Submitted by ROBERTO PAULO CORREIA DE ARAÚJO (ppgorgsistem@ufba.br) on 2017-05-19T23:38:44Z No. of bitstreams: 1 LIVIA BACELAR DE JESUS - DISSERTAÇÃO.pdf: 712515 bytes, checksum: eef4f358971620ad62099770c3580a9f (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-19T23:38:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 LIVIA BACELAR DE JESUS - DISSERTAÇÃO.pdf: 712515 bytes, checksum: eef4f358971620ad62099770c3580a9f (MD5) / Os glioblastomas são tumores cerebrais com alto potencial de crescimento, sendo responsáveis por um prognóstico de sobrevida de 9 a 11 meses. De forma geral, o crescimento tumoral encontra-se relacionado à degradação de componentes da matriz extracelular (MEC). Especificamente para os gliomas, o potencial invasivo tem sido relacionado ao aumento da expressão da metaloprotease do tipo 9 (MMP-9). Recentemente, tem sido mostrado que a proteólise de componentes da matriz extracelular promove a liberação de fragmentos protéicos com atividade biológica distinta da apresentada pela molécula intacta. Existem poucas informações sobre o efeito da proteólise de laminina-111 (LMN-111), proteína de matriz extracelular, no contexto do sistema nervoso central. Dessa forma, este trabalho teve por objetivo investigar se o meio condicionado por células de gliomas C6 (MCC6) apresenta atividade proteolítica sobre polímeros de LMN-l11. Utilizando zimografia acoplada à eletroforese, detectamos a presença de uma gelatinase de 110 kDa em MCC6. A atividade proteolítica do MCC6 sobre polímeros de LMN foi observada através de imunomarcação para LMN-111 e de análise por eletroforese. A incubação dos polímeros de LMN-111 com MCC6 resultou em três fragmentos de 70, 45 e 30 kDa. Dessa forma, os resultados mostram a presença de fragmentos proteolíticos de LMN-111, gerados pelo tratamento dos polímeros com MCC6 e sugerem a necessidade de estudos posteriores para a caracterização da atividade biológica associada aos mesmos.

Glioblastomas Multiformes (GBM) são tumores do Sistema Nervoso Central com altas taxas de invasibilidade e grande resistência a quimio e radioterapias, cuja origem foi inicialmente atribuída a células tronco neurais (NSCs). Mais recentemente, trabalhos de rastreamento de linhagem celular (lineage tracing) revelaram que a célula de origem em GBM, ao menos para certos subtipos, é na verdade a célula precursora de oligodendrócitos (OPC). A identificação da origem do tumor pode auxiliar na compreensão da doença e no desenvolvimento de terapias mais eficazes. OPCs são células com grande capacidade migratória e constituem a população de células cerebrais mais proliferativamente ativa, características compatíveis com a biologia de glioblastomas. Neste trabalho criamos uma meta-assinatura de OPCs que, quando aplicada a amostras populacionais e de céulas únicas de GBMs humanos, indica a presença de características de OPCs em virtualmente todos os tumores, principalmente dentre os do subtipo Proneural. Apesar disso, o cultivo de GBMs in vitro tem sido tradicionalmente realizado em meio próprio de NSCs, como forma de preservar as características originais do tumor. Entretanto, no caso de OPC ser a verdadeira célula de origem, o ideal seria a utilização de meio próprio para esta célula. Utilizamos meio padrão para NSCs e meio para OPCs em linhagens de camundongo bem como em biópsias humanas. Meio de NSCs provoca alterações morfológicas e em marcadores, enquanto meio de OPCs mantém as células mais similares ao tumor que lhes deu origem. Principalmente, meio de NSCs reduz o potencial tumorigênico das células in vivo, e faz com que alvos errôneos sejam identificados na resposta a drogas, devido à expressão de marcadores nãoautênticos pra célula de origem. A análise de gliomas humanos indica que a população proliferativamente ativa expressa marcadores de OPCs, independentemente do subtipo em que o tumor foi classificado. Assim, concluímos que o papel de OPCs no desenvolvimento de GBMs é mais importante do que se imaginava, e que a utilização de meio de cultivo baseado na célula de origem é fundamental para a correta identificação de alvos terapêuticos. / Glioblastoma Multiformes (GBM) are Central Nervous System tumors that present high invasibility rates and great resistance to chemo- and radiotherapies, whose origin was initially accredited to Neural Stem Cells (NSCs). More recently, papers employing lineage tracing revealed that the cell of origin in GBM, at least for certain subtypes, is in fact an Oligodendrocyte Precursor Cell (OPC). The elucidation about the origin of a tumor can help in the disease comprehension and in the development of more efficient therapies. OPCs are naturally migratory cells and constitute the most actively proliferating cell population in the brain, characteristics that are compatible with glioblastoma biology. In this work we created an OPC meta-signature that, once applied to populational and single-cell data in GBM, reveals the presence of OPC features in virtually every tumor, mainly from the Proneural subtype. Moreover, GBM in vitro culture has traditionally been done in NSC media, as an attempt to preserve original characteristics from the tumor. However, if OPC is the real cell of origin, it would be better to grow GBM samples in OPC media. Here, we used NSC media and OPC media in mice lines as well as in human byopsies. NSC media induces morphological and marker changes, while OPC media maintains the cells more similar to the tumor from where they were originated. Mainly, NSC media reduces the tumorigenic potential of the cells in vivo, and causes false targets to be identified in response to drugs due to the expression of non-authentic markers to the cell of origin. Human glioma analysis indicates that the actively proliferating population expresses OPC markers, regardless of the subtype in which the tumor was classified. Therefore, we conclude that the role of OPCs in GBM development is more importante than originally thought, and that the employment of culture media based on cell of origin is of fundamental importance for the correct identification of therapeutical targets.

