Glioblastoma (GBM), similar to many other cancers, exhibits enhanced aerobic glycolysis with concomitant lactate production, a phenomenon known as the Warburg effect. We have demonstrated that preferential expression of Hexokinase 2 (HK2) is a critical mediator of metabolic reprograming in GBMs and its inhibition is a potential therapeutic strategy for sensitization of GBM tumors to radiation (RAD) and/or temozolomide (TMZ). Our results indicate that conditional HK2 inhibition disrupts energy homeostasis and sensitizes GBMs to radiochemotherapy under hypoxia. In GBM xenografts, conditional HK2 loss sensitizes GBM tumors to concomitant RAD/TMZ and results in a significant survival benefit in the mice. Moreover, loss of HK2 resulted in GBM remodeling with HK2 knockdowns showing increased necrosis, hypoxia, inflammatory infiltration and reduced vascularization. We anticipate that targeting a key metabolic enzyme involved in the Warburg effect might improve the efficacy of current therapeutic regimen and provide a unique paradigm for the management of GBMs.

Glioblastoma (GBM), similar to many other cancers, exhibits enhanced aerobic glycolysis with concomitant lactate production, a phenomenon known as the Warburg effect. We have demonstrated that preferential expression of Hexokinase 2 (HK2) is a critical mediator of metabolic reprograming in GBMs and its inhibition is a potential therapeutic strategy for sensitization of GBM tumors to radiation (RAD) and/or temozolomide (TMZ). Our results indicate that conditional HK2 inhibition disrupts energy homeostasis and sensitizes GBMs to radiochemotherapy under hypoxia. In GBM xenografts, conditional HK2 loss sensitizes GBM tumors to concomitant RAD/TMZ and results in a significant survival benefit in the mice. Moreover, loss of HK2 resulted in GBM remodeling with HK2 knockdowns showing increased necrosis, hypoxia, inflammatory infiltration and reduced vascularization. We anticipate that targeting a key metabolic enzyme involved in the Warburg effect might improve the efficacy of current therapeutic regimen and provide a unique paradigm for the management of GBMs.

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Thesis (Ph. D.)--University of Hong Kong, 2007. / Also available in print.

Thesis (Ph. D.)--University of Hong Kong, 2007. / Also available online.

Os tumores cerebrais primários mais comuns são os gliomas. Os gliomas representam 31% de todos os tumores cerebrais diagnosticados nos Estados Unidos sendo 81% destes tumores malignos. O glioblastoma (GBM) é o tumor mais comum entre os gliomas, sua taxa de incidência varia de 0,59 a 3,69 a cada 100.000 pessoas, dependendo da idade e do país. A ecto-5’-nucleotidase regula os níveis extracelulares de AMP e adenosina, a qual tem sido amplamente descrita como fator indutor de proliferação celular. Estudos demonstraram que a atividade da enzima ecto-5’-nucleotidase foi aumentada em linhagens de células de glioma, quando comparada aos astrócitos. Também, o tratamento com 1 μM de APCP, um inibidor competitivo da ecto-5'-nucleotidase, causou uma redução significativa de 30% na proliferação das células de glioma. Através de estudos de modelagem molecular foi possível planejar três compostos com perfil farmacológico adaptado para o tratamento do glioblastoma. As moléculas LaSOM 281, LaSOM 282 e LaSOM 287, apresentaram um baixo risco toxicológico, capacidade de atravessar a barreira hematoencefálica e afinidade ao alvo pela predição realizada. Os compostos planejados foram sintetizados com bom rendimento e grau de pureza. No entanto os testes de atividade enzimática realizados para a enzima ecto-5’-nucleotidase das células de glioma, mostraram que os três compostos sintetizados não apresentaram ação inibitória, possivelmente por sua pouca solubilidade em meio aquoso. / The most common primary brain tumors are gliomas. Gliomas represent 31% of all brain tumors diagnosed in the United States and 81% of these tumors are malignant. Glioblastoma (GBM) is the most common tumor among gliomas, with an incidence rate ranging from 0.59 to 3.69 per 100,000 people, depending on the age and country. The ecto-5'-nucleotidase regulates the extracellular levels of AMP and adenosine, which has been widely described as a cell proliferation inducing factor. Studies have shown that the activity of the enzyme ecto-5'-nucleotidase was increased in glioma cell lines when compared to astrocytes. Also, treatment with 1 μM APCP, a competitive inhibitor of ecto-5'-nucleotidase, caused a significant 30% reduction in glioma cell proliferation. Through molecular modeling studies it was possible to plan three compounds with pharmacological profile adapted for the treatment of glioblastoma. The molecules LaSOM 281, LaSOM 282 and LaSOM 287 showed a low toxicological risk, ability to cross the blood brain barrier and affinity to the target by the prediction. The planned compounds were synthesized in good yield and purity. However, the enzymatic activity tests performed for the ecto-5'-nucleotidase enzyme of glioma cells showed that the three compounds did not present an inhibitory action, possibly due to their low solubility in aqueous medium.