Submitted by Cláudia Bueno (claudiamoura18@gmail.com) on 2016-01-29T13:33:40Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Paula Leticia de Melo Souza - 2015.pdf: 1524602 bytes, checksum: 34e108b82c97baa593fc6a90a1e38b4b (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-02-01T11:43:57Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Paula Leticia de Melo Souza - 2015.pdf: 1524602 bytes, checksum: 34e108b82c97baa593fc6a90a1e38b4b (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-01T11:43:57Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Paula Leticia de Melo Souza - 2015.pdf: 1524602 bytes, checksum: 34e108b82c97baa593fc6a90a1e38b4b (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2015-02-12 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Biotransformations are powerful tools for optimization of active compounds, diversification and structural modifications, in addition to handling non-functionalized compounds unfeasible by chemical conventional methods. The versatility of microbial systems, in this context, and the numerous entitlements of filamentous fungi have leveraged the use of biotransformations with microorganisms. Glycosylations ate one of the most important and commom modification processes and the use of biocatalysts have set a favorable strategy to this type of reaction. Cunninghamella species, for its enzimatic arsenal, are widely applied, especially for enabling the production of novel drug and cell immobilization hás been evidenced as a tool to express its enzimatic activity.Considering the relevance of amino sugars and their enormous potential in various therapies, the aim of this study was to produce 5-(1-(3-fluorophenyl)-1H-pyrazol-4-yl)-1H-tetrazole (LQFM 021) derivatives, which contains tetrazole and pyrazole rings, by biotransformation with free and immobilized fungi cells of Cunninghamella echinulata ATCC 9244. Therefore, CLAE methodologies were developed for the analysis of biotransformation kinectics and characterization techniques employed (Nuclear Magnetic Resonance (NMR) and Mass Spectrometry with Ion cyclotron Resonance (FTICR-MS)) of the product. 96-hour incubations were proceeded with free cell Cunninghamella echinulata ATCC 9244, in the PDSM culture medium and immobilized cells in three separate experiments: biofilm incubated in PBS buffer, biofilm incubated in PDSM medium culture and reuse of biofilms, where one derivative was obtained. The structural characterization for the purified derivative obtained in sufficient quantities is a 1-(5-(1-(3-fluorophenyl)-1H-pyrazol-4-yl)-2H-tetrazol-2-yl)pentane-1,2,3,4,5-pentaol. / As biotransformações são ferramentas poderosas para otimização de compostos ativos, modificação e diversificação estrutural, além da manipulação de compostos não-funcionalizados inviável por métodos químicos tradicionais. A versatilidade dos sistemas microbiano, nesse contexto, e as inúmeras vantagens atribuídas aos fungos filamentosos alavancaram o uso das biotransformações com microorganismos. As glicosilações são um dos mais importantes e comuns processos de modificação e o uso de biocatalisadores tem configurado uma estratégia favorável a esse tipo de reação. Espécies de Cunninghamella, por seu arsenal enzimático, são extensamente aplicadas, principalmente por viabilizarem a produção de novos derivados de fármacos e a imobilização celular é evidenciada como uma estratégia para expressar essa atividade enzimática. Frente à relevância dos aminoaçúcares e seu enorme potencial terapêutico, o objetivo deste estudo foi produzir derivados do 5-(1-(3-fluorofenil)-1H-pirazol-4-il)-1H-tetrazol (LQFM 021), que contém anéis tetrazólico e pirazólico, a partir da biotransformação por células fúngicas livres e imobilizadas de Cunninghamella echinulata ATCC 9244. Para tanto, foram desenvolvidas metodologias para análise da cinética de biotransformação do LQFM 021, bem como empregadas técnicas de caracterização (Ressonância Magnética Nuclear (RMN) e Espectrometria de Massas com Ressonância Ciclotrônica de Íons (FTICR-MS) do produto obtido. Foram realizadas incubações de 96 horas com células livres de Cunninghamella echinulata ATCC 9244, em meio de cultura PDSM e com células imobilizadas em três experimentos distintos: biofilme incubado em tampão PBS, biofilme incubado em meio de cultura PDSM e reutilização dos biofilmes, em que foi obtido um derivado do LQFM 021.A proposta estrutural para o derivado obtido, purificado em quantidades suficientes, é de um 1-(5-(1-(3-fluorofenil)-1H-pirazol-4-il)-2H-tetrazol-2-il)pentano-1,2,3,4,5-pentaol.

Made available in DSpace on 2014-07-29T16:11:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao de Mestrado Juliana Penso.pdf: 783619 bytes, checksum: 6925a5dd78fd8cb85ac7d524f68cfe5b (MD5) Previous issue date: 2012-03-23 / A bioconversão utiliza o arsenal enzimático presente em sistemas biológicos para modificar quimicamente compostos orgânicos. Este trabalho descreve a utilização de cepas do fungo filamentoso Beauveria bassiana spp. na produção de derivados da naringenina, flavonóide de elevado interesse farmacoterapêutico, e a avaliação das suas potenciais atividades vasodilatadora e antiproliferativa. Realizou-se uma seleção que incluiu, além da cepa de Beauveria bassiana ATCC 7149, diversas cepas de Beauveria bassiana spp. isoladas de amostras de solo do cerrado brasileiro e denominadas: IP3a, IP6, IP8, IP11, IP94, IP98, IP127, IP132, IP147 e IP153. A cepa da coleção ATCC mostrou melhor perfil de produção de derivados e foi utilizada para ensaio em escala semipreparativa. O meio de cultura líquido Peptone Dextrose Soy Meal (PDSM) foi utilizado para a bioconversão de naringenina na concentração de 0,5 mg/mL, a 27ºC e 200 r.p.m. Após 96 horas da adição do substrato, o micélio foi removido por filtração, o sobrenadante extraído com acetato de etila e o micélio com acetona. A cromatografia em coluna das frações resultantes empregou sílica gel como fase estacionária e acetato de etila e metanol, na proporção 95:5, como fase móvel. Foi possível purificar um derivado com rendimento de 38%, que foi identificado por infravermelho, espectrometria de massas e ressonância magnética nuclear de 1H e 13C como naringenina-7-β-O-glicosídeo. O derivado foi avaliado quanto ao seu potencial vasodilatador utilizando o modelo de aorta de rato isolada e mostrou capacidade vasodilatadora menor que a apresentada pela naringenina. Entretanto, a naringenina e seu derivado glicosilado parecem exercer seu efeito vasodilatador por mecanismos diferentes. O potencial antiproliferativo do derivado 7-β-O-glicosilado e da naringenina também foi avaliado, in vitro, pelo método de exclusão do azul de tripano em células Jurkat, derivadas de leucemia linfoide humana aguda. O derivado não apresentou vantagem em relação ao composto inicial quanto à atividade antiproliferativa. O método de bioconversão apresentado é útil na bioconversão de naringenina a naringenina-7-β-O-glicosídeo em bons rendimentos. O derivado apresenta potencial antiproliferativo e vasodilatador, embora tais potenciais não sejam maiores do que o apresentado pelo composto inicial.

