onde BR-I foi a variante predominante ao contrario que apenas um isolado pertencia ao genótipo BR-II. Análise bioinformática de 40 anos de variantes do IBV brasileiros revelou uma predominância de codões com as substituições não sinónimos no primeiro terço do gene S1 e uma relação dN / dS de 0,6757, indicando que esta porção do gene estava sob selecção negativa. Além disso a previsão de pontos de de N-glicosilação mostrou que a maioria das amostras variantes BR-I (entre o 2003 e início de 2014) apresentam um ponto adicional na posição 20, enquanto as variantes mais novas não apresentam esse ponto de nglicosilação. Estes resultados sugerem que as variantes brasileiras teriam sofrido mutações provavelmente drásticas em alguns pontos do genoma, entre os anos de 1983 a 2003 e depois de atingir uma estrutura antigênica eficaz o suficiente para a invasão e replicação em seus hospedeiros, o processo de seleção mudou para seleção negativa.

A O-glicosilação com N-acetil-glucosamina (O-GlcNAc) é uma modificação pós-translacional altamente dinâmica que modula diversas vias de sinalização. O processo de O-GlcNAc é controlado por duas enzimas: a enzima OGT é responsável por catalisar a adição de N-acetil-glucosamina no grupo hidroxila dos resíduos de serina e treonina, enquanto a OGA catalisa a remoção de O-GlcNAc das proteínas modificadas. Proteínas com importante papel na função vascular são alvo de O-GlcNAc e o aumento da expressão de proteínas modificadas por O-GlcNAc promove aumento da reatividade vascular para estímulos contráteis. Um dos mecanismos de extrema importância no controle do tônus vascular está ligado à regulação da concentração de cálcio (Ca2+) intracelular, onde destacamos a participação do sistema STIM1/Orai1. As moléculas de interação estromal (STIM) atuam como sensores dos estoques intracelulares de Ca2+ e as proteínas Orai representam as subunidades que formam os canais de Ca2+ ativados pela liberação de Ca2+ (CRAC). Neste estudo investigamos a hipótese de que o aumento dos níveis vasculares de proteínas glicosiladas aumenta a resposta contrátil em aorta de ratos, por mecanismos relacionados ao controle da concentração intracelular de Ca2+.Em nossos experimentos, utilizamos aortas torácicas de ratos incubadas com PugNAc (inibidor seletivo da OGA, ), por 24h. Utilizando protocolo experimental que permite avaliar contrações induzidas pelo influxo de Ca2+ e liberação de Ca2+ intracelular, demonstramos que a incubação com PugNAc aumentou a resposta contrátil à PE bem como a contração durante o período de influxo de Ca2+, induzida pela reintrodução de solução fisiológica contendo Ca2+ (1,56 mM). O bloqueio dos canais CRAC com 2-APB (100 ) e gadolíneo (Gd3+, 100 ) diminuiu significativamente as contrações induzidas pelo influxo de Ca2+ em aortas incubadas com PugNAc. Além disso, estas aortas apresentaram aumento da expressão protéica de STIM1, o que resultaria em maior influxo de Ca2+. A contração induzida por cafeína (20 mM) e serotonina (10 ), a qual reflete a capacidade funcional do retículo sarcoplasmático (RS) em captar Ca2+, foi maior em aortas incubadas com PugNAc. O papel da Ca2+-ATPase (SERCA) foi avaliado com a utilização de tapsigargina, bloqueador da SERCA. O efeito da tapsigargina foi semelhante em artérias incubadas com PugNAc e veículo, apesar do aumento de expressão proteica da SERCA em aortas incubadas com PugNAc. Como a proteína cinase C (PKC) é ativada por aumentos de Ca2+ intracelular, determinamos se a atividade de proteínas alvo da PKC estavam aumentadas. A incubação com PugNAc aumentou a expressão das formas fosforiladas da CPI-17, MYPT-1 e MLC. Em conjunto, estes resultados sugerem que a ativação de STIM1/Orai1, aumento da liberação de Ca2+ intracelular e ativação da via de sinalização da PKC podem representar mecanismos que modulam as alterações vasculares em resposta ao aumento de proteínas glicosiladas por O-GlcNAc. / Glycosylation with O-linked -N-acetyl-glucosamine (O-GlcNAc) is a highly dynamic post-translational modification. The process of O-GlcNAc is controlled by two enzymes: the OGT enzyme catalyses the addition of N-acetyl-glucosamine to the hydroxyl group of serine and threonine residues of a target protein, while OGA catalyzes the cleavage of O-GlcNAc from post-translationally-modified proteins. Proteins with an important role in vascular function are targets of O-GlcNAc and increased levels of proteins modified by O-GlcNAc increase vascular reactivity to contractile stimuli. The regulation of intracellular calcium (Ca2+) concentration, including the activation of STIM1/Orai1, is key in the control of vascular tone. The stromal interaction molecules (STIM) act as sensors of intracellular Ca2+ stores whereas the Orai proteins represent subunits of the Ca2+ release-activated Ca2+ channels (CRAC). We hypothesized that increased levels of vascular O-GlcNAc proteins augment vascular contractile responses by altering mechanisms that regulate the intracellular Ca2+. Rat thoracic aortas were incubated with PugNAc (OGA selective inhibitor, ) for 24h. Using an experimental protocol that evaluates contractions induced by Ca2+ influx and release, we demonstrated that incubation with PugNAc increases contractile responses to phenylephrine (PE) as well as the contraction induced by Ca2+ influx, after depletion of intracellular Ca2+ stores. The CRAC channel blockers, 2-APB (100 ) and gadolinium (Gd3+, 100 ), significantly reduced the contractions induced by Ca2+ influx in aortas incubated with PugNAc. Furthermore, these aortas showed increased STIM1 protein expression, which could result in increased influx of Ca2+ and, in turn, increase vascular contraction. The contraction induced by the release of intracellular Ca2+ stores, stimulated by caffeine (20 mM) and serotonin (10 ), was increased in aortas incubated with PugNAc. The Ca2+-ATPase (SERCA) inhibitor thapsigargin produced similar effects in arteries incubated with PugNAc or vehicle, despite the increased SERCA protein expression in aortas incubated with PugNAc. Since PKC is activated by increases in intracellular Ca2+ and arteries incubated with PugNAc show activation of PKC, we determined whether the activity of proteins that are targets of PKC was increased in PugNAc-treated aortas. Incubation with PugNAc increased the expression of phosphorylated forms of CPI-17, MYPT-1 and MLC. Together, these results suggest that activation of STIM1/Orai1, increased release of intracellular Ca2+ and PKC activation may represent mechanisms that modulate vascular responses upon increased O-GlcNAc proteins.