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2015. / Submitted by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2016-05-31T21:08:28Z No. of bitstreams: 1 2015_ThaisTorquatoSales.pdf: 2906055 bytes, checksum: cffb10f33ad18864796f8568c7f00c30 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-05-31T21:08:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_ThaisTorquatoSales.pdf: 2906055 bytes, checksum: cffb10f33ad18864796f8568c7f00c30 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-31T21:08:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_ThaisTorquatoSales.pdf: 2906055 bytes, checksum: cffb10f33ad18864796f8568c7f00c30 (MD5) / Glioblastoma multiforme (GBM) é o tipo mais comum de tumor cerebral primário em seres humanos adultos, representando aproximadamente 55% dos casos. O processo tumoral desenvolve-se de maneira agressiva e as opções terapêuticas são limitadas. O protocolo de tratamento padrão inclui radioterapia em combinação com temozolomida (TMZ), combinado com excisão cirúrgica quando possível. Apesar de alguns avanços no tratamento de GBM, o tempo de sobrevida dos pacientes diagnosticados com esse tipo de glioma é de aproximadamente 14,5 meses. A interferência de RNA (RNAi) é um mecanismo de silenciamento de genes e está entre as abordagens promissoras para a terapia do câncer. Assim, utilizou-se a metodologia de RNAi para supressão do canal de potássio Ether à go-go 1 (Eag1) em células de glioblastoma da linhagem U-87 MG. Este alvo molecular tem papel relevante na tumorigênese de vários tipos de câncer, auxiliando na proliferação celular e metástases. O estudo realizado na presente dissertação examinou o papel de Eag1 na viabilidade das células de glioma tratadas com TMZ. Inicialmente, realizaram-se ensaios experimentais com concentrações de TMZ (125, 250 ou 500 µM) e pontos temporais (24h, 48h, ou 72h). A viabilidade celular do glioma foi determinada via ensaio de 3-(4,5)-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT). No ponto temporal de 72h e concentração de 250 µM, o fármaco TMZ diminuiu a viabilidade das células em aproximadamente 50%. Com base nesse resultado da curva dose-resposta, estabeleceu-se a concentração do quimioterápico para a execução dos ensaios seguintes. Testaram-se, também, os efeitos do bloqueador de canal de potássio astemizol (ATZ 2,5 µM, 5 µM e 10 µM) ou vetor de expressão de shRNA denominado pKv10.1-3 (0,2 μg) sobre a viabilidade do glioma nos tempos de 24, 48 e 72 horas. Este vetor expressa grampos curtos de RNA (shRNA) direcionados à sequência de RNAm de Eag1 5'-GTCCACTTGGTCCATGTCCAG-3'. Além disto, avaliou-se os efeitos causados por ATZ 5 µM ou por pKv10.1-3 (0,2μg) em combinação com TMZ 250 µM, no tempo de 72 horas. O tratamento com pKv10.1-3 potencializou, de maneira significativa, a redução na viabilidade celular causada por TMZ sobre células de glioma (77,2% versus 47,9%). Verificou-se, ainda, que a inibição de Eag1 por astemizol (5 µM) ou pKv10.1-3 aumenta a taxa de apoptose causada por TMZ, conforme ensaio de citometria de fluxo. pKv10.1-3 (0,2 µg) reduziu significativamente o conteúdo de RNAm de Eag1, para 0,57 vezes em relação ao valor observado no grupo controle negativo pScramble (0,2 µg), conforme resultado de RT-qPCR. Quanto à proteína Eag1, esta mostrou-se elevada nas células de glioblastoma humano da linhagem U-87 MG. Os tratamentos experimentais causaram redução do conteúdo desta proteína, detectada por imunocitoquímica. Portanto, os dados do presente estudo revelam que Eag1 desempenha papel na viabilidade das células de glioma, além disso, mostraram que a supressão desse canal potencializa a ação da TMZ em células U-87 MG de glioblastoma multiforme. / Glioblastoma multiforme (GBM) is the most common primary brain tumor in human adults, accounting for about 55% of cases. Tumorigenesis develops aggressively and the therapeutic alternatives remain limited. The standard treatment includes radiotherapy in association with chemotherapy with temozolomide (TMZ) and the surgical excision of tumor tissues. Despite some advances in GBM treatment, the survival time