Gliomas malignos compreendem o subtipo mais comum e devastador de tumores primários do sistema nervoso central (SNC), sendo o Glioblastoma Multiforme (GBM) a forma mais agressiva e mortífera. Pacientes com este tipo de tumor apresentam um prognóstico de sobrevida que não ultrapassa os 18 meses, após o diagnóstico. Isso é decorrente do fato de que os GBMs possuem elevada resistência aos tratamentos de quimio e radioterapia, além de serem altamente infiltrativos e neurologicamente destrutivos. Um importante fator que contribui para essa resistência é a superexpressão da proteína XIAP (X-linked Inhibitor of Apoptosis), o mais potente inibidor de apoptose da família das IAPs. Este atua inibindo diretamente a ativação das Caspases 3, 7 e 9. P53 é considerada uma das mais potentes proteínas supressoras tumorais, uma vez que esta atua como reguladora central em diversas vias de sinalização de mecanismos celulares distintos, como a via de controle do ciclo celular, reparo ao DNA, apoptose, senescência, autofagia, entre outras. Isto justifica o fato de p53 estar frequentemente mutada, nos mais variados tipos de cânceres. Portanto, o objetivo do presente trabalho foi estudar os efeitos resultantes da interação entre a superexpressão da proteína supressora tumoral p53 e o silenciamento da proteína anti-apoptótica XIAP na proliferação, na sobrevivência de GBMs. Quando p53 foi superexpressa (P+) na linhagem de glioma U87 silenciada para XIAP (Xi), através de RNAi, a taxa de proliferação celular reduziu significativamente em relação às células com as intervenções isoladas (U87Xi e U87wtP+) ou em relação ao controle selvagem U87wt, ao longo de dez dias. O ensaio de citotoxicidade LDH revelou um aumento na desestabilização da membrana citoplasmática nas células com a manipulação gênica combinada (U87XiP+) em relação os controles U87Xi e U87wtP+. O ensaio com AnexinaV/PI demonstrou uma elevação na marcação de células U87XiP+ com os dois marcadores, indicando uma maior indução de morte celular em relação aos controles. Além disso, como consequência da modulação combinada de p53 e XIAP, os níveis das proteínas pró-apoptóticas Bax e PUMA aumentaram tanto na linhagem U87wt, quanto na linhagem U87Xi, ao superexpressar p53. Além disso, os níveis de p21 e da proteína anti-apoptótica Bcl-xL foram reduzidos na linhagem U87Xi em relação ao controle U87wt. Outra constatação importante foi o aumento dos níveis de caspase-3 na linhagem U87Xi em relação ao controle U87wt e um aumento ainda maior nas células com a intervenção combinada (U87XiP+). Todos estes dados convergem para o fato de que a combinação do silenciamento de XIAP e superexpressão de p53 é mais efetiva na redução da proliferação e indução de morte na linhagem de glioma U87, do que as manipulações gênicas realizadas de forma isoladas, além de sugerir uma possível via de integração entre XIAP e p53, tendo como ponto de conexão o controle dos níveis citoplasmáticos da proteína p21 tanto por p53, quanto por XIAP, mostrando que a modulação combinada de proteínas da via apoptótica é capaz de potencializar os efeitos produzidos pelas intervenções de forma isoladas, representando uma nova e promissora estratégia no desenvolvimento de novas terapias para o tratamento de Gliomas.