Submitted by Marlene Santos (marlene.bc.ufg@gmail.com) on 2016-08-30T17:41:02Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Júlia Martins Ulhôa Ferreira - 2016.pdf: 3148442 bytes, checksum: fc17d72cc71fdebb2a4ec57487e7cd21 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-08-31T13:05:08Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Júlia Martins Ulhôa Ferreira - 2016.pdf: 3148442 bytes, checksum: fc17d72cc71fdebb2a4ec57487e7cd21 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-31T13:05:08Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Júlia Martins Ulhôa Ferreira - 2016.pdf: 3148442 bytes, checksum: fc17d72cc71fdebb2a4ec57487e7cd21 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-08-16 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / The study of biotransformation is important in the evaluation of safety and efficacy and for developing of new drug candidates. The "microbial models of mammalian metabolism", in which microbial biotransformation is used for the purpose of predict and obtaining human metabolites, is an alternative method to the use of animals for this study. Several advantages such as lower cost, a greater quantity and variety of derivatives produced, using mild conditions of reaction and decreasing the use of toxic volatile organic solvents are observed. The aim of this study was to produce derivatives of diacerein (1,8-diacetoxy-3-carboxyanthraquinone) by biotransformation using filamentous fungi and to evaluate the cytotoxicity of the main derivatives obtained given the resurgence of interest in this class of compounds. The diacerein is an anthraquinone with a wide range of biological activities, like as anti-osteoarthritis, analgesic, anti-inflammatory, antipyretic, prevention of vascular disease, insulin resistance treatment, anticancer. Analytical methodologies have been developed for monitoring the production of derivatives by thin layer chromatography and high-performance liquid chromatography (HPLC). After screening with seventeen fungal strains, Aspergillus ochraceus ATCC 1009 and Cunninghamella echinulata ATCC 9245 were selected for incubation in semipreparative scale. Of these incubations rhein (the main human metabolite) was obtained, which was characterized using the techniques Nuclear Magnetic Resonance (NMR) 1H e 13C, High Resolution Mass Spectrometry (MS), spectrometry in the UV region and analysed by HPLC. Another derivative was obtained by incubation with Aspergillus ochraceus ATCC 1009 and characterized by MS and analyzed by HPLC being, possibly, glycosylated diacerein. The influence of the addition of cytochrome P450 inhibitor in the production of metabolites was performed and inhibited the production of rhein about 41%, which may indicate the involvement of CYP1A1 and CYP1A2 in the deacetylation reaction. The cytotoxic potential of diacerein and rhein was evaluated by the tetrazolium reduction method (MTT) assay using murine fibroblast cells 3T3 and tumor cell line B16F10 (melanoma). Both the rhein, as diacerein, have demonstrated cytotoxic potential against B16F10 cells. / O estudo da biotransformação é de fundamental importância na avaliação da segurança e eficácia e para o desenvolvimento de novos candidatos a fármacos. O “Modelo microbiano do metabolismo animal”, no qual a biotransformação microbiana é utilizada com a finalidade de prever e obter metabólitos humanos, representa um método alternativo ao uso de animais para esse estudo, uma vez que são observadas diversas vantagens como menor custo, maior quantidade e variedade de derivados produzidos, utilização de condições brandas de reação e redução da utilização de solventes orgânicos voláteis tóxicos. O objetivo deste estudo foi produzir derivados da diacereína (1,8-diacetoxi-3-carboxiantraquinona) por biotransformação, utilizando fungos filamentosos e avaliar a citotoxicidade dos principais derivados obtidos, em função do ressurgimento do interesse desta classe de compostos. A diacereína é uma antraquinona com ampla gama de atividades biológicas - antiosteoartrósica, analgésica, anti-inflamatória, antipirética, prevenção de doenças vasculares, tratamento de resistência à insulina, anticâncer. Metodologias analíticas foram desenvolvidas para o monitoramento da produção dos derivados por cromatografia em camada delgada e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Após triagem com dezessete cepas fúngicas, Aspergillus ochraceus ATCC 1009 e Cunninghamella echinulata ATCC 9245 foram selecionadas para incubações em escala semipreparativa. Dessas incubações obteve-se reína (o principal metabólito humano), a qual foi caracterizada utilizando as técnicas Ressonância Magnética Nuclear de 1H e 13C, Espectrometria de Massas de Alta Resolução (EM), Espectrometria na região do ultravioleta/visível e analisada por CLAE. Outro derivado foi obtido da incubação com Aspergillus ochraceus ATCC 1009 e caracterizado por EM e analisado em CLAE, sendo, possivelmente, a diacereína glicosilada. A influência da adição de inibidor do citocromo P450 na produção dos metabólitos foi realizada e inibiu a produção de reína em cerca de 41%, o que pode indicar o envolvimento do CYP1A1 e CYP1A2 na reação de desacetilação.O potencial citotóxico da diacereína e da reína foi avaliado pelo método de redução do tetrazólio (MTT) utilizando células de fibroblasto murino 3T3 e da linhagem tumoral B16F10 (melanoma). Tanto a reína, quanto a diacereína, demonstraram potencial citotóxico contra células B16F10.