of patients diagnosed with GBM is nearly 14.5 months. RNA interference (RNAi) is a strategy for gene silencing considered a promising approach for cancer treatment. The present study used RNAi to suppress the Ether à go-go 1 (Eag1) potassium channel in U-87 MG glioblastoma cells. Eag1 is an oncological target which plays an important role in tumorigenesis of various cancers, improving cell growth and metastasis. The aim of this study was to examine the role of Eag1 in glioma cells treated with TMZ. First, we tested the effects of TMZ on glioma cell viability, examining drug concentrations (125, 250 and 500 µM) at three time points (24h, 48h and 72h). Cell viability was determined by the 3-(4,5)-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay. At 72h and concentration of 250 µM, TMZ decreased the cell viability in about 50%. Based on this dose-response curve, the drug concentration for the following tests was set up. We also evaluated the effects of astemizole (ATZ, an Eag1channel blocker) at 2.5 µM, 5 µM and 10 µM or a shRNA expression vector named pKv10.1-3 (0.2 µg). This vector expresses short-hairpin RNA (shRNA) targeting the Eag1 mRNA sequence 5'-GTCCACTTGGTCCATGTCCAG-3'. Cell viability was determined at 24, 48 and 72 hours. In addition, we evaluated the effects caused by ATZ 5 µM or by pKv10.1-3 (0.2 µg) in association with TMZ 250 µM, at 72 hours. The vector pKv10.1-3 increased the effect of TMZ on glioma cells (77.2% vs. 47.9%). Also, the Eag1 inhibition by atemizole (5 µM) or pKv10.1-3 increased the apoptosis rate caused by TMZ, as determined by flow cytometry. pKv10.1-3 (0.2 µg) significantly decrease Eag1 mRNA content to 0.57 times in comparison with the value found in pScramble (0,2 µg) control group, as determined by RT-qPCR. Indeed, GBM cells present a high expression of Eag1 protein. The experimental treatments reduced this protein content, as revealed by immunocytochemistry results. In conclusion, the results of this study reinforce that Eag1 plays a role in glioma cell viability. In addition, they show the channel suppression improves TMZ effects on U-87 MG GBM cells.

Glioblastoma multiforme is the most common and malignant brain tumor, accounting for more than 52% of all primary brain tumors. The molecular heterogeneity of the tumor has made it difficult to treat, and even more difficult to cure. Due to the high mortality rate associated with the current treatments used, new innovative medical techniques are being explored. Prominent treatments that are currently being investigated are immune based therapies, focused on checkpoint inhibitors and biomarkers, the use of 2-deoxy-D-glucose to initiate tumor cell apoptosis, and the induction of alterations in DNA and miRNA to inhibit glioblastoma stem cell accelerated growth and tumorigenesis. Throughout the paper, various ongoing studies are summarized and discussed to compare the outcomes of different treatments. The goal of this paper is to present the different therapies and analyze which one of them is the most effective in treating and prolonging survival for patients with glioblastoma multiforme. This thesis reviewed the large collection of publications about glioblastoma multiforme and treatments for the disease. The use of immune based therapies, such as checkpoint inhibitors and biomarkers, are increasingly delivering promising results as an immunotherapy approach, but it is necessary to complete the phase III trials in order to truly know if these products are successful as anticancer agents or if further research into the matter is required. More research must be done to find the best route of treatment. In addition, the use of 2-deoxy-D-glucose has been successful in treating other types of cancer, such as breast cancer, and now studies look promising in GBM patients. This treatment is still in its initial stages of testing, so more work will need to be done to determine how efficacious this treatment is. By comparing the results of the different therapeutic agents, it was determined that genetic alterations seemed to be the most promising avenue of treatment with current information. The data showed that the greatest increase in survival time and least recurrence was achieved by MGMT promoter methylation and gene modifications of the tumor. Though these treatments have varying results in their efficacy and there are many different combinations of medications that have yet to be assessed, research in the area is greatly advancing and increasing the lives of GBM patients. By allocating resources in the best possible treatment, researchers can change the fatal prognosis of this illness.