Glioblastomas são os tumores mais agressivos do Sistema Nervoso Central (SNC). Caracterizam-se por sua alta invasibilidade, proliferação, altos índices de recorrência e morte, assim como quimio e radiorresistência. Tumores sólidos apresentam uma organização hierárquica, em que há uma pequena população de células tronco tumorais (CSCs) ou células iniciadoras de tumor (CICs). Essas células são capazes de repopular o tumor, que leva à recorrência. CSCs caracterizam-se por realizar também a mitose assimétrica, na qual parte das células continuam como CSCs e a outra parte sofre diferenciação. Essas células diferenciadas são incapazes de repopular o tumor, uma vez que perderam a sua capacidade tronco. CSCs mostraram ser relativamente resistentes as terapias anticâncer tradicionais como quimio e/ou radioterapia. Doxorrubicina (Doxo) é um agente anticâncer usado em diversos tipos de tumor e atua formando adutos no DNA e também inibindo a ação da topoisomerase II. Dependendo da concentração utilizada de Doxo, diferentes efeitos são observados; por exemplo, baixas doses (100 nM) levam à senescência celular, enquanto que altas doses (10 μM) levam à apoptose. Temozolomida (Tmz) é um anti-tumoral utilizado na terapia de diversos tumores, inclusive gliomas. Resveratrol (Rsv) é um polifenol encontrado em diversas plantas, como a uva, e possui efeitos como: neuroproteção, antiinflamatório, anti-oxidante, proteção cardíaca, entre outros. Nosso objetivo foi avaliar a influência do efeito dessas três drogas nas CSCs derivadas de glioblastoma humano. Realizou-se o ensaio de formação de esferas, um indicador da presença de CSCs, citometria de fluxo para Oct4 e Nanog e ensaio de senescência. Nossos ensaios utilizaram a linhagem U87 e dois tipos diferentes de meio de cultura. O primeiro continha DMEM Low Glucose com SFB e o segundo, um meio de cultura para células tronco (SCM), contendo DMEM F12 suplementado com FGF (fator de crescimento fibroblástico), EGF (fator de crescimento epidermal), LIF (fator inibidor de leucemia) e B27. Os tratamentos realizados utilizaram Doxo 1 e 10 nM; Tmz 5 μM e Rsv 1, 10 e 30 μM. O número de esferas formadas foi reduzido tanto em Doxo 1 quanto em 10 nM quando SFB foi utilizado. Doxo 1 não alterou o número de células Oct4 e Nanog positivas enquanto que Doxo 10 nM reduziu. Ambas as doses induziram senescência. Tmz reduziu o número de esferas formadas e também a porcentagem de células Oct4 e Nanog positivas. Usando SCM, observamos que Doxo e Tmz reduziram o número de esferas e a porcentagem de células Nanog e Oct4 positivas. Rsv 10 μM reduziu o número de esferas formadas enquanto que Rsv 30 μM reduziu o número de células positivas para CD133 e Oct4 com meio com SFB. Nossos resultados sugerem que Doxo 10 nM possui um melhor efeito nas CSCs do que Doxo 1 nM. Doxo 10 nM, além de reduzir o número de esferas, reduziu a porcentagem dos marcadores de CSCs e também induziu senescência celular na presença de SFB. Tmz e Rsv apresentaram resultados semelhantes à Doxo 10 nM. / Glioblastomas are the most aggressive tumors of the central nervous system (CNS). They are characterized by their high invasiveness, proliferation, high rates of recurrence and death, as well as chemo and radioresistance. Solid tumors have a hierarchical organization, in which there is a small tumor stem cell population (CSCs) or tumor initiator cells (CICs). These cells are able to repopulate the tumor, which leads to recurrence. CSCs are characterized by also performing asymmetric mitosis, in which the cells remain as CSCs and the other part undergoes differentiation. These differentiated cells are unable to repopulate the tumor, since they have lost their stem cell capacity. CSCs showed to be relatively resistant to traditional anti-cancer therapies such as chemo and / or radiotherapy. Doxorubicin (Doxo) is an anticancer agent used in several tumor types and acts by forming DNA adducts as well as inhibiting the action of topoisomerase II. Depending on the concentration of Doxo used, different effects was observed, for example, low doses (100 nM) lead to cellular senescence, whereas high doses (10 μM) lead to apoptosis. Temozolomide (Tmz) is an anti-tumor therapy used in many tumors, including gliomas. Resveratrol (Rsv) is a polyphenol found in various plants, such as grapes, and has effects such as neuroprotective, antiinflammatory, anti-oxidant, cardiac protection, among others. Our objective was to evaluate the effects of these three drugs on CSCs derived from human glioblastoma. We performed the sphere formation assay, an indicator of the presence of CSCs, flow cytometry for Oct4 and Nanog and senescence assay. Our experiments used the cell line U87 and two different types of culture medium. The first contained DMEM Low Glucose with FBS and the second, a culture medium for stem cells (SCM), containing DMEM F12 supplemented with FGF (fibroblastic growth factor), EGF (epidermal growth factor), LIF (leukemia inhibitor factor) and B27. The tests were performed using Doxo 1 and 10 nM, Tmz 5 μM and Rsv 10 and 30 μM. The number of spheres formed was reduced in both doses of Doxo when FBS was used. Doxo 1 nM did not alter the number of Oct4 and Nanog positive cells while Doxo 10 nM reduced. Both doses induced senescence. Tmz reduced the number of spheres formed and also the percentage of Nanog and Oct4 positive cells. Using SCM, we saw that Doxo and Tmz reduced the number of spheres and the percentage of Nanog and Oct4 positive cells. Rsv 10 μM reduced the number of spheres formed while Rsv 30 μM reduced the number of CD133 and Oct4 positive cells with medium supplemented with FBS. Our results suggest that Doxo 10 nM has a better effect in the CSCs than Doxo 1 nM. Doxo 10 nM besides reducing the number of spheres also decreased the percentage of CSCs markers, and induced cellular senescence in the presence of FBS. Tmz and Rsv had similar effects as Doxo 10 nM.