Ao longo do processo de progressão tumoral, se observa alteração na expressão de glicoconjugados contendo oligossacarídeos N-ligados. Uma das formas mais comuns de glicosilação aberrante observada em células transformadas e em tumores humanos é representada por (poli)lactosaminas presentes em oligossacarídeos N-ligados. Estes glicanos são ligantes de galectina-3. Com o objetivo de identificar a expressão e distribuição dos ligantes de galectina-3 associados a processos fisiopatológicos, como a transformação maligna, desenvolvemos uma proteína quimérica, a galectina-3 conjugada a fosfatase alcalina (Gal-3/FA). Observamos que a Gal-3/FA possui a mesma especificidade de galectina-3 e que pode ser usada como sonda em ensaios de overlay e ensaios de imunoistoquímica. Entre os ligantes de galectina-3 identificamos a ?1 integrina, mediador de processos biológicos dependentes da interação célula-matriz como a migração celular. Linhagens de células de origem mesenquimal derivadas de tumores induzidos com metilcolantreno de animais selvagens (linhagens S11 e S12) e nulizigoto (linhagem ?12) para o gene da galectina-3 foram estabelecidas. Avaliamos a capacidade migratória dessas células e os nossos resultados mostraram que células que expressam galectina-3 são mais migratórias em superfícies de laminina-1. Este dado sugere que a galectina-3 seja um modulador positivo do processo de migração celular em superfícies de laminina-1. No entanto, o mecanismo pelo qual a galectina-3 medeia esse processo não é conhecido. Células que possuem fenótipo mais migratório apresentam um estado intermediário de adesão. Nós observamos que a galectina-3 se encontra nos complexos focais. Na presença de galectina-3 observamos diminuição de FAK fosforilado e recrutamento da fosfatase SHP-2 para os complexos focais. A diminuição de FAK fosforilado no lamelipódio leva ao turnover dos complexos focais e ao aumento da migração celular. Analisamos também a via de sinalização e observamos que a galectina-3 não ativa PAK. Contudo, o inibidor de PI3quinase, wortmanina, inibiu o efeito pró-migratório de galectina-3. Esses dados reforçam a noção do papel de galectina-3 na modulação do processo de migração de fibroblastos transformados, funcionando como uma molécula / Altered expression of cell surface N-linked oligosaccharides are often associated with malignant transformation of cells. One of the most common forms of aberrant glycosylation in transformed cells and human tumors is the highly elevated ?1,6 branching of N-linked oligosaccharides caused by increased expression of N-acetylglucosaminytransferase V (Mgat5). Galectin-3, a ?-galactoside binding protein, binds preferentially to poly-N-acetyllactosamines, which are the products of Mgat5. In order to exploit this hallmark of cancer cells, we have developed a tool for in situ identification of these tumors associated glycoconjugates. Human galectin-3 was fused to bacterial alkaline phosphatase, generating a hybrid molecule displaying both the carbohydrate binding properties of galectin-3 and enzymatic activity of alkaline phosphatase (Gal-3/FA). Gal-3/FA has the same fine of galectin-3 which was confirmed in direct binding assays. The tool presented herein was therefore useful for several immunoenzymatic assays, and will allow to establish whether the expression pattern of galectin-3 ligands have any physiological or clinical significance. We have identified ?1 integrin as a galectin-3 ligand. ?1 integrins are the actual effector of cell adhesion and migration. We have established cell lines from methylcholantrene-induced sarcomas from both wild type and galectin-3 null mice. In this system, galectin-3 null cells were less migratory than control cells in laminin-1. When galectin-3 was transiently expressed in galectin-3 null sarcoma cells, it inhibited cell adhesion to laminin-1 and stimulate the migratory response to laminin-1. The addition of exogenous galectin-3 also enhanced the migratory capacity of ?12 cells in a carbohydrate dependent way. Galectin-3 was found in focal contacts of ?12 cells where it may interact with many glycoproteins containing polyllactosamines on the cell surface. Here we showed that ?1 integrins are among them. Exogenously added galectin-3 led to a decrease in phosphorylated-FAK in lamellipodia and increased the recruitment of Shp-2 phosphatase of migrating cells. The effect of galectin-3 in migration was not dependent on the activation of the p21-activated kinase (PAK). Wortmannin inhibited the increased migration elicited by galectin-3, suggesting the involvement of the PI3-kinase signaling in the galectin-3 pathway. We propose that extracellular galectin-3 bound ?1integrins and disrupted the focal adhesion plaque, thus favoring cell migration.

O gênero Bothrops apresenta ampla distribuição pelo território brasileiro, sendo a espécie B. jararaca seu representante de maior importância médica na região sudeste. Análises genéticas e filogeográficas descrevem a existência de um grupo monofilético, denominado grupo Jararaca, que inclui, além da espécie B. jararaca, as espécies insulares B. alcatraz e B. insularis. A proximidade evolutiva entre estas espécies, cujo desenvolvimento se iniciou no Pleistoceno, e suas diferenças quanto à dieta, levantam subsídios para o entendimento de seus venenos e suas atividades biológicas. O objetivo deste estudo foi a caracterização dos componentes do veneno de B. alcatraz por diferentes metodologias analíticas com a finalidade de aprofundar o conhecimento sobre os venenos do gênero Bothrops e sobre a evolução dos venenos das espécies do grupo Jararaca. As abordagens analíticas utilizadas foram a avaliação do proteoma dos venenos do grupo Jararaca por eletroforese e identificação de proteínas por digestão com tripsina e análise por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS/MS), análise do N-terminoma e do peptidoma do veneno de B. alcatraz por LC-MS/MS e análise da glicosilação dos venenos do grupo Jararaca pelo tratamento com glicosidases, cromatografia de afinidade à lectinas (concanavalin A, ConA; wheat germ agglutinin, WGA; peanut agglutininin, PNA) e caracterização do N-glicoma por MSn. Os perfis eletroforéticos unidimensionais, obtidos com e sem redução das proteínas, mostraram que o veneno de B. alcatraz difere dos venenos de B. jararaca (adultos e filhotes) e do veneno de B. insularis (adultos). O perfil eletroforético bidimensional do veneno de B. alcatraz corroborou estas diferenças e revelou que a coleta do veneno na presença ou ausência de inibidores de proteinases tem influência no número de spots visualizados. Os resultados da análise dos proteomas dos venenos do grupo Jararaca mostraram que não há diferenças qualitativas significantes entre eles, e que os três apresentam um padrão similar de distribuição das classes de toxinas. A análise quantitativa label free dos proteomas revelou algumas diferenças, indicando que o veneno de B. alcatraz apresenta maior conteúdo de metaloproteinses e fosfolipases A2, que os venenos de B. jararaca e B. insularis. A identificação do peptidoma do veneno de B. alcatraz mostrou diversas formas de peptídeos potenciadores de bradicinina, além de produtos de degradação de diferentes classes de toxinas. A avaliação da glicosilação das proteínas dos três venenos revelou que após a remoção das cadeias de N-glicanos e O-glicanos os perfis eletroforéticos se mostram mais parecidos. A identificação das proteínas do veneno de B. alcatraz que mostraram afinidade pelas lectinas revelou que a ConA interagiu com um número maior de componentes, seguida por WGA e PNA. As análises qualitativa e quantitativa do N-glicoma dos venenos do grupo Jararaca mostrou que os três venenos compartilham as mesmas estruturas de N-glicanos e em abundância relativa similar. Em conjunto, os resultados deste estudo indicaram que no grupo Jararaca, os proteomas dos venenos das espécies B. jararaca e B. insularis apresentam similaridade entre si, e se diferem do veneno de B. alcatraz, principalmente com relação ao grau de glicosilação de suas proteínas. / The Brothrops genus is largely