O nucleotídeo de purina ATP, no meio extracelular, participa de diversos processos fisiológicos e patológicos como vasodilatação/constrição, proliferação, diferenciação, modulação sináptica, dor, inflamação e morte celular. Entre os receptores purinérgicos, o subtipo P2X7 é bem descrito como mediador de processos inflamatórios pela liberação de IL-1β e de morte celular com ativação de caspases. Evidências na literatura apontam para o envolvimento do sistema purinérgico no crescimento e na progressão de glioblastomas. Esses tumores são os mais comuns do SNC e seu alto grau de malignidade deve-se à capacidade de rápida proliferação e invasão no tecido sadio. Considerando a resistência que os glioblastomas apresentam à morte celular induzida por ATP, o objetivo desse trabalho foi investigar a expressão e funcionalidade do receptor citotóxico P2X7 em linhagens de gliomas e suas implicações na biologia tumoral. Entre as linhagens de glioblastomas estudadas, a linhagem de camundongo GL261 apresentou sensibilidade à morte induzida por ATP pela liberação de LDH, incorporação de iodeto de propídio e diminuição da viabilidade mitocondrial. O ATP foi tóxico em concentrações acima de 2 mM, o BzATP foi mais potente que o ATP e o antagonista oATP bloqueou completamente a morte celular. O silenciamento do receptor P2X7, na GL261, por RNA de interferência, também aboliu a morte celular induzida por ATP confirmando o envolvimento desse receptor, embora a formação de poro ainda tenha sido visível nestas células, ainda que diminuída. A morte celular apresentou características necróticas como a ruptura de membrana, a falta de ativação de caspases e a falta de externalização de fosfatidilserina, mas ao mesmo tempo houve encolhimento celular. Além dos efeitos mediados pela sua ativação, o silenciamento do receptor P2X7 na linhagem GL261 diminuiu a adesão e promoveu a migração celular, características de tumores mais invasivos. Em amostras de pacientes com gliomas, foi possível observar que a expressão de P2X7 correlaciona diretamente com a sobrevida dos pacientes. Juntamente com os dados da linhagem silenciada para o P2X7, é possível apontar o receptor P2X7 como uma possível molécula anti-tumoral, cuja redução na expressão diminui a adesão, aumenta a migração, torna a célula resistente à morte induzida por ATP, possivelmente diminuindo, desta forma, a sobrevida de pacientes acometidos por esta doença. / Purines nucleotides, particularly extracellular ATP, participate in diverse physiological and pathological processes such as vasodilatation/constriction, cell proliferation, differentiation, synaptic modulation, inflammation, pain sensation and cell death. Among purinergic receptors, the P2X7 subtype is well described as a mediator of inflammatory processes via IL-1β release and cellular death induced by caspases activation. Evidences in the literature point to the purinergic system involvement in growth and glioblastoma progression. These tumors are the most common in the central nervous system (CNS) and their high grade of malignance is the result of rapid proliferation and invasion abilities. Considering the resistance that glioblastomas show to ATP-induced cell death, the objective of this work was to investigate the expression and function of cytotoxic P2X7 receptor in glioma cell lines and their implications in tumor biology. Among the glioma cell lines, the mouse GL261 was sensitive to ATP-induced cell death with LDH release, iodide incorporation and a decrease in mitochondrial viability. ATP was toxic in concentrations above 2 mM, BzATP was more potent than ATP and the antagonist oATP blocked completely the cell death induced by ATP. P2X7 receptor silencing in GL261 by RNA interference, also abolished ATP-induced cell death, confirming this receptor involvement, although a diminished pore induction was observed. Cellular death had necrotic features like membrane rupture, lack of caspase activation and lack of phosphatidylserine exposure, but at the same time shrinking also occurs. Beyond its activation effects, P2X7 knockdown in GL261 decreased cell adhesion and promoted migration, features common to more invasive tumors. In human glioma samples, P2X7 receptor expression correlated directly with patients‟ survival. Together with data from P2X7-knocked down cell line, it is possible to suggest the P2X7 receptor as an anti-tumoral molecule, whose expression reduction leads to decreased adhesion, increased cell mobility, resistance to ATP-induced cell death, and therefore, decreased patients survival.

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandar@gmail.com) on 2013-08-14T18:53:05Z No. of bitstreams: 1 Tese_ICS_Bruno Penas Seara Pitanga.pdf: 3443977 bytes, checksum: 4b90d8bbc0ba9b0c3ac164075485f76e (MD5) / Made available in DSpace on 2013-08-14T18:53:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_ICS_Bruno Penas Seara Pitanga.pdf: 3443977 bytes, checksum: 4b90d8bbc0ba9b0c3ac164075485f76e (MD5) / CAPES;CNPq / A capacidade reduzida da resposta imunológica no microambiente do glioblastoma é principalmente devido à interação microglia/glioma e está relacionada à sua agressividade. Nossos estudos anteriores demonstraram que os flavonoides derivados de plantas podem atuar como inibidores de crescimento de linhagens celulares humanas de glioblastoma, em especial o flavonoide rutina inibe o crescimento e apresenta capacidade morfogênica, ainda estimula a libertação de agentes imunomoduladores como TNF e NO por astrócitos e microglia em culturas primárias de ratos. O objetivo desse estudo foi verificar a viabilidade de linhagens celulares de glioblastoma humano tratadas com flavonoides, bem como caracterizar essas células quanto à expressão de proteínas do citoesqueleto e morfologia, ainda, investigar se os flavonoides rutina e quercetina, nas concentrações de 50μM e 100μM, podem modular a resposta imunológica em co-cultura microglia/glioma. Como demonstrado através do teste MTT, após 72h de exposição com os flavonoides, ocorreu inibição dose-dependente da viabilidade das células TG1, U251 e GL15. A caracterização dessas linhagens revelou marcação conjunta de GFAP, beta III tubulina e Nestina em diferentes intensidades e localização. Além disso, verificamos diminuição da capacidade de formação de esferóides em culturas de células TG1 tratadas com rutina. Em culturas de célula C6 a viabilidade não foi afetada após a exposição direta aos flavonoides rutina e quercetina nas concentrações de 50 - 100μM por 48h. O teste azul de tripan revelou uma redução dessa viabilidade em ambos os flavonoides testados diretamente. Já durante exposição indireta de meios provenientes de culturas de microglia tratadas com rutina, observamos redução na viabilidade em C6. Além disso, observamos um aumento na expressão de OX-42 em culturas de microglia após a exposição com flavonoides rutina e quercetina, indicando sua ativação. Foi realizado em co-culturas microglia/glioma a marcação para isolectina B4, verificamos que o flavonoide rutina induziu aumento na proliferação de microglia após contagem das células isolectina positivas. Ainda, o teste ELISA realizada em culturas microgliais mostrou que os níveis de TNF foram aumentados em culturas tratadas com rutina 100μM ou quercetina 50- 100μM. A dosagem de nitrido mostrou aumento significativo somente após tratamento com quercetina 100μM. Através da citometria verificamos redução de pSTAT3 e NFkB em culturas de C6 e a análise ultraestrutural revelou figura de mielina, vacúolo fagocítico durante interação microglia/glioma. Verificamos ainda que houve aumento na intensidade da marcação de células apoptóticas quando tratadas com quercetina 100μM em gliomas, já com rutina ocorreu sutil marcação de anexina também em gliomas. Para quantificação dos vacúolos autofágicos em gliomas, utilizamos o corante fluorescente laranja de acridina. Em rutina 100 μM observamos aumento na intensidade de fluorescência, já o tratamento com quercetina verificamos aumento discreto na formação dos vacúolos autofágicos. Diversos estudos demonstram que o perfil de resposta Th1 está associado com um melhor prognóstico em pacientes com câncer. Esses achados sugerem que quercetina e rutina podem induzir mudanças no perfil regulatório da resposta microglial durante a interação com glioma, no entanto o flavonoide rutina mostrou um potencial melhor como imunomodulador. O entendimento da interação microglia/glioma será útil na elaboração de novas terapias baseadas na resposta imune contra o glioblastoma. / Salvador