Os gliomas representam a maioria dos tumores do sistema nervoso central, sendo o glioblastoma o mais maligno entre eles. O tratamento destes tumores ainda é ineficiente e a sobrevida média dos pacientes é de aproximadamente um ano após o diagnóstico. A remoção cirúrgica, quando possível, acompanhada de radioterapia e quimioterapia é o tratamento padrão. A tendência é que a quimioterapia assuma um papel mais importante, uma vez que possibilita a ativação de mecanismos endógenos antitumorais, como senescência celular. Este mecanismo possui potencial de induzir a perda irreversível da capacidade da divisão de células tumorais. O resveratrol e a quercetina, dois polifenóis naturais, induzem senescência em diferentes linhagens tumorais, incluindo os glioblastomas. Ambos têm efeitos pleiotrópicos e induzem a ativação de vários alvos moleculares, sendo SIRT1, um desses alvos. SIRT1 é uma histona desacetilase (HDAC) associada ao desenvolvimento de vários tipos de tumores. Por este motivo, foi avaliada a indução de senescência em células de glioblastomas pelo resveratrol e quercetina combinados com butirato de sódio, um inibidor de HDAC classe I e II. Os resultados mostram um efeito combinado do butirato de sódio e estes polifenóis para induzir a senescência nas linhagens celulares U87 e C6, mas não em astrócitos normais de ratos. Os co-tratamentos induzem perda de capacidade proliferativa e aumento do número de células positivas para β-galactosidase, um marcador de senescência. Estes resultados foram acompanhados de parada no ciclo celular na fase G2 na linhagem U87, mas nenhum efeito foi observado sobre o ciclo de células C6. A análise por Western Blot sugere o aumento do supressor tumoral p21 após co-tratamentos. Além disso, o co-tratamento com quercetina e butirato de sódio aumenta a produção de espécies reativas de oxigênio, mas não os níveis de gama-H2AX (um marcador de dano). Estes dados sugerem que o butirato de sódio em combinação com os polifenóis tem potencial terapêutico para a supressão de glioblastomas. Por outro lado, um dos problemas em biologia e medicina é entender como células pré-cancerosas e cancerosas entram em senescência ou conseguem evitá-la. A chave para a compreensão da indução da senescência e do seu bypass é a ativação da enzima telomerase (TERT), presente em 85 % dos tumores. Na segunda parte desta tese, ferramentas de biologia de sistemas foram utilizadas para projetar uma rede câncer e senescência humana com o objetivo de estudar a relação entre senescência e câncer (incluindo glioblastoma). Os resultados mostram uma interação direta entre TERT e oncogenes como MYC, E2F1, AKT1 e ABL1, que podem induzir a senescência. Além disso, uma associação metabólica forte entre estes oncogenes e sua capacidade de induzir senescência foi mostrada através de análise por ontologia gênica. Estes oncogenes também atuam como reguladores da transcrição e/ou pós-transcrição da subunidade catalítica de TERT. Resultados obtidos a partir da análise de centralidade da rede juntamente com dados de microarranjos derivados de tumores foram utilizados para conceber um modelo dinâmico da regulação de TERT em câncer. Com base nestes resultados, foi gerado um modelo hipotético no qual a expressão de TERT pode ser transitória ou induzida por espécies reativas de oxigênio, aumentando a sobrevivência de diferentes tipos de tumores, como o glioblastoma. Este estudo fornece novas evidências para a relação entre senescência e câncer. Além disso, esta hipótese, se verificada experimentalmente, pode permitir a formulação de novas abordagens quimioterapêuticas para o tratamento de gliobastomas. / Gliomas are the majority of central nervous system tumours, being glioblastoma the most malign among them. The treatment for these tumors is still inefficient and survival average of patients is approximately one year after diagnosis. Surgical removal, if possible, followed by radiotherapy and chemotherapy is the standard treatment. The trend is that chemotherapy assumes a greater role, since it allows the activation of antitumour mechanisms, such as cellular senescence. This mechanism has potential to induce irreversible loss of division ability in tumor cells. Resveratrol and quercetin, two natural polyphenols, are able to induce senescence in different cancer models, including glioblastoma. Resveratrol and quercetine are molecules with pleiotropic effects and leads to SIRT1 activation. SIRT1 is a histone deacetylase (HDAC) which has been linked positively to cancer development. Therefore, we analyzed the ability of sodium butyrate, a HDAC class I and II inhibitor combined with resveratrol or quercetin to induce senescence in glioblastoma cell lines. Results show a combined effect of sodium butyrate and these polyphenols to induce senescence in U87 and C6 cell lines, but not in normal rat astrocytes. Co-treatments induce a loss of proliferative capacity and increase the number of positive cells for β-galactosidase, a senescence marker. These results were accompanied with cell cycle arrest in G2 checkpoint in U87, but no effect on cell cycle phase‟s distribution in C6 was observed. Western blott analysis suggests that these arrests are result of tumour suppressor p21 increase. Moreover, co-treatments increased reactive oxygen species, but not gamma-H2AX levels (a damage marker). The data underline that tumor cells can be driven towards cellular senescence by sodium butyrate combined with polyphenols, which may further arise as a possibility for tumor suppression. On the other hand, one of the challenging problems in biology and medicine is to understand how pre-cancerous or cancer cells enter in senescence or can avoid it. The key to understanding senescence induction and its bypass is the telomerase (TERT), which is present in 85 % of tumors. In a second part of this thesis, system biology tools were used to design a human cancer-senescence network with the aim to study the relationship between senescence and cancer (included glioblastoma). The results show a direct interaction between TERT and oncogenes such as MYC, E2F1, AKT1 and ABL1, which can induce senescence. Moreover, a strong metabolic association between these oncogenes and their ability to induce senescence was shown by gene ontology analysis. These oncogenes also act as transcriptional and/or post-transcriptional regulators of TERT catalytic subunit. Results obtained from centrality analysis and microarray data derived from tumors were used to design a dynamic model for TERT regulation in cancer. Based on these results, a hypothetical model was generated in which TERT expression may be transient or induced by reactive oxygen species, increasing the survival of different tumor types, such as glioblastoma. This study provides new evidence for the relationship between senescence and cancer. Furthermore, this hypothesis, if experimental verified, can enable the development of new chemotherapy approaches to glioblastoma treatment. and ABL1, which can induce senescence. Moreover, a strong metabolic association between these oncogenes and their ability to induce senescence was shown by gene ontology analysis. These oncogenes also act as transcriptional and/or post-transcriptional regulators of TERT catalytic subunit. Based on these results, a hypothetical model was generated in which TERT expression may be transient or induced by reactive oxygen species, increasing the survival of different tumor types, such as glioblastoma. This study provides new evidence for the relationship between senescence and cancer. Furthermore, this hypothesis, if experimental verified, can enable the development of new chemotherapy approaches.