Produtos de glicação avançada (AGE) são prevalentes no diabete melito e alteram o metabolismo de lípides e lipoproteínas. Neste estudo, avaliou-se a influência da albumina, isolada do soro de indivíduos controles (C, n =12) e de portadores de diabete melito tipo 1 (DM 1, n=13) e tipo 2 (DM 2, n=11), com controle glicêmico inadequado, sobre a remoção de colesterol de macrófagos, o acúmulo intracelular de lípides, o conteúdo do receptor de HDL, ABCA-1 e a captação seletiva de colesterol esterificado de HDL. Além disso, foi determinada a expressão diferencial de genes em macrófagos tratados com albumina C, DM 1 ou DM 2. A concentração plasmática de albumina glicada foi superior no grupo DM 1 e DM 2 em relação ao C e correlacionou-se positivamente com glicemia, hemoglobina glicada e frutosamina. Albumina sérica foi isolada por cromatografia para separação rápida de proteínas e purificada por extração alcoólica. Albumina DM 1 e DM 2 apresentaram maior conteúdo de carboximetil-lisina e apo A-I quando comparada à albumina C. Macrófagos enriquecidos com LDL acetilada e 14C-colesterol foram tratados com albumina C, DM 1 ou DM 2 e, a seguir, incubados na presença ou ausência de apo A-I, HDL3 ou HDL2 para determinação do efluxo de colesterol. Apesar de removerem maior quantidade de colesterol celular, as albumina DM 1 e DM 2 reduziram o efluxo de colesterol mediado por apo A-I (70% e 45%, respectivamente) e HDL2 (55% e 54%, respectivamente) em comparação à albumina C. Com HDL3, a queda no efluxo de colesterol só foi observada em macrófagos expostos à albumina DM 2 (55%). Macrófagos incubados apenas com albumina C, DM 1 ou DM 2 apresentaram conteúdo lipídico semelhante, evidenciado por coloração com Oil Red O. A adição de apo A-I, HDL3 ou HDL2 reduziu o conteúdo lipídico apenas nas células tratadas com albumina C, mas não com albumina DM 1 ou DM 2. A expressão de ABCA-1 foi diminuída 82% e 25% em macrófagos expostos, respectivamente, à albumina DM 1 e DM 2, em comparação às células tratadas com albumina C. As albuminas DM 1 e DM 2 reduziram a captação de 3H colesteril oleoil éter de HDL por células que superexpressam o receptor SR-BI. Estes resultados também foram obtidos com albumina humana modificada in vitro por glicação avançada. As albuminas isoladas dos pacientes diabéticos aumentaram a expressão de receptores envolvidos na captação de LDL modificadas e de proteínas que modulam vias da homeostase do colesterol. Os resultados deste estudo evidenciaram que a modificação in vivo da albumina por glicação avançada prejudica o transporte reverso de colesterol no diabete melito, por reduzir a expressão de ABCA-1 e a remoção de colesterol de macrófagos, bem como a captação seletiva de colesterol esterificado de HDL pelo SR-BI. Independentemente de variação na concentração e composição de HDL, a glicação da albumina pode contribuir para o acúmulo de lípides em macrófagos e gênese da aterosclerose no diabete melito / Advanced glycation end products are prevalent in diabetes mellitus and alter lipids and lipoprotein metabolism. In this study we analyzed the role of albumin, isolated from control individuals (C, n = 12) and uncontrolled type 1 (DM 1, n = 13) and type 2 (DM 2, n = 11) diabetes mellitus patients on macrophage cholesterol removal, intracellular lipid accumulation, expression of the HDL receptor protein level, ABCA-1and the uptake of esterified cholesterol from HDL. It was also investigated the differential gene expression in macrophages treated with C, DM 1 or DM 2 albumin. Glycated albumin was higher in DM 1 and DM 2 groups as compared to C and was positivetly correlated with glycemia, glycated hemoglobin and fructosamine. Serum albumin was isolated by fast protein liquid chromatography and alchoolic extraction. DM 1 and DM 2 albumin presented a higher amount of carboxymethyllysine and apo A-I as compared to C albumin. In order to determine cholesterol efflux acetylated LDL and 14C-cholesterol enriched J- 774 macrophages were treated with C, DM 1 or DM 2 albumin and then incubated in the absence or presence of apo A-I, HDL3 or HDL2. Although presenting a higher ability to remove cell cholesterol by itself, DM 1 and DM 2 albumin reduced cholesterol efflux mediated by apo A-I (70% e 45%, respectively) and by HDL2 (55% e 54%, respectively) as compared to C albumin. With HDL3 the reduction of the cholesterol efflux was only observed in macrophages treated with DM 2 albumin (55%) in comparison to C albumin. Macrophages incubated with C, DM 1 or DM 2 albumin alone presented similar amount of intracellular lipids as assessed by Oil Red O staining. The addition of apo A-I, HDL3 or HDL2 reduced the lipid content in cells treated with C albumin, but not in those exposed to DM 1 or DM 2 albumin. The expression of ABCA-1 was reduced 82% and 25% in macrophages treated, respectively, with DM 1 or DM 2 albumin, in comparison to C albumin. DM 1 and DM 2 albumin reduced the uptake of 3H colesteril oleoyl ether from HDL by SR-BI overexpressing cells. These findings also were obtained when cells were treated in vitro with human serum albumin submitted to advanced glycation. DM 1 and DM 2 albumin enhanced the expression of receptors involved in the uptake of modified LDL and cholesterol homeostasis. Our findings showed that the advanced glycation of albumin that takes place in diabetes mellitus impairs the reverse cholesterol transport efficiency by reducing the ABCA-1 expression and cholesterol exportation to HDL and also by diminishing the uptake of esterified cholesterol from HDL. Independently of changes in HDL composition and concentration, advanced glycated albumin contributes to cholesterol accumulation in macrophages and atherogenesis in diabetes mellitus