distributed on the Brazilian territory, and B. jararaca is the species of most medical importance in the Southeastern region. Genetic and phylogeographic analyses describe the existence of a monophyletic group, named Jararaca group, which is composed of B. jararaca and of the insular species B. alcatraz and B. insularis. The close evolutionary relationship between these species, which started in the Pleistocene era, and their diet-related differences, are important aspects for the understanding of their venoms and biological activities. The aim of this study was to characterize the venom of B. alcatraz by different analytical methodologies, in order to advance the knowledge on the venoms of Bothrops genus and on the evolution of the venoms of species of the Jararaca group. The analytical approaches used in this study included the charactrization of the proteomes of the venoms of the Jararaca group by electrophoresis and protein identification by trypsin digestion and analysis by liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS/MS), N-terminomic and peptidomic analyses of the venom of B. alcatraz by LC-MS/MS and glycosylation analyses of the venoms of the Jararaca group by treatment with glycosidases, affinity chromatography to lectins (concanavalin A, Con A; wheat germ agglutinin, WGA; peanut agglutininin, PNA) and characterization of the N-glicomes by MSn. The one-dimensional electrophoretic profiles were evaluated under reducing and non-reducing conditions and showed that the venom of B. alcatraz differs from B. jararaca (newborn and adult) and B. insularis (adult) venoms. The two-dimensional electrophoretic profile of B. alcatraz venom corroborated these differences and revealed that the milking of the venom in the presence or in the absence of proteinase inhibitors influences the number of spots visualized on the gel. The results of the analysis of venom proteomes of the Jararaca group showed no significant qualitative differences between them; moreover, the three venoms showed a similar pattern of distribution of toxins classes. However, the label free quantitative analysis of these proteomes revealed some differences, and indicated that the venom of B. alcatraz has a higher content metaloproteinses and phospholipase A2 than B. jararaca and B. insularis venoms. The identification of B. alcatraz venom peptidome showed various forms of bradykinin-potentiating peptides, as well as products of the degradation of different toxins classes. The assessment of the glycosylation level of proteins of the three venoms showed that after removal of N-glycan and O-glycan chains their electrophoretic profiles become more similar. The identification of B. alcatraz venom proteins that showed affinity for lectins indicated that ConA interacted with a larger number of components, followed by WGA and PNA. The qualitative and quantitative analysis of the N-glicome of the venoms of the Jararaca group showed that they share the same N-glycan structures, which were also found in similar relative abundance. Taken together, the results of this study indicate that in the Jararaca group, the venom proteomes of B. jararaca and B. insularis show similarity to each other and differ from the venom of B. alcatraz, especially with respect to the degree of protein glycosylation.

Estudos prévios demonstraram que as atividades biológicas do veneno da serpente Bothrops jararaca sofrem significantes modificações ontogenéticas. Neste estudo é apresentada uma análise comparativa do proteoma, peptidoma e transcriptoma da glândula de veneno de filhotes e adultos de B. jararaca, correlacionando os resultados obtidos com algumas características funcionais dos venenos. Venenos de 694 filhotes de até duas semanas de idade e 110 adultos, provenientes do Estado de São Paulo foram extraídos e liofilizados para as análises proteômicas/peptidômicas e funcionais. O mRNA de glândulas de veneno de 20 filhotes e 10 adultos foi obtido para a contrução de bibliotecas de cDNA e a análise de Expressed Sequence Tag (ESTs). Demonstramos que a atividade hemorrágica é similar para os venenos de filhotes e adultos, enquanto que o veneno de adultos é discretamente mais letal para camundongos; entretanto, o veneno de filhotes mostrou-se extremamente mais letal para aves, uma característica que pode garantir proteção contra potenciais predadores nas fases iniciais de vida da espécie. A atividade coagulante do veneno de filhotes é cerca de 10 vezes mais alta que aquela verificada para o veneno de adultos e é atribuída sobretudo à atividade de metaloproteinases. Essas diferenças nas atividades funcionais se refletiram nos diferentes perfis verificados por eletroforese bidimensional e identificação de spots de proteínas por digestão tripsínica in-gel seguida de análise por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas em tandem, zimografia com gelatina, imunocoloração utilizando anticorpos específicos anti-proteinases, e glicoproteínas com afinidade pela concanavalina -A. A comparação dos venenos por derivatização com tags isóbaros (iTRAQ) e a análise das ESTs revelaram diferenças claras entre os níveis de toxinas presentes nos venenos e as metaloproteinases foram a classe de toxinas mais expressa, além de serem as toxinas cujos perfis estruturais apresentaram maior mudança, como ilustrado pelo quociente PIII/PI, que é maior nos venenos de filhotes. Dimorfismo sexual foi detectado em diversas classes de toxinas no veneno de adultos por análises proteômicas e transcriptômicas e, surpreendentemente, o fator de crescimento de nervo foi detectado apenas no veneno/glândula de veneno de machos. A análise glicoproteômica mostrou que N-glicosilações parecem ser as modificações pós-traducionais mais proeminentes nas toxinas de B. jararaca, e os perfis de N-glicosilação apresentaram-se distintos para as proteínas dos venenos de filhotes e adultos. Entretanto, a composição de N-glicanos não variou entre as amostras, indicando que diferenças na utilização de motivos de N-glicosilação poderiam explicar as diferenças nos níveis de glicosilação observados pelos diferentes perfis eletroforéticos dos venenos. A análise da fração peptídica dos venenos de filhotes e adultos por espectrometria de massas resultou num perfil similar de Peptídeos Potenciadores de Bradicinina (BPPs), que foram detectados em suas formas canônicas e também com novas seqüências, cujas estruturas primárias sugerem um processamento da proteína precursora em sítios até então não descritos. Acreditamos que este seja o estudo mais abrangente sobre a variabilidade do veneno de uma serpente já realizado e os resultados demonstram que há uma relação clara entre as alterações ontogenéticas na dieta e tamanho corporal e o proteoma/peptidoma do veneno desta espécie. / Previous studies have demonstrated that the biological activities displayed by the venom of the snake Bothrops jararaca undergo a significant ontogenetic shift. In this investigation, we performed comparative proteomic, peptidomic and transcriptomic analyses of venoms and venom glands from newborn and adult specimens of B. jararaca and correlated the results with the evaluation of functional venom features. Venoms from 694 two-week old newborns and 110 adults from São Paulo state were milked and lyophilized for functional and proteomic/peptidomic analyses. Additionally, mRNA was obtained from the venom glands of 20 newborns and 10 adults and used for the construction of cDNA libraries and Expressed Sequence Tag (ESTs). We demonstrate that newborn and adult venoms have similar hemorrhagic activities, while the adult venom has a slightly higher lethal activity upon mice; however, the newborn venom is extremely more potent to kill chicks, a feature that might ensure protection against potential predators in early stages of B. jararaca life. Interestingly, the coagulant activity of the newborn venom upon human plasma is ten times higher than that of the adult venom and is contributed mainly by metalloproteinases. Differences in functional activities were clearly reflected in the venom different profiles of two-dimensional gel electrophoresis (2D-PAGE) and protein spot identification by in-gel trypsin digestion followed by liquid chromatography and tandem mass spectrometry (LC-MS/MS), gelatin zimography, immunostaining using specific anti-proteinase antibodies, and concanavalin A-binding proteins. The venom comparison by isobaric tag peptide labeling (iTRAQ) and ESTs analysis revealed clear differences in toxin levels. The metalloproteinases were detected as the toxin class most expressed in the venoms in addition to being the toxins whose structural profile most changed, as illustrated by the ratio P-III/P-I class being higher in newborn venoms. Sexual dimorphism has been detected in various adult venom toxin classes by proteomic and transcriptomic analyses and, interestingly, the nerve growth factor was detected only in the male venom gland/venom. The glycoproteomic analysis showed that N-glycosylation seems to be the most prominent post-translational modification in B. jararaca toxins and the N-glycosylation profiles differed for newborn and adult venom toxins. Nevertheless, the N-glycan composition between the samples did not vary indicating that differences in the utilization of the N-glycosylation motif could be the explanation for the differences in the glycosylation levels indicated by the differential electrophoretic profiles of venom proteins. The analysis of the peptide fraction of newborn and adult venoms by mass spectrometry revealed a similar profile of Bradykinin Potentiating peptides (BPPs), however these were detected in the venoms showing their canonical sequences and also novel sequences corresponding to BPPs processed from their precursor protein at sites so far not described. To the best of our knowledge, this is the most comprehensive study on a snake venom variation and the results clearly demonstrate a relationship between the ontogenetic shift in diet and animal size, and the venom proteome/peptidome in B. jararaca species

Um dos pré-requisitos para a produção economicamente viável de etanol a partir da biomassa lignocelulósica é o desenvolvimento de processos eficientes e baratos de hidrólise enzimática de celulose e hemicelulose. As enzimas respondem por altas percentagens dos custos de hidrólise, pois é necessário utilizar altas cargas enzimáticas para obter rendimentos aceitáveis devido à inibição das enzimas lignocelulolíticas pelos produtos, que se intensifica com o uso de altas concentrações iniciais de biomassa. Uma das estratégias para melhorar a eficiência e diminuir os custos da hidrólise é a identificação de enzimas mais eficientes, com grande atenção para aquelas tolerantes e/ou estimuladas pelos produtos de reação. Nesse contexto, a engenharia de proteínas é uma poderosa ferramenta para o melhoramento e o entendimento da relação estrutura-função destas enzimas. O presente trabalho visou avaliar o efeito da glicosilação sobre as características bioquímicas de uma - glucosidase estimulada por glicose e xilose de Humicola insolens, comparando a enzima nativa e as enzimas recombinantes, expressas em Escherichia coli (Bglhi) e Pichia pastoris (BglhiPp), além de estudar a relação estrutura-função por meio de técnicas de evolução dirigida objetivando o entendimento dos mecanismos envolvidos na estimulação da enzima pelos monossacarídeos. Com relação à glicosilação, a expressão e caracterização da BglhiPp permitiu avaliar que as principais características influenciadas por diferentes conteúdos de carboidratos na enzima foram a temperatura ótima e a termoestabilidade. Já o estudo de evolução dirigida culminou na geração de 4 mutantes com padrão de estimulação por glicose e xilose diferentes da Bglhi (utilizada como controle). Todos os mutantes contêm uma das duas substituições (D237V e N235S) agrupadas ao redor dos subsítios de ligação da aglicona (+1 e +2). Os dados cinéticos e de transglicosilação permitiram sugerir que o mecanismo de estimulação destas enzimas envolve interações alostéricas, modulação das rotas de hidrólise e transglicosilação e competição entre substrato e monossacarídeos pela ligação aos subsítios do sítio ativo. A mutação D237V (presente nos mutantes 4-12D e 5-7H) favoreceu a rota de hidrólise em detrimento à de transglicosilação e a atividade pNP-glucosidásica, mas não a celobiásica, foi estimulada por xilose. A substituição N235S (presente nos mutantes 1-6D e 5-7C) aboliu a preferência por hidrólise ou transglicosilação e a atividade celobiásica, mas não a pNP-glucosidásica, foi fortemente inibida por xilose. Além disso, ambas as mutações diminuíram a tolerância das enzimas pelos monossacarídeos. Estes resultados mostraram que a modulação fina da atividade da Bglhi e das enzimas dos mutantes por glicose e/ou xilose é regulada pelas afinidades relativas dos subsítios da glicona e da aglicona pelos substratos e pelos monossacarídeos livres. As mudanças na topologia e nas propriedades físico-químicas dos subsítios +1 e +2 da aglicona foi proposta por racionalizar os dados cinéticos e de transglicosilação. / One of the prerequisites for the economically viable production of ethanol from the lignocellulosic biomass is the development of efficient and inexpensive processes of enzymatic hydrolysis of cellulose and hemicellulose. The enzymes are responsible for high percentages of hydrolysis costs, since it is necessary to use high enzymatic loads for acceptable yields due to inhibition of lignocellulolitic enzymes by products, which is intensified by the use of high initial concentrations of biomass. One of the strategies to improve efficiency and decrease the costs of hydrolysis is the identification of more efficient enzymes with great attention to those that are tolerant and/or stimulated by the reaction products. In this context, protein engineering is a powerful tool for the improvement and understanding of the structure-function relationship of these enzymes. The present work aimed to evaluate the effect of glycosylation on the biochemical characteristics of glucose and xylose-stimulated -glucosidase from Humicola insolens, comparing the native enzyme and the recombinant enzymes expressed in Escherichia coli (Bglhi) and Pichia pastoris (BglhiPp) and study the structure-function relationship through directed evolution techniques aiming the understanding of the mechanisms involved in the stimulation of the enzyme by the monosaccharides. With regard to glycosylation, the expression and characterization of BglhiPp allowed to evaluate that the main characteristics influenced by different carbohydrate contents in the enzyme were optimum temperature and thermostability. The study of directed evolution culminated in the generation of 4 mutants with pattern of stimulation by glucose and xylose different from Bglhi (used as control). All mutants contain one of the two substitutions (D237V and N235S) grouped around the aglycone binding sites (+1 and +2). The kinetic and transglycosylation data allowed us to suggest that the mechanism of stimulation of these enzymes involves allosteric interactions, modulation of the hydrolysis and transglycosylation routes, and competition between substrate and monosaccharides by binding to the subsites in active site. The mutation D237V (present in mutants 4-12D and 5-7H) favored the hydrolysis route over that of transglycosylation and pNP-glucosidase activity, but not cellobiase activity, was stimulated by xylose. The substitution N235S (present in mutants 1-6D and 5-7C) abolished the preference for hydrolysis or transglycosylation and cellobiase activity, but not pNP-glucosidase activity, was strongly inhibited by xylose. In addition, both mutations decreased the tolerance of the enzymes by the monosaccharides. These results showed that fine modulation of Bglhi and mutant enzymes activities by glucose and/or xylose is regulated by the relative affinities of the glycone and aglycone subsites for the substrates and the free monosaccharides. The changes in the topology and physicochemical properties of the +1/+2 aglycone sites of the mutants have been proposed to rationalize the kinetic and transglycosylation data.

A levedura Kluyveromyces marxianus, apesar de apresentar propriedades fisiológicas vantajosas para a produção heteróloga de proteínas, foi utilizada apenas poucas vezes como hospedeira na síntese dessa classe de moléculas. Em contrapartida, a sua congênere Kluyveromyces lactis possui mais de 40 sistemas de expressão desenvolvidos, inclusive comerciais. Além disso, não há literatura disponível sobre glicosilação de proteínas em K. marxianus. Levando-se isso em consideração, este trabalho visou a desenvolver sistemas para a expressão heteróloga da enzima glicose oxidase (GOX) de Aspergillus niger e de uma esterase termófila (EST) de Thermus thermophilus em K. marxianus. A linhagem K. lactis CBS 2359 foi utilizada como parâmetro de comparação em todos os sistemas de expressão construídos. Primeiramente, foi realizado um estudo fisiológico com a finalidade de selecionar, dentre três linhagens de K. marxianus pré-selecionadas a partir de informação da literatura, a que apresentasse as melhores características fisiológicas para se tornar uma hospedeira de expressão heteróloga. A linhagem selecionada foi a CBS 6556, baseando-se numa combinação das seguintes características: velocidade específica de crescimento, formação de metabólitos, rendimento de substrato em biomassa e secreção da enzima homóloga inulinase. Após, foram construídos dois sistemas de expressão epissomais. No primeiro, o gene era expresso sob controle do promotor PGK de S. cerevisiae e no segundo, sob controle de INU1 de K. marxianus. Um sistema integrativo foi utilizado, no qual a expressão era dirigida pelo promotor INU1. Estudos bioquímicos e de glicosilação foram realizados nas enzimas produzidas. Em relação aos sistemas para expressão de GOX, foram alcançados níveis de produção de 1722 U/gMS (unidades por grama de biomassa seca) em K. marxianus transformado com o sistema epissomal no qual a expressão era controlada pelo promotor INU1. As caracterizações bioquímicas da enzima mostraram que a molécula produzida apresentava propriedades semelhantes à enzima homóloga de A. niger. Além disso, os estudos de glicosilação mostraram uma menor tendência de hiperglicosilação de K. marxianus quando comparada com K. lactis. Já em relação à esterase, K. lactis apresentou maiores níveis de expressão (294 U/gMS), porém a enzima produzida em K. marxianus apresentou temperatura ótima de atividade (50 °C) ligeiramente superior à enzima produzida por sua congênere (45 °C), temperaturas abaixo da qual ocorre maior atividade da enzima homóloga (65 °C). Isso pode ser explicado pela glicosilação exercida por ambas espécies de leveduras sobre a proteína, ao contrário da homóloga, não glicosilada. Além disso, os produtos das leveduras apresentaram três padrões de glicosilação. Dessa forma, o trabalho desenvolvido alcançou seu objetivo de desenvolver esses sistemas de expressão, bem como de avaliar a síntese heteróloga de proteínas nessa levedura de destacado potencial. Os resultados obtidos devem servir à comunidade científica, no sentido de estimular e orientar futuros trabalhos que objetivem a síntese heteróloga de proteínas em microrganismos. / In spite of the advantageous physiological properties of the yeast Kluyveromyces marxianus to produce heterologous proteins, this species has not been widely explored for the synthesis of these biomolecules. On the other hand, more than 40 heterologous expression systems, including commercial ones, were developed for Kluyveromyces lactis. Moreover, there is no available literature concerning heterologous protein glycosylation in K. marxianus. Taking these facts into account, this work aimed at developing systems for the heterologous production of Aspergillus niger glucose oxidase (GOX) and of a thermophilic esterase (EST) from Thermus thermophilus in K. marxianus. The strain K. lactis CBS 2359 was utilized as a reference throughout the whole work. First, a physiological study was carried out in order to select one K. marxianus strain, out of three which had been chosen based on literature information, that exhibited the best physiological traits to be a heterologous expression host. The chosen strain was CBS 6556, based on a combination of the following properties: specific growth rate, metabolites formation, biomass yield on substrate, and secretion of the homologous enzyme inulinase. Subsequently, two episomal systems were constructed. In one of them, the heterologous gene was expressed under control of the S. cerevisiae PGK promoter, whereas in the other system, heterologous gene expression occurred under control of the K. marxianus INU1 promoter. An integrative expression system was also constructed, in which the KmINU1 promoter drove foreign gene expression. Both heterologous enzymes were characterized biochemically and also with respect to their glycosylation. The results attained with GOX led to an expression level of 1722 U/g DW (unit per gram of dry cell weight) in K. marxianus transformed with the episomal INU1-based system. The biochemical studies showed that the enzyme was very similar to the A. niger GOX. Furthermore, analysis of the glycosylation pattern showed a lower tendency of K. marxianus to hypermannosylate proteins, when compared to K. lactis. Higher levels of esterase (294 U/gDW) were obtained in K. lactis than in K. marxianus. However, the enzyme produced in the latter host presented a higher temperature for maximal activity ((50 °C), when compared to the former organism (45 °C). Both values are lower than the temperature for maximal activity of the homologous enzyme (65 °C), which can be explained by the glycans added by both yeast species to the peptide, resulting in a glycosylated protein, in contrast to the homologous esterase. Moreover, the yeast products presented three glycosylation patterns. In conclusion, the work presented in this thesis reached its aims, which were to develop these expression systems and to characterize biochemically the heterologous enzymes expressed, which included an analysis of the glycosylation pattern. The results presented here will certainly be of interest and aid the scientific community working on the expression of heterologous proteins in microorganisms.

Este trabalho procurou avaliar algumas isozimas envolvidas com o processo de degradação de polissacarídeos da parede celular vegetal, encontradas em Aspergillus versicolor, fungo pertencente a um gênero onde a multiplicidade de componentes enzimáticos com a mesma atividade oscila de uma a três. Duas ß-xilosidases foram purificadas por meio de DEAE-celulose e precipitação com sulfato de amônia. Ambas mostraram-se enzimas que, quando deglicosiladas por PNGaseF, apresentam mesmos mapas trípticos. A glicosilação mostrou-se importante para a manifestação de diferenças bioquímicas relacionadas às interações com ambiente eletrolítico adjacente, visto as mudanças das curvas de pH e alterações de comportamento frente a sais de íons metálicos, tão bem como para a manutenção do funcionamento das enzimas. Também foi verificado que as diferentes formas glicosiladas periplásmicas são produzidas em meios distintos (xilana e xilose), cujos pH finais corresponderam aos pH das enzimas encontradas. Por meio de zimogramas, verificou-se que estas não eram produzidas de imediato, mas selecionadas ao longo do tempo de cultivo. Esta seleção foi inicialmente independente do pH, visto este, mesmo tamponado, ser corrigido pelo fungo, de modo a se apresentar, ao final de 48h, correlato com o da enzima selecionada. Exame cromatográfico em Concanavalina-A das enzimas deglicosiladas por EndoH mostraram que a oriunda de xilana tem aporte maior de ramificações biantenárias, que são ricas em galactose. Ambas apresentaram mapas trípticos iguais. A ß-xilosidase induzida por xilana apresentou proporções de manose, galactose e glucose iguais a 69,68 : 30,25 : 0,056 %, respectivamente, enquanto que ß-xilosidase induzida por xilose apresentou proporções iguais a 85,35 : 14,54 : 0,094%, respectivamente, resultado que corrobora com a resultado anterior. Duas ß-glucosidases de superfície micelial foram purificadas por meio de DEAE-Sephacel e DEAE-celulose. Ambas mostraram-se mais semelhantes entre si que as ß-xilosidases, e independentes de fonte de carbono ou pH. No entanto, apresentaram diferenças frente à inibição por celobiose (acentuada a partir de 10mM para ß-glucosidase I e 20mM para B-glucosidase II) e, embora sutis, a pH. Após serem submetidas a 45 ºC por 30min (temperatura que induziu segunda conformação estável) mostraram curvas de pH muito distintas, que foram eliminadas nas enzimas submetidas ao mesmo experimento após deglicosilação por PNGaseF. Ambas apresentaram mapas trípticos iguais. A ß-glucosidase I mostrou-se constituída de Man:Gal:Glu em proporções iguais a 78,36%:21,61%:0,033% do carboidrato total, respectivamente, e a ß-glucosidase II, Man:Gal:Glu iguais a 83,59%:16,38%:0,028%, respectivamente. Ambas também apresentaram sinergismo quando juntas. Sobre celobiose, foi verificado apenas em pH acima de 5.5. Sobre celooligossacarídeos, manifestou-se em pH 5,25. A ß-glucosidase I foi menos ativa que a ß-glucosidase II quando em ausência de glucose e celobiose na solução de reação inicial, situação na qual o contrário foi verdadeiro. O sinergismo foi drasticamente eliminado após deglicosilação por PNGaseF. Não se sabe se este resultado foi oriundo de mudanças cinéticas provocadas pela deglicosilação ou de uma possível eliminação de agregação anteriormente existente entre glicosiladas. O componente ß-glicosidásico extracelular foi purificado por meio de DEAE-Sephacel e Octyl-Sepharose, e se revelou um heteroagregado de fosfatase ácida com ß-glicosidase, que se mostrou estável e ativo em ampla gama de temperaturas e pH, com ótimos de 55ºC e 5,5, respectivamente. Entretanto, os perfis das curvas foram distintos entre as enzimas componentes. Somente concentrações superiores a 0,8mM de cloreto de cobalto apresentaram efeito desagregador, podendo ser empregado em conjunto com DEAE-celulose para purificação das enzimas isoladas. Quando separadas, fosfatase mostrou-se 260% mais ativa e ß-glicosidase, 50% menos ativa. Nesta condição, as faixas de pH se restringiram, acidificando-se, localizando-se entre pH 4,0 e 5,5. Aparentemente, a agregação reforça a atividade celobiásica. Fosfatase foi ativa sobre farelo de trigo e fitato de sódio e adsorveu fortemente em farelo de trigo. ß-glicosidase apresentou atividade sobre farelo de trigo, xilana e Avicel (liberando apenas glicose desta última), revelando-se enzima com atividade celobioidrolásica inespecífica, embora ávida por celobiose. As atividades foram determinadas como oriundas do mesmo sítio catalítico. ß-glicosidase não foi seqüestrada por farelo de trigo quando desagregada, resultado invertido quando reagregada. O seqüestro por farelo de trigo, aparentemente, deveu-se a interações entre sítio catalítico da fosfatase e substrato. / This study explored enzyme multiplicity on hemicelllulose and cellulose degrading systems. It first demonstrates the differences of PNGaseF deglycosylation and EndoH deglycosylation on forms of two ß-glicosidase activities present on surface of mycelia from Aspergillus versicolor grown on several carbon sources. Aspergillus versicolor produces ß-xylosidases with different biochemical properties and different degree of glycosylation, when grown on xylan or xylose. Were investigated the biochemical properties of these ß-xylosidases after deglycosylation. The purified enzymes were deglycosylated with endo-H or PNGase F. After this treatment both enzymes migrated faster in PAGE exhibiting the same Rf. On SDS-PAGE both enzymes showed similar migration. The optima temperature of xylan-induced and xylose-induced ß-xylosidases was 45 ºC and 40 ºC, respectively, and of 35 ºC after deglycosylation. The xylan-induced enzyme was more active at acidic pH than the xylose-induced enzyme. After deglycosylation the optimum pH of both enzymes was 6.0. The thermal resistance of the enzymes at 55 ºC showed a half-life of 15 min and 9 min for xylose-and xylan-induced enzymes, respectively. After deglycosylation both exhibited half-lives of 7.5. Native enzymes exhibited different response to ions, while deglycosylated enzymes exhibited identical sensitivity to ions. Limited proteolysis yielded coincident profiles in SDS-PAGE for both deglycosylated enzymes. All data suggest that the two A.versicolor ß-xylosidases share a common polypeptide core with differential glycosylation, apparently responsible for their biochemical and biophysical differences. Aspergillus versicolor also produced ß-glucosidases with different biochemical properties and different degree of glycosylation independently of carbon source. ß-Glucosidase I differed from ß-glucosidase II principally considering the amount and composition of carbohydrate, sensitivity to ions and pH. The purified enzymes shared the same tripitic maps and molecular masses after deglycosylations. All results showed that the biochemical differences observed for two enzymes were directly linked to PNGaseF- deglycosylation. Considering that Rfs, elution profiles on Con-A and residual glycosylation of both enzymes treated with EndoH or PNGaseF were the same, but differed on the mannose/galactose ratio, we inferred differences on proportion of hybrid-type/high-mannose-type glycans. The significance of this glycoform diversity was stressed in analysis of the action of mixture of both ß-glucosidases on celooligosoccharides and on cellobiose. This synergism was abolished after PNGaseF deglycosylation. These results are the first to show synergism between glycoforms of glycosil-hydrolases, representing a new class of synergistic type. The work also described a new form of aggregation between enzymes. Generally, ß-glycosidases are described as soluble components, attached to cell wall or free in the culture medium. This work verified that it could be extracelular adsorbed to wheat straw when aggregated with an acid phosphatase. The results strongly suggested that phosphatase is the component responsible for the process of adsorption on the substrate. The disaggregation was cobalt mediated, being not observed for another ions. The aggregation state has positive effects on glycosidase activity, extending pH ratio and increasing hydrolysis velocity. The opposite was found to phosphatase activity.

A O-glicosilação com N-acetil-glucosamina (O-GlcNAc) é uma modificação pós-translacional altamente dinâmica que modula diversas vias de sinalização. O processo de O-GlcNAc é controlado por duas enzimas: a enzima OGT é responsável por catalisar a adição de N-acetil-glucosamina no grupo hidroxila dos resíduos de serina e treonina, enquanto a OGA catalisa a remoção de O-GlcNAc das proteínas modificadas. Proteínas com importante papel na função vascular são alvo de O-GlcNAc e o aumento da expressão de proteínas modificadas por O-GlcNAc promove aumento da reatividade vascular para estímulos contráteis. Um dos mecanismos de extrema importância no controle do tônus vascular está ligado à regulação da concentração de cálcio (Ca2+) intracelular, onde destacamos a participação do sistema STIM1/Orai1. As moléculas de interação estromal (STIM) atuam como sensores dos estoques intracelulares de Ca2+ e as proteínas Orai representam as subunidades que formam os canais de Ca2+ ativados pela liberação de Ca2+ (CRAC). Neste estudo investigamos a hipótese de que o aumento dos níveis vasculares de proteínas glicosiladas aumenta a resposta contrátil em aorta de ratos, por mecanismos relacionados ao controle da concentração intracelular de Ca2+.Em nossos experimentos, utilizamos aortas torácicas de ratos incubadas com PugNAc (inibidor seletivo da OGA, ), por 24h. Utilizando protocolo experimental que permite avaliar contrações induzidas pelo influxo de Ca2+ e liberação de Ca2+ intracelular, demonstramos que a incubação com PugNAc aumentou a resposta contrátil à PE bem como a contração durante o período de influxo de Ca2+, induzida pela reintrodução de solução fisiológica contendo Ca2+ (1,56 mM). O bloqueio dos canais CRAC com 2-APB (100 ) e gadolíneo (Gd3+, 100 ) diminuiu significativamente as contrações induzidas pelo influxo de Ca2+ em aortas incubadas com PugNAc. Além disso, estas aortas apresentaram aumento da expressão protéica de STIM1, o que resultaria em maior influxo de Ca2+. A contração induzida por cafeína (20 mM) e serotonina (10 ), a qual reflete a capacidade funcional do retículo sarcoplasmático (RS) em captar Ca2+, foi maior em aortas incubadas com PugNAc. O papel da Ca2+-ATPase (SERCA) foi avaliado com a utilização de tapsigargina, bloqueador da SERCA. O efeito da tapsigargina foi semelhante em artérias incubadas com PugNAc e veículo, apesar do aumento de expressão proteica da SERCA em aortas incubadas com PugNAc. Como a proteína cinase C (PKC) é ativada por aumentos de Ca2+ intracelular, determinamos se a atividade de proteínas alvo da PKC estavam aumentadas. A incubação com PugNAc aumentou a expressão das formas fosforiladas da CPI-17, MYPT-1 e MLC. Em conjunto, estes resultados sugerem que a ativação de STIM1/Orai1, aumento da liberação de Ca2+ intracelular e ativação da via de sinalização da PKC podem representar mecanismos que modulam as alterações vasculares em resposta ao aumento de proteínas glicosiladas por O-GlcNAc. / Glycosylation with O-linked -N-acetyl-glucosamine (O-GlcNAc) is a highly dynamic post-translational modification. The process of O-GlcNAc is controlled by two enzymes: the OGT enzyme catalyses the addition of N-acetyl-glucosamine to the hydroxyl group of serine and threonine residues of a target protein, while OGA catalyzes the cleavage of O-GlcNAc from post-translationally-modified proteins. Proteins with an important role in vascular function are targets of O-GlcNAc and increased levels of proteins modified by O-GlcNAc increase vascular reactivity to contractile stimuli. The regulation of intracellular calcium (Ca2+) concentration, including the activation of STIM1/Orai1, is key in the control of vascular tone. The stromal interaction molecules (STIM) act as sensors of intracellular Ca2+ stores whereas the Orai proteins represent subunits of the Ca2+ release-activated Ca2+ channels (CRAC). We hypothesized that increased levels of vascular O-GlcNAc proteins augment vascular contractile responses by altering mechanisms that regulate the intracellular Ca2+. Rat thoracic aortas were incubated with PugNAc (OGA selective inhibitor, ) for 24h. Using an experimental protocol that evaluates contractions induced by Ca2+ influx and release, we demonstrated that incubation with PugNAc increases contractile responses to phenylephrine (PE) as well as the contraction induced by Ca2+ influx, after depletion of intracellular Ca2+ stores. The CRAC channel blockers, 2-APB (100 ) and gadolinium (Gd3+, 100 ), significantly reduced the contractions induced by Ca2+ influx in aortas incubated with PugNAc. Furthermore, these aortas showed increased STIM1 protein expression, which could result in increased influx of Ca2+ and, in turn, increase vascular contraction. The contraction induced by the release of intracellular Ca2+ stores, stimulated by caffeine (20 mM) and serotonin (10 ), was increased in aortas incubated with PugNAc. The Ca2+-ATPase (SERCA) inhibitor thapsigargin produced similar effects in arteries incubated with PugNAc or vehicle, despite the increased SERCA protein expression in aortas incubated with PugNAc. Since PKC is activated by increases in intracellular Ca2+ and arteries incubated with PugNAc show activation of PKC, we determined whether the activity of proteins that are targets of PKC was increased in PugNAc-treated aortas. Incubation with PugNAc increased the expression of phosphorylated forms of CPI-17, MYPT-1 and MLC. Together, these results suggest that activation of STIM1/Orai1, increased release of intracellular Ca2+ and PKC activation may represent mechanisms that modulate vascular responses upon increased O-GlcNAc proteins.