Gliomas são tumores do sistema nervoso central caracterizados por alta invasibilidade e mortalidade. Inúmeros esforços foram feitos nas últimas décadas para melhorar a sobrevida dos pacientes, porém o último marco no tratamento se deu pela implementação da temozolomida (TMZ) combinada a ressecção cirúrgica e a radioterapia (RTX) em 2005. O projeto do atlas do genoma humano do câncer (TCGA) sequenciou tumores de mais de 500 pacientes com diagnóstico de glioblastoma (GBM) e categorizou os tumores em quatro subtipos moleculares, baseados na expressão, mutações e deleções de genes. Essas alterações genéticas já foram correlacionadas à melhora na sobrevida e à sensibilidade a terapia, porém, até o momento estudos prospectivos falham em direcionar o tratamento dos pacientes baseados nas características moleculares. Em busca de melhorar o entendimento sobre a correlação entre a sensibilidade a terapia in vitro e características genotípicas e fenotípicas, nós realizamos culturas primárias de células derivadas de tumores do sistema nervoso central de 23 pacientes (24 biopsias diferentes). As células foram crescidas em DMEM/F12 suplementado com soro fetal bovino e expostas aos tratamentos em doses e tempos semelhantes aos encontrados na clínica. Foram realizadas análises de viabilidade celular sete dias após o início do tratamento para 11 culturas primárias, ou as culturas foram tratadas por cinco dias em combinação, ou não, com RTX (sem RTX: 16 culturas; com RTX: 9 culturas) seguidos de sete dias em meio livre de droga, ao fim dos quais as células remanescentes foram contadas. A radioterapia e fármacos que agem sobre o citoesqueleto (vincristina, vimblastina, paclitaxel e mebendazole) sozinhos foram os tratamentos mais eficientes em reduzir a população celular. Uma segunda rodada de tratamento com TMZ, paclitaxel e a combinação de procarbazina, CCNU e vincristina (PCV) sugere que a resistência não é estável, e sucessivas exposições ao mesmo, ou a um fármaco diferente, podem ter seus efeitos somados na diminuição do crescimento populacional ou na massa tumoral final. Ao administrar PCV e paclitaxel nas células em cultura observamos um aumento nos níveis de autofagia que correlaciona com o declínio da população. Combinações desses fármacos com concentrações plasmáticas de um bloqueador da autofagia (cloroquina) não são capazes alterar o crescimento populacional. Resultados de análises do banco disponibilizado pelo TCGA mostram que alguns pacientes não apresentam aumento na sobrevida após tratamento com TMZ, e que essa falha no tratamento correlaciona com a baixa expressão de alguns genes nos seus tumores, por exemplo, aqueles com baixa expressão de FGFR3 e AKT2. As culturas primárias e linhagens celulares com menor expressão desses genes foram sensíveis in vitro a combinação de TMZ com dois fármacos que agem sobre o citoesqueleto: vimblastina e mebendazole (TVM). Essa associação retarda o crescimento de linhagens e culturas primárias resistentes a TMZ, além de induzir parada no ciclo celular, senescência e aumento da expressão de Notch3. Devido a falha na terapia padrão, ao baixo custo e aos resultados promissores essa associação de TVM poderia ser testada em pacientes cujos tumores apresentam baixos níveis de AKT2 e FGFR3. / Gliomas are tumors of the central nervous system with high invasiveness and mortality. Efforts have been done in last decades to improve patients overall survival, but the last treatment gain was given by the introduction of temozolomide (TMZ) combined with surgical resection and radiotherapy (RTX), in 2005. The cancer genome atlas (TCGA) consortion sequenced tumors from 500 patients with glioblastoma diagnosis and clustered tumors into four molecular subtypes, based on gene expression, mutations and deletions. Theses genetic alterations are associated with improved overal survival and sensitivity to therapy, but up to date, prospective studies have failed to address patients’ treatment based on molecular characteristics. In order to better understand the correlation among sensitivity in vitro and genotypic and phenotypic characteristics, we performed patient-derived cell cultures of central nervous system tumors from 23 patients (24 biopsies). Cells were grown in DMEM/F12 supplemented with fetal bovine serum and treated at doses and times similars to those administered in patients. Cell viability analyses were performed seven days after start of treatment for 11 cultures or cultures were treated for five days plus RTX (without RTX: in 16 cultures; with RTX: in 9 cultures) followed by seven day in drug-free medium, at the end, the remaining amount of cells were counted. RTX and drugs acting on cytoskeleton (vincristine, vinblastine, paclitaxel and mebendazole) alone were the most efficient treatments to reduce the population. A second round of treatment with TMZ, paclitaxel and the combination of procarbazine, CCNU and vincristine (PCV) suggests that the resistance is not stable, and repeated exposures to the same, or to another drug, could have additional effects in population or tumor mass reduction. PCV and paclitaxel treated cells showed an increase in autophagy levels correlated with reduction in population. Combining these drugs with plasmatic concentrations of an autophagy inhibitor (chloroquine) did not change population growth. Results from TCGA databank showed that some patients did not benefit in overal survival after TMZ treatment and this correlates with expression of some genes, for example, those harboring tumors with FGFR3 and AKT2 low expression. Patient-derived cultures and cell lines with low expression of these genes were sensitive in vitro to the combination of TMZ with two drugs that act on cytoskeleton: vinblastine and mebendazole (TVM). This association slowed the growth of patient-derived and cell lines tolerant to TMZ, besides inducing cell cycle arrest, senescence and increased Notch3 expression. In the case of failure of standard therapy, low cost and promising results, TVM association could be tested in patients harboring FGFR3Low/AKT2Low tumors.