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:28:02Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-03-26Bitstream added on 2014-06-13T19:15:56Z : No. of bitstreams: 1 frasnelli_sct_me_arafo.pdf: 758242 bytes, checksum: fc10d5e79dcb4b386aacc5d2776f572c (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Diabetes mellitus se caracteriza pelo acúmulo de produtos finais da glicação avançada (AGEs) que ativam seu receptor RAGE. Entre as complicações associadas ao diabetes está a modulação da resposta imune, evidenciada pela maior susceptibilidade à infecção em diabéticos. O sistema imune percebe e reaje aos microrganismos por meio de receptores de padrões moleculares (receptores semelhantes à Toll, TLRs). Lipopolissacarídeo da parede celular (LPS) é um dos principais fatores de virulência de microrganismos Gramnegativos e é reconhecido principalmente por TLR4. A hipótese deste trabalho é que a ativação de RAGE e TLR4 por seus ligantes pode resultar em efeito sinérgico na modulação da proliferação, morte celular e expressão de citocinas inflamatórias por células mononucleares do sangue periférico (PBMC). Foram selecionados 7 indivíduos não diabéticos e 6 indivíduos portadores de diabetes tipo 2 para coleta de PBMCs. Estas células foram estimuladas com LPS bacteriano e BSA glicado, isoladamente e combinados, na presença e na ausência de inibidores dos receptores RAGE e TLR4. Proliferação e morte celular foram avaliadas por contagem direta em hemocitômetro e citometria de fluxo, respectivamente. A expressão de citocinas e quimiocinas inflamatórias foi avaliada por RT-qPCR, enquanto a modulação do padrão de resposta imune adaptativa foi estudada por meio de citometria de fluxo. Os resultados mostram 18 18 que PBMCs de pacientes portadores de diabetes tendem a ser mais resistentes à indução de morte celular. De um modo geral, a inibição dos receptores RAGE e TLR4 não interfere na atividade metabólica e viabilidade celular em diabéticos e não diabéticos. A expressão gênica de CCL3 e CCR5 não foi regulada pelos receptores RAGE e TLR, sendo discretamente mais elevada em pacientes não diabéticos. A expressão de TNF-α e IL-10 foi regulada... / Diabetes mellitus is characterized by the progressive accumulation of advanced glycation end-products (AGEs), which bind and activate their membrane-bound receptor (RAGE) on a variety of target cells. Modulation of the immune response is one of the diabetes-associated complications and is reflected on the increased susceptibility of diabetes patients to infections and sepsis. The immune system senses and reacts to microorganisms by pattern-recognition receptors, such as Toll-like receptors (TLRs). Bacterial lipopolysaccharide (LPS) is a major virulence factor of Gram-negative microorganisms, which is recognized mainly by TLR4. The hypothesis of this study is that of a synergism between activated TLR4 and RAGE that modulates the response of cells of innate and adaptive immunity in the circulation (peripheral blood monocytic cells, PBMCs). PBMCs were collected from 13 volunteers (7 with type 2 diabetes and 6 systemically-healthy controls). The cells were stimulated with bacterial LPS and glycated bovine serum albumin (AGE-BSA), both independently and in association. To study the role of TLR4 and RAGE signaling, these stimulations were performed in the presence and absence of specific inhibitors of RAGE and TLR4. We used direct counting in a hemocytometer and flow cytometry, respectively, to assess cell proliferation and 20 20 death. The expression of selected cytokines and receptors was studied by RTqPCR, whereas the effect of these stimuli on the modulation of T helper-type response was determined by flow cytometry. We observed increased cell survival in PBMCs from diabetic patients. Inhibition of RAGE and TLR4 had no marked effect on cell proliferation, metabolic activity and survival. Gene expression of CCL3 (MIP-1alpha) and CCR5 was discretely higher in PBMCs from non-diabetic patients and was not affected by RAGE or TLR4 signaling... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Carlos Rossa Junior / Coorientador: Silvana Regina Perez Orrico / Banca: José Eduardo Cezar Sampaio / Banca: Sandra Helena Penha de Oliveira / Resumo: Diabetes mellitus se caracteriza pelo acúmulo de produtos finais da glicação avançada (AGEs) que ativam seu receptor RAGE. Entre as complicações associadas ao diabetes está a modulação da resposta imune, evidenciada pela maior susceptibilidade à infecção em diabéticos. O sistema imune percebe e reaje aos microrganismos por meio de receptores de padrões moleculares (receptores semelhantes à Toll, TLRs). Lipopolissacarídeo da parede celular (LPS) é um dos principais fatores de virulência de microrganismos Gramnegativos e é reconhecido principalmente por TLR4. A hipótese deste trabalho é que a ativação de RAGE e TLR4 por seus ligantes pode resultar em efeito sinérgico na modulação da proliferação, morte celular e expressão de citocinas inflamatórias por células mononucleares do sangue periférico (PBMC). Foram selecionados 7 indivíduos não diabéticos e 6 indivíduos portadores de diabetes tipo 2 para coleta de PBMCs. Estas células foram estimuladas com LPS bacteriano e BSA glicado, isoladamente e combinados, na presença e na ausência de inibidores dos receptores RAGE e TLR4. Proliferação e morte celular foram avaliadas por contagem direta em hemocitômetro e citometria de fluxo, respectivamente. A expressão de citocinas e quimiocinas inflamatórias foi avaliada por RT-qPCR, enquanto a modulação do padrão de resposta imune adaptativa foi estudada por meio de citometria de fluxo. Os resultados mostram 18 18 que PBMCs de pacientes portadores de diabetes tendem a ser mais resistentes à indução de morte celular. De um modo geral, a inibição dos receptores RAGE e TLR4 não interfere na atividade metabólica e viabilidade celular em diabéticos e não diabéticos. A expressão gênica de CCL3 e CCR5 não foi regulada pelos receptores RAGE e TLR, sendo discretamente mais elevada em pacientes não diabéticos. A expressão de TNF-α e IL-10 foi regulada... (Resumo completo, clicar acesso eletr^ônico abaixo) / Abstract: Diabetes mellitus is characterized by the progressive accumulation of advanced glycation end-products (AGEs), which bind and activate their membrane-bound receptor (RAGE) on a variety of target cells. Modulation of the immune response is one of the diabetes-associated complications and is reflected on the increased susceptibility of diabetes patients to infections and sepsis. The immune system senses and reacts to microorganisms by pattern-recognition receptors, such as Toll-like receptors (TLRs). Bacterial lipopolysaccharide (LPS) is a major virulence factor of Gram-negative microorganisms, which is recognized mainly by TLR4. The hypothesis of this study is that of a synergism between activated TLR4 and RAGE that modulates the response of cells of innate and adaptive immunity in the circulation (peripheral blood monocytic cells, PBMCs). PBMCs were collected from 13 volunteers (7 with type 2 diabetes and 6 systemically-healthy controls). The cells were stimulated with bacterial LPS and glycated bovine serum albumin (AGE-BSA), both independently and in association. To study the role of TLR4 and RAGE signaling, these stimulations were performed in the presence and absence of specific inhibitors of RAGE and TLR4. We used direct counting in a hemocytometer and flow cytometry, respectively, to assess cell proliferation and 20 20 death. The expression of selected cytokines and receptors was studied by RTqPCR, whereas the effect of these stimuli on the modulation of T helper-type response was determined by flow cytometry. We observed increased cell survival in PBMCs from diabetic patients. Inhibition of RAGE and TLR4 had no marked effect on cell proliferation, metabolic activity and survival. Gene expression of CCL3 (MIP-1alpha) and CCR5 was discretely higher in PBMCs from non-diabetic patients and was not affected by RAGE or TLR4 signaling... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

A levedura Kluyveromyces marxianus, apesar de apresentar propriedades fisiológicas vantajosas para a produção heteróloga de proteínas, foi utilizada apenas poucas vezes como hospedeira na síntese dessa classe de moléculas. Em contrapartida, a sua congênere Kluyveromyces lactis possui mais de 40 sistemas de expressão desenvolvidos, inclusive comerciais. Além disso, não há literatura disponível sobre glicosilação de proteínas em K. marxianus. Levando-se isso em consideração, este trabalho visou a desenvolver sistemas para a expressão heteróloga da enzima glicose oxidase (GOX) de Aspergillus niger e de uma esterase termófila (EST) de Thermus thermophilus em K. marxianus. A linhagem K. lactis CBS 2359 foi utilizada como parâmetro de comparação em todos os sistemas de expressão construídos. Primeiramente, foi realizado um estudo fisiológico com a finalidade de selecionar, dentre três linhagens de K. marxianus pré-selecionadas a partir de informação da literatura, a que apresentasse as melhores características fisiológicas para se tornar uma hospedeira de expressão heteróloga. A linhagem selecionada foi a CBS 6556, baseando-se numa combinação das seguintes características: velocidade específica de crescimento, formação de metabólitos, rendimento de substrato em biomassa e secreção da enzima homóloga inulinase. Após, foram construídos dois sistemas de expressão epissomais. No primeiro, o gene era expresso sob controle do promotor PGK de S. cerevisiae e no segundo, sob controle de INU1 de K. marxianus. Um sistema integrativo foi utilizado, no qual a expressão era dirigida pelo promotor INU1. Estudos bioquímicos e de glicosilação foram realizados nas enzimas produzidas. Em relação aos sistemas para expressão de GOX, foram alcançados níveis de produção de 1722 U/gMS (unidades por grama de biomassa seca) em K. marxianus transformado com o sistema epissomal no qual a expressão era controlada pelo promotor INU1. As caracterizações bioquímicas da enzima mostraram que a molécula produzida apresentava propriedades semelhantes à enzima homóloga de A. niger. Além disso, os estudos de glicosilação mostraram uma menor tendência de hiperglicosilação de K. marxianus quando comparada com K. lactis. Já em relação à esterase, K. lactis apresentou maiores níveis de expressão (294 U/gMS), porém a enzima produzida em K. marxianus apresentou temperatura ótima de atividade (50 °C) ligeiramente superior à enzima produzida por sua congênere (45 °C), temperaturas abaixo da qual ocorre maior atividade da enzima homóloga (65 °C). Isso pode ser explicado pela glicosilação exercida por ambas espécies de leveduras sobre a proteína, ao contrário da homóloga, não glicosilada. Além disso, os produtos das leveduras apresentaram três padrões de glicosilação. Dessa forma, o trabalho desenvolvido alcançou seu objetivo de desenvolver esses sistemas de expressão, bem como de avaliar a síntese heteróloga de proteínas nessa levedura de destacado potencial. Os resultados obtidos devem servir à comunidade científica, no sentido de estimular e orientar futuros trabalhos que objetivem a síntese heteróloga de proteínas em microrganismos. / In spite of the advantageous physiological properties of the yeast Kluyveromyces marxianus to produce heterologous proteins, this species has not been widely explored for the synthesis of these biomolecules. On the other hand, more than 40 heterologous expression systems, including commercial ones, were developed for Kluyveromyces lactis. Moreover, there is no available literature concerning heterologous protein glycosylation in K. marxianus. Taking these facts into account, this work aimed at developing systems for the heterologous production of Aspergillus niger glucose oxidase (GOX) and of a thermophilic esterase (EST) from Thermus thermophilus in K. marxianus. The strain K. lactis CBS 2359 was utilized as a reference throughout the whole work. First, a physiological study was carried out in order to select one K. marxianus strain, out of three which had been chosen based on literature information, that exhibited the best physiological traits to be a heterologous expression host. The chosen strain was CBS 6556, based on a combination of the following properties: specific growth rate, metabolites formation, biomass yield on substrate, and secretion of the homologous enzyme inulinase. Subsequently, two episomal systems were constructed. In one of them, the heterologous gene was expressed under control of the S. cerevisiae PGK promoter, whereas in the other system, heterologous gene expression occurred under control of the K. marxianus INU1 promoter. An integrative expression system was also constructed, in which the KmINU1 promoter drove foreign gene expression. Both heterologous enzymes were characterized biochemically and also with respect to their glycosylation. The results attained with GOX led to an expression level of 1722 U/g DW (unit per gram of dry cell weight) in K. marxianus transformed with the episomal INU1-based system. The biochemical studies showed that the enzyme was very similar to the A. niger GOX. Furthermore, analysis of the glycosylation pattern showed a lower tendency of K. marxianus to hypermannosylate proteins, when compared to K. lactis. Higher levels of esterase (294 U/gDW) were obtained in K. lactis than in K. marxianus. However, the enzyme produced in the latter host presented a higher temperature for maximal activity ((50 °C), when compared to the former organism (45 °C). Both values are lower than the temperature for maximal activity of the homologous enzyme (65 °C), which can be explained by the glycans added by both yeast species to the peptide, resulting in a glycosylated protein, in contrast to the homologous esterase. Moreover, the yeast products presented three glycosylation patterns. In conclusion, the work presented in this thesis reached its aims, which were to develop these expression systems and to characterize biochemically the heterologous enzymes expressed, which included an analysis of the glycosylation pattern. The results presented here will certainly be of interest and aid the scientific community working on the expression of heterologous proteins in microorganisms.

Infectious bronchitis virus (IBV) is the causative agent of an economically important disease of poultry. In Brazil this disease causes respiratory, renal and reproductive problems in birds of all ages, despite constant vaccination with the Massachusetts strain H120. This lack of immunological protection is known to be due the genetic variation in the spike glycoprotein of IBV, which is involved in host cell attachment, neutralization and the induction of protective immunity. Brazilian IBV variants resulting of this genetic variation are present since the 80s and this study aimed to epidemiologicaly analyze and molecularly characterize the existing variants during 2010-2015 and perform a bioinformatics analysis of the available sequences of IBV variants in a 40 year period. Of the 453 samples tested, 61.4% were positive for IBV and 75.9% of them were considered variants and were detected in birds of all ages, distributed in all five Brazilian regions. A fragment of 559-566 bp was obtained from 12 isolates, where BR-I was the predominant variant while only one isolate belonged to the BR-II genotype. Bioinformatics analysis of the sequences of 40 years of Brazilian IBV variants was performed and the ratio of non-synonymous substitutions per non-synonymous site (dn) to synonymous substitutions per synonymous site (ds) dN/dS was calculated. It revealed a predominance of codons with non-synonymous substitutions in the first third of the S1 gene and a dN/dS ratio of 0.6757, indicating that this portion of the gene was under negative selection. Additionally prediction of N-glycosilation sites showed that most of the BR-I variants (from 2003 to early 2014) present an extra site at animoacid position 20, while the newest ones lack this feature.Together these results suggest that IBV Brazilian variants had probably suffered drastic mutations in some points between the years 1983 to 2003 and after achieving an antigenic structure effective enough for invasion and replication in their hosts, the selection processes became silent. / O vírus da bronquite infecciosa das galinhas (IBV) é o agente causador de uma doença aviária economicamente importante. No Brasil, esta doença ocasiona problemas respiratórios, renais e reprodutivos em aves de todas as idades, apesar da vacinação constante com a cepa Massachusetts H120. Esta falha na proteção conferida pela vacina é ocasionada por mutações nos nucleotídeos do gene da glicoproteína da espícula, a qual está envolvida no processo de interação comas células do hospedeiro, a neutralização e a indução de imunidade protetora. As variantes brasileiras resultantes dessa mutação genética estão presentes desde os anos 80 e este estudo teve como objetivo analisar epidemiologicamente e caracterizar molecularmente os vírus variantes existentes durante 2010-2015 e realizar uma análise bioinformática das sequências disponíveis no GenBank em um período de 40 anos. Das 453 amostras analisadas, 61,4% foram positivas para IBV e 75,9% delas foram consideradas variantes e foram detectados em aves de todas as idades, distribuídos em todas as 5 regiões do Brasil. Um fragmento de 559-566 pb foi obtido a partir de 12 isolados, onde BR-I foi a variante predominante ao contrario que apenas um isolado pertencia ao genótipo BR-II. Análise bioinformática de 40 anos de variantes do IBV brasileiros revelou uma predominância de codões com as substituições não sinónimos no primeiro terço do gene S1 e uma relação dN / dS de 0,6757, indicando que esta porção do gene estava sob selecção negativa. Além disso a previsão de pontos de de N-glicosilação mostrou que a maioria das amostras variantes BR-I (entre o 2003 e início de 2014) apresentam um ponto adicional na posição 20, enquanto as variantes mais novas não apresentam esse ponto de nglicosilação. Estes resultados sugerem que as variantes brasileiras teriam sofrido mutações provavelmente drásticas em alguns pontos do genoma, entre os anos de 1983 a 2003 e depois de atingir uma estrutura antigênica eficaz o suficiente para a invasão e replicação em seus hospedeiros, o processo de seleção mudou para seleção negativa.

Este trabalho procurou avaliar algumas isozimas envolvidas com o processo de degradação de polissacarídeos da parede celular vegetal, encontradas em Aspergillus versicolor, fungo pertencente a um gênero onde a multiplicidade de componentes enzimáticos com a mesma atividade oscila de uma a três. Duas ß-xilosidases foram purificadas por meio de DEAE-celulose e precipitação com sulfato de amônia. Ambas mostraram-se enzimas que, quando deglicosiladas por PNGaseF, apresentam mesmos mapas trípticos. A glicosilação mostrou-se importante para a manifestação de diferenças bioquímicas relacionadas às interações com ambiente eletrolítico adjacente, visto as mudanças das curvas de pH e alterações de comportamento frente a sais de íons metálicos, tão bem como para a manutenção do funcionamento das enzimas. Também foi verificado que as diferentes formas glicosiladas periplásmicas são produzidas em meios distintos (xilana e xilose), cujos pH finais corresponderam aos pH das enzimas encontradas. Por meio de zimogramas, verificou-se que estas não eram produzidas de imediato, mas selecionadas ao longo do tempo de cultivo. Esta seleção foi inicialmente independente do pH, visto este, mesmo tamponado, ser corrigido pelo fungo, de modo a se apresentar, ao final de 48h, correlato com o da enzima selecionada. Exame cromatográfico em Concanavalina-A das enzimas deglicosiladas por EndoH mostraram que a oriunda de xilana tem aporte maior de ramificações biantenárias, que são ricas em galactose. Ambas apresentaram mapas trípticos iguais. A ß-xilosidase induzida por xilana apresentou proporções de manose, galactose e glucose iguais a 69,68 : 30,25 : 0,056 %, respectivamente, enquanto que ß-xilosidase induzida por xilose apresentou proporções iguais a 85,35 : 14,54 : 0,094%, respectivamente, resultado que corrobora com a resultado anterior. Duas ß-glucosidases de superfície micelial foram purificadas por meio de DEAE-Sephacel e DEAE-celulose. Ambas mostraram-se mais semelhantes entre si que as ß-xilosidases, e independentes de fonte de carbono ou pH. No entanto, apresentaram diferenças frente à inibição por celobiose (acentuada a partir de 10mM para ß-glucosidase I e 20mM para B-glucosidase II) e, embora sutis, a pH. Após serem submetidas a 45 ºC por 30min (temperatura que induziu segunda conformação estável) mostraram curvas de pH muito distintas, que foram eliminadas nas enzimas submetidas ao mesmo experimento após deglicosilação por PNGaseF. Ambas apresentaram mapas trípticos iguais. A ß-glucosidase I mostrou-se constituída de Man:Gal:Glu em proporções iguais a 78,36%:21,61%:0,033% do carboidrato total, respectivamente, e a ß-glucosidase II, Man:Gal:Glu iguais a 83,59%:16,38%:0,028%, respectivamente. Ambas também apresentaram sinergismo quando juntas. Sobre celobiose, foi verificado apenas em pH acima de 5.5. Sobre celooligossacarídeos, manifestou-se em pH 5,25. A ß-glucosidase I foi menos ativa que a ß-glucosidase II quando em ausência de glucose e celobiose na solução de reação inicial, situação na qual o contrário foi verdadeiro. O sinergismo foi drasticamente eliminado após deglicosilação por PNGaseF. Não se sabe se este resultado foi oriundo de mudanças cinéticas provocadas pela deglicosilação ou de uma possível eliminação de agregação anteriormente existente entre glicosiladas. O componente ß-glicosidásico extracelular foi purificado por meio de DEAE-Sephacel e Octyl-Sepharose, e se revelou um heteroagregado de fosfatase ácida com ß-glicosidase, que se mostrou estável e ativo em ampla gama de temperaturas e pH, com ótimos de 55ºC e 5,5, respectivamente. Entretanto, os perfis das curvas foram distintos entre as enzimas componentes. Somente concentrações superiores a 0,8mM de cloreto de cobalto apresentaram efeito desagregador, podendo ser empregado em conjunto com DEAE-celulose para purificação das enzimas isoladas. Quando separadas, fosfatase mostrou-se 260% mais ativa e ß-glicosidase, 50% menos ativa. Nesta condição, as faixas de pH se restringiram, acidificando-se, localizando-se entre pH 4,0 e 5,5. Aparentemente, a agregação reforça a atividade celobiásica. Fosfatase foi ativa sobre farelo de trigo e fitato de sódio e adsorveu fortemente em farelo de trigo. ß-glicosidase apresentou atividade sobre farelo de trigo, xilana e Avicel (liberando apenas glicose desta última), revelando-se enzima com atividade celobioidrolásica inespecífica, embora ávida por celobiose. As atividades foram determinadas como oriundas do mesmo sítio catalítico. ß-glicosidase não foi seqüestrada por farelo de trigo quando desagregada, resultado invertido quando reagregada. O seqüestro por farelo de trigo, aparentemente, deveu-se a interações entre sítio catalítico da fosfatase e substrato. / This study explored enzyme multiplicity on hemicelllulose and cellulose degrading systems. It first demonstrates the differences of PNGaseF deglycosylation and EndoH deglycosylation on forms of two ß-glicosidase activities present on surface of mycelia from Aspergillus versicolor grown on several carbon sources. Aspergillus versicolor produces ß-xylosidases with different biochemical properties and different degree of glycosylation, when grown on xylan or xylose. Were investigated the biochemical properties of these ß-xylosidases after deglycosylation. The purified enzymes were deglycosylated with endo-H or PNGase F. After this treatment both enzymes migrated faster in PAGE exhibiting the same Rf. On SDS-PAGE both enzymes showed similar migration. The optima temperature of xylan-induced and xylose-induced ß-xylosidases was 45 ºC and 40 ºC, respectively, and of 35 ºC after deglycosylation. The xylan-induced enzyme was more active at acidic pH than the xylose-induced enzyme. After deglycosylation the optimum pH of both enzymes was 6.0. The thermal resistance of the enzymes at 55 ºC showed a half-life of 15 min and 9 min for xylose-and xylan-induced enzymes, respectively. After deglycosylation both exhibited half-lives of 7.5. Native enzymes exhibited different response to ions, while deglycosylated enzymes exhibited identical sensitivity to ions. Limited proteolysis yielded coincident profiles in SDS-PAGE for both deglycosylated enzymes. All data suggest that the two A.versicolor ß-xylosidases share a common polypeptide core with differential glycosylation, apparently responsible for their biochemical and biophysical differences. Aspergillus versicolor also produced ß-glucosidases with different biochemical properties and different degree of glycosylation independently of carbon source. ß-Glucosidase I differed from ß-glucosidase II principally considering the amount and composition of carbohydrate, sensitivity to ions and pH. The purified enzymes shared the same tripitic maps and molecular masses after deglycosylations. All results showed that the biochemical differences observed for two enzymes were directly linked to PNGaseF- deglycosylation. Considering that Rfs, elution profiles on Con-A and residual glycosylation of both enzymes treated with EndoH or PNGaseF were the same, but differed on the mannose/galactose ratio, we inferred differences on proportion of hybrid-type/high-mannose-type glycans. The significance of this glycoform diversity was stressed in analysis of the action of mixture of both ß-glucosidases on celooligosoccharides and on cellobiose. This synergism was abolished after PNGaseF deglycosylation. These results are the first to show synergism between glycoforms of glycosil-hydrolases, representing a new class of synergistic type. The work also described a new form of aggregation between enzymes. Generally, ß-glycosidases are described as soluble components, attached to cell wall or free in the culture medium. This work verified that it could be extracelular adsorbed to wheat straw when aggregated with an acid phosphatase. The results strongly suggested that phosphatase is the component responsible for the process of adsorption on the substrate. The disaggregation was cobalt mediated, being not observed for another ions. The aggregation state has positive effects on glycosidase activity, extending pH ratio and increasing hydrolysis velocity. The opposite was found to phosphatase activity.

Made available in DSpace on 2014-07-29T16:11:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Keyla Rejane Magno.pdf: 1794858 bytes, checksum: 9cd1c907ace1356742b91041a2db9ea1 (MD5) Previous issue date: 2011-02-25 / The study of bioconversion of biologically active compounds by microorganisms, mainly filamentous fungi and their possible glycosylated derivatives have been extensively explored and have brought promising results. Microbial models of animal metabolism, based on the similarity of the hepatic metabolism and microbial enzyme, became an alternative for the elucidation of metabolic routes of both drugs as well as new drug candidates. In this context, the objective of this study was to explore the ability of filamentous fungi to promote the bioconversion of entacapone and perform the identification, purification and characterization of derivatives formed. We selected eight filamentous fungi Absidia blakesleana ATCC 26617, Aspergillus candidus ATCC 1009, Beauveria bassiana ATCC 7159, Beauveria sp, Cunninghamella echinulata ATCC 9244, Cunninghamella echinulata ATCC 9245, Cunninghamella elegans ATCC 26169 and Rhizopus arrhizuz ATCC 11145, six of them proved to be effective in the metabolism of entacapone, Cunninghamella echinulata ATCC 9245 being the most promising. Were detected 5 different functionalized derivatives, one of which the majority was characterized by Nuclear Magnetic Resonance of Carbon (13C NMR) and Hydrogen (1H NMR), High-Performance Liquid Chromatography coupled to Mass Spectrometer (HPLC-MS/MS) and Infrared Spectroscopy (IR) as a β-glycosylated derivative of entacapone (E, Z): 4 hydroxy-5-nitrophenyl-3-O-(β)-D-glucopyranose-(E)-2-cyano-N, N-diethyl-3-acrylamide. / O estudo da bioconversão de compostos biologicamente ativos por microrganismos, principalmente fungos filamentosos, e seus possíveis derivados glicosilados têm sido bastante explorado e têm trazido resultados promissores. Os modelos microbianos do metabolismo animal, baseados na similaridade do metabolismo hepático e enzimático microbiano, tornaram-se uma alternativa para a elucidação da rota metabólica tanto de fármacos bem como de candidatos a novos fármacos. Nesse contexto, o objetivo desse trabalho foi explorar a capacidade dos fungos filamentosos em promover a bioconversão da entacapona e realizar a identificação, purificação e caracterização dos derivados formados. Foram selecionados oito fungos filamentosos Absidia blakesleeana ATCC 26617, Aspergillus candidus ATCC 1009, Beauveria bassiana ATCC 7159, Beauveria sp, Cunninghamella echinulata ATCC 9244, Cunninghamella echinulata ATCC 9245, Cunninghamella elegans ATCC 26169 e Rhizopus arrhizuz ATCC 11145, seis deles demonstraram ser eficazes na metabolização da entacapona, sendo a Cunninghamella echinulata ATCC 9245 a mais promissora. Foram detectados 5 diferentes derivados funcionalizados, dos quais um, o majoritário, foi caracterizado por Ressonância Magnética Nuclear de Carbono (RMN 13C) e Hidrogênio (RMN 1H), Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada a Espectrometria de Massa (CLAE-EM/EM) e Espectroscopia no Infravermelho (IV) como derivado β-glicosilado da entacapona (E, Z): 4 hidroxi-5-nitrofenil-3-O-(β)-D-glicopiranose-(E)-2-ciano-N,N-dietil-3-acrilamida.

Um dos pré-requisitos para a produção economicamente viável de etanol a partir da biomassa lignocelulósica é o desenvolvimento de processos eficientes e baratos de hidrólise enzimática de celulose e hemicelulose. As enzimas respondem por altas percentagens dos custos de hidrólise, pois é necessário utilizar altas cargas enzimáticas para obter rendimentos aceitáveis devido à inibição das enzimas lignocelulolíticas pelos produtos, que se intensifica com o uso de altas concentrações iniciais de biomassa. Uma das estratégias para melhorar a eficiência e diminuir os custos da hidrólise é a identificação de enzimas mais eficientes, com grande atenção para aquelas tolerantes e/ou estimuladas pelos produtos de reação. Nesse contexto, a engenharia de proteínas é uma poderosa ferramenta para o melhoramento e o entendimento da relação estrutura-função destas enzimas. O presente trabalho visou avaliar o efeito da glicosilação sobre as características bioquímicas de uma - glucosidase estimulada por glicose e xilose de Humicola insolens, comparando a enzima nativa e as enzimas recombinantes, expressas em Escherichia coli (Bglhi) e Pichia pastoris (BglhiPp), além de estudar a relação estrutura-função por meio de técnicas de evolução dirigida objetivando o entendimento dos mecanismos envolvidos na estimulação da enzima pelos monossacarídeos. Com relação à glicosilação, a expressão e caracterização da BglhiPp permitiu avaliar que as principais características influenciadas por diferentes conteúdos de carboidratos na enzima foram a temperatura ótima e a termoestabilidade. Já o estudo de evolução dirigida culminou na geração de 4 mutantes com padrão de estimulação por glicose e xilose diferentes da Bglhi (utilizada como controle). Todos os mutantes contêm uma das duas substituições (D237V e N235S) agrupadas ao redor dos subsítios de ligação da aglicona (+1 e +2). Os dados cinéticos e de transglicosilação permitiram sugerir que o mecanismo de estimulação destas enzimas envolve interações alostéricas, modulação das rotas de hidrólise e transglicosilação e competição entre substrato e monossacarídeos pela ligação aos subsítios do sítio ativo. A mutação D237V (presente nos mutantes 4-12D e 5-7H) favoreceu a rota de hidrólise em detrimento à de transglicosilação e a atividade pNP-glucosidásica, mas não a celobiásica, foi estimulada por xilose. A substituição N235S (presente nos mutantes 1-6D e 5-7C) aboliu a preferência por hidrólise ou transglicosilação e a atividade celobiásica, mas não a pNP-glucosidásica, foi fortemente inibida por xilose. Além disso, ambas as mutações diminuíram a tolerância das enzimas pelos monossacarídeos. Estes resultados mostraram que a modulação fina da atividade da Bglhi e das enzimas dos mutantes por glicose e/ou xilose é regulada pelas afinidades relativas dos subsítios da glicona e da aglicona pelos substratos e pelos monossacarídeos livres. As mudanças na topologia e nas propriedades físico-químicas dos subsítios +1 e +2 da aglicona foi proposta por racionalizar os dados cinéticos e de transglicosilação. / One of the prerequisites for the economically viable production of ethanol from the lignocellulosic biomass is the development of efficient and inexpensive processes of enzymatic hydrolysis of cellulose and hemicellulose. The enzymes are responsible for high percentages of hydrolysis costs, since it is necessary to use high enzymatic loads for acceptable yields due to inhibition of lignocellulolitic enzymes by products, which is intensified by the use of high initial concentrations of biomass. One of the strategies to improve efficiency and decrease the costs of hydrolysis is the identification of more efficient enzymes with great attention to those that are tolerant and/or stimulated by the reaction products. In this context, protein engineering is a powerful tool for the improvement and understanding of the structure-function relationship of these enzymes. The present work aimed to evaluate the effect of glycosylation on the biochemical characteristics of glucose and xylose-stimulated -glucosidase from Humicola insolens, comparing the native enzyme and the recombinant enzymes expressed in Escherichia coli (Bglhi) and Pichia pastoris (BglhiPp) and study the structure-function relationship through directed evolution techniques aiming the understanding of the mechanisms involved in the stimulation of the enzyme by the monosaccharides. With regard to glycosylation, the expression and characterization of BglhiPp allowed to evaluate that the main characteristics influenced by different carbohydrate contents in the enzyme were optimum temperature and thermostability. The study of directed evolution culminated in the generation of 4 mutants with pattern of stimulation by glucose and xylose different from Bglhi (used as control). All mutants contain one of the two substitutions (D237V and N235S) grouped around the aglycone binding sites (+1 and +2). The kinetic and transglycosylation data allowed us to suggest that the mechanism of stimulation of these enzymes involves allosteric interactions, modulation of the hydrolysis and transglycosylation routes, and competition between substrate and monosaccharides by binding to the subsites in active site. The mutation D237V (present in mutants 4-12D and 5-7H) favored the hydrolysis route over that of transglycosylation and pNP-glucosidase activity, but not cellobiase activity, was stimulated by xylose. The substitution N235S (present in mutants 1-6D and 5-7C) abolished the preference for hydrolysis or transglycosylation and cellobiase activity, but not pNP-glucosidase activity, was strongly inhibited by xylose. In addition, both mutations decreased the tolerance of the enzymes by the monosaccharides. These results showed that fine modulation of Bglhi and mutant enzymes activities by glucose and/or xylose is regulated by the relative affinities of the glycone and aglycone subsites for the substrates and the free monosaccharides. The changes in the topology and physicochemical properties of the +1/+2 aglycone sites of the mutants have been proposed to rationalize the kinetic and transglycosylation data.