Os nucleotídeos extracelulares modulam uma variedade de ações biológicas via ativação de receptores purinérgicos. Esses efeitos são controlados pela ação de ectonucleotidases, tais como as E-NTPDases e a ecto-5´-NT/CD73, as quais hidrolisam o ATP até adenosina no meio extracelular. Alterações no sistema purinérgico podem estar envolvidas na progressão dos gliomas. O ATP induz a proliferação celular dos gliomas e, ao contrário dos astrócitos, gliomas apresentam baixa expressão das E-NTPDases, particularmente da NTPDase2. Assim, a restauração da atividade ATPásica nesses tumores poderia ser uma estratégia para prevenir as ações mediadas pelo ATP. De acordo com essa idéia, a coinjeção de apirase/NTPDase1, uma enzima depletora de ATP, e gliomas diminuiu a progressão tumoral in vivo. O objetivo desse estudo foi aprofundar a participação dos receptores purinérgicos e das E-NTPDases na progressão dos gliomas. A análise das culturas de linhagem de glioma C6 e de C6 ex vivo revelou similaridade na expressão de receptores purinérgicos e das E-NTPDases, sugerindo que alterações nessa via estariam presentes em culturas primárias de gliomas. Ao contrário do esperado, o restabelecimento da expressão da NTPDase2 nos gliomas resultou em aumento da malignidade tumoral. A superexpressão da NTPDase2 aumentou a adesão das células C6 em cultura e em experimentos in vivo promoveu dramático aumento do crescimento tumoral e presença de alterações histológicas nos pulmões sugestivas de metástase. Esses eventos foram relacionados ao acúmulo de ADP extracelular, recrutamento de plaquetas para a área tumoral e pulmonar, aumento de angiogênese e da resposta inflamatória, denotado pela presença de infiltrado leucocitário nos gliomas e aumento sérico das citocinas IL-1 , TNF-a e IL-6. Além disso, os receptores purinérgicos modularam a secreção espontânea e estimulada por TLR de IL-8 e MCP-1, bem como a proliferação celular induzida por LPS em linhagem de glioma humano. Finalmente, a análise da expressão das ectonucleotidases em gliomas de ratos e de humanos revelou ausência das NTPDase1 e 2, baixa expressão da NTPDase3 e expressão elevada da ecto-5´-NT/CD73, indicando que a alteração no padrão de expressão das ectonucleotidases também é uma característica de tumores humanos. Os resultados dessa tese reforçam a hipótese do envolvimento do sistema purinérgico na progressão dos gliomas e sugerem esse sistema como um alvo interessante no combate dos tumores cerebrais. / Extracellular nucleotides modulate a variety of biological actions via purinergic receptor activation. These effects are modulated by ectonucleotidases, such as ENTPDases and ecto-5´-NT/CD73, which hydrolyze ATP to adenosine in the extracellular milieu. Disruption on purinergic signaling has been involved in glioma progression. ATP induces glioma cell proliferation and, in opposite to astrocytes, gliomas have low expression of all NTPDases, particularly NTPDase2. Therefore, the restoration of the ATPase activity to gliomas could be a strategy to overcome the ATP mediated effects. Accordingly, the co-injection of apyrase/NTPDase1, an ATP scavenger, with gliomas decreases the glioma progression in vivo. The objective of this study was to better evaluate the purinergic receptor and E-NTPDase participation on glioma progression. The analysis of C6 cell line and C6 ex vivo cultures revealed similarity in the purinergic receptor and E-NTPDase expression, suggesting that disruption in the purinergic pathway is a characteristic exhibited by primary glioma cell cultures. Surprisingly, the NTPDase2 restoration to C6 gliomas resulted in increased tumor malignity. The NTPDase2 overexpression increased the C6 cell adhesion in culture and in in vivo experiments it promoted dramatic glioma growth and induced histological alterations in lung tissue suggestive of metastasis. These events were related to extracellular ADP accumulation, platelets recruitment to glioma and lung tissues, increase of angiogenesis and inflammation. Additionally, it was observed an increase of leukocyte infiltration in the implanted tumors and in IL-1 , TNF-a e IL-6 serum levels. Moreover, the purinergic receptors modulated the basal and TLR stimulated IL-8 and MCP-1 release and the LPS induced cell proliferation in a human glioma cell line. Finally, the analysis of ectonucleotidases expression in rat and human gliomas showed the absence of NTPDase1 and 2, low expression of NTPDase3 and high expression of ecto-5´-NT/CD73, indicating that alterations in the ectonucleotidase expression pattern is a characteristic also exhibited by human tumors. In conclusion, these results reinforce the hypothesis of purinergic signaling involvement in glioma progression and point to this pathway as an interesting target for glioma treatment.

O nucleotídeo de purina ATP, no meio extracelular, participa de diversos processos fisiológicos e patológicos como vasodilatação/constrição, proliferação, diferenciação, modulação sináptica, dor, inflamação e morte celular. Entre os receptores purinérgicos, o subtipo P2X7 é bem descrito como mediador de processos inflamatórios pela liberação de IL-1β e de morte celular com ativação de caspases. Evidências na literatura apontam para o envolvimento do sistema purinérgico no crescimento e na progressão de glioblastomas. Esses tumores são os mais comuns do SNC e seu alto grau de malignidade deve-se à capacidade de rápida proliferação e invasão no tecido sadio. Considerando a resistência que os glioblastomas apresentam à morte celular induzida por ATP, o objetivo desse trabalho foi investigar a expressão e funcionalidade do receptor citotóxico P2X7 em linhagens de gliomas e suas implicações na biologia tumoral. Entre as linhagens de glioblastomas estudadas, a linhagem de camundongo GL261 apresentou sensibilidade à morte induzida por ATP pela liberação de LDH, incorporação de iodeto de propídio e diminuição da viabilidade mitocondrial. O ATP foi tóxico em concentrações acima de 2 mM, o BzATP foi mais potente que o ATP e o antagonista oATP bloqueou completamente a morte celular. O silenciamento do receptor P2X7, na GL261, por RNA de interferência, também aboliu a morte celular induzida por ATP confirmando o envolvimento desse receptor, embora a formação de poro ainda tenha sido visível nestas células, ainda que diminuída. A morte celular apresentou características necróticas como a ruptura de membrana, a falta de ativação de caspases e a falta de externalização de fosfatidilserina, mas ao mesmo tempo houve encolhimento celular. Além dos efeitos mediados pela sua ativação, o silenciamento do receptor P2X7 na linhagem GL261 diminuiu a adesão e promoveu a migração celular, características de tumores mais invasivos. Em amostras de pacientes com gliomas, foi possível observar que a expressão de P2X7 correlaciona diretamente com a sobrevida dos pacientes. Juntamente com os dados da linhagem silenciada para o P2X7, é possível apontar o receptor P2X7 como uma possível molécula anti-tumoral, cuja redução na expressão diminui a adesão, aumenta a migração, torna a célula resistente à morte induzida por ATP, possivelmente diminuindo, desta forma, a sobrevida de pacientes acometidos por esta doença. / Purines nucleotides, particularly extracellular ATP, participate in diverse physiological and pathological processes such as vasodilatation/constriction, cell proliferation, differentiation, synaptic modulation, inflammation, pain sensation and cell death. Among purinergic receptors, the P2X7 subtype is well described as a mediator of inflammatory processes via IL-1β release and cellular death induced by caspases activation. Evidences in the literature point to the purinergic system involvement in growth and glioblastoma progression. These tumors are the most common in the central nervous system (CNS) and their high grade of malignance is the result of rapid proliferation and invasion abilities. Considering the resistance that glioblastomas show to ATP-induced cell death, the objective of this work was to investigate the expression and function of cytotoxic P2X7 receptor in glioma cell lines and their implications in tumor biology. Among the glioma cell lines, the mouse GL261 was sensitive to ATP-induced cell death with LDH release, iodide incorporation and a decrease in mitochondrial viability. ATP was toxic in concentrations above 2 mM, BzATP was more potent than ATP and the antagonist oATP blocked completely the cell death induced by ATP. P2X7 receptor silencing in GL261 by RNA interference, also abolished ATP-induced cell death, confirming this receptor involvement, although a diminished pore induction was observed. Cellular death had necrotic features like membrane rupture, lack of caspase activation and lack of phosphatidylserine exposure, but at the same time shrinking also occurs. Beyond its activation effects, P2X7 knockdown in GL261 decreased cell adhesion and promoted migration, features common to more invasive tumors. In human glioma samples, P2X7 receptor expression correlated directly with patients‟ survival. Together with data from P2X7-knocked down cell line, it is possible to suggest the P2X7 receptor as an anti-tumoral molecule, whose expression reduction leads to decreased adhesion, increased cell mobility, resistance to ATP-induced cell death, and therefore, decreased patients survival.

Resumo: Gliomas são os tumores mais comuns do sistema nervoso central, e em seu mais alto grau de malignidade (também chamado de glioblastoma multiforme - GBM) são tidos hoje como incuráveis, sendo a sobrevida nesses casos de no máximo 15 meses. Uma das principais causas da alta taxa de mortalidade é a elevada capacidade de invasão, processo realizado pelas metaloproteinases de matriz (MMPs). As principais MMPs envolvidas na invasão de gliomas são as MMPs 2, 9 e a MT1-MMP. As MMPs são inibidas principalmente por seus inibidores tissulares solúveis (TIMPs) ou RECK, uma glicoproteína ancorada a membrana. RECK está presente principalmente em microdomínos ricos em colesterol na membrana celular (lipid rafts) e é capaz de inibir através de diversos mecanismos as MMPs 2, 9 e a MT1-MMP. Recentemente, foi descrito um transcrito alternativo do gene RECK (RECKB), e evidências suportam que RECKB esteja relacionado a um fenótipo maligno. Já as TIMPs (4 em humanos) são proteínas solúveis e menos específicas. O balanço negativo MMPs/Inibidores é fundamental para o controle do processo invasivo, tornando importante a busca de compostos capazes de estimular esse balanço a favor dos inibidores. As estatinas são inibidores da enzima HMG-CoA redutase, fundamental na síntese de colesterol e isoprenóides, e são hoje muito utilizadas por pacientes com hipercolesterolemia. Recentemente, alguns autores associaram o uso das estatinas a uma menor incidência em diversos tipos de tumores (inclusive gliomas), pois proteínas fundamentais para a proliferação e invasão, como Ras e Rho, necessitarem de moléculas isoprenóides para ancorarem-se na parte interna da membrana e assim exercerem suas funções corretamente. Posto isso, o objetivo deste trabalho foi investigar os efeitos da sinvastatina na viabilidade, migração e parada de proliferação em linhagens de gliobastoma humano U87MG e T98G, e verificar a contribuição do balanço MMPs/Inibidores para o fenótipo anti-invasivo atribuído à sinvastatina. Primeiramente, nossos dados mostraram que a sinvastatina foi capaz de diminuir a viabilidade celular a partir de 48 horas de tratamento, causando a perda de em média 70% na maior dose (5?M) e maior tempo de tratamento (72 horas). Após 48 horas de tratamento com 1 e 5?M de sinvastatina, houveram alteações significativas na morfologia das duas linhagens, um aumento em torno de 20% de células na fase G1 na linhagem U87MG aumentando também o conteúdo de DNA fragmentado em ambas as linhagens, indicando morte celular. Ainda, houve uma diminuição significativa na migração das duas linhagens já a partir de 24 horas de tratamento. Os dados de expressão de mRNA mostraram, de modo geral, que o tratamento com a sinvastatina foi capaz de favorecer o balanço à favor das TIMPs em relação às MMPs 2, 9 e MT1-MMP. Não houve modulação de RECK canônico (RECKA), tanto da proteína, quanto do mRNA, mas o tratamento diminuiu significativamente os níveis de mRNA do transcrito alternativo RECKB. Ainda, a sinvastatina foi capaz de alterar a localização na membrana de RECK, podendo estar afetando a ação dessa proteína como inibidor de MMPs. Os dados obtidos nesse trabalho ressaltam a importância da sinvastatina como possível adjuvante na terapia anti-tumoral e mostraram que os inibidores de MMPs podem ter uma importante contribuição na contenção da invasão, auxiliando na busca a um melhor prognóstico para pacientes com tumores malignos da glia.

Gliomas malignos compreendem o subtipo mais comum e devastador de tumores primários do sistema nervoso central (SNC), sendo o Glioblastoma Multiforme (GBM) a forma mais agressiva e mortífera. Pacientes com este tipo de tumor apresentam um prognóstico de sobrevida que não ultrapassa os 18 meses, após o diagnóstico. Isso é decorrente do fato de que os GBMs possuem elevada resistência aos tratamentos de quimio e radioterapia, além de serem altamente infiltrativos e neurologicamente destrutivos. Um importante fator que contribui para essa resistência é a superexpressão da proteína XIAP (X-linked Inhibitor of Apoptosis), o mais potente inibidor de apoptose da família das IAPs. Este atua inibindo diretamente a ativação das Caspases 3, 7 e 9. P53 é considerada uma das mais potentes proteínas supressoras tumorais, uma vez que esta atua como reguladora central em diversas vias de sinalização de mecanismos celulares distintos, como a via de controle do ciclo celular, reparo ao DNA, apoptose, senescência, autofagia, entre outras. Isto justifica o fato de p53 estar frequentemente mutada, nos mais variados tipos de cânceres. Portanto, o objetivo do presente trabalho foi estudar os efeitos resultantes da interação entre a superexpressão da proteína supressora tumoral p53 e o silenciamento da proteína anti-apoptótica XIAP na proliferação, na sobrevivência de GBMs. Quando p53 foi superexpressa (P+) na linhagem de glioma U87 silenciada para XIAP (Xi), através de RNAi, a taxa de proliferação celular reduziu significativamente em relação às células com as intervenções isoladas (U87Xi e U87wtP+) ou em relação ao controle selvagem U87wt, ao longo de dez dias. O ensaio de citotoxicidade LDH revelou um aumento na desestabilização da membrana citoplasmática nas células com a manipulação gênica combinada (U87XiP+) em relação os controles U87Xi e U87wtP+. O ensaio com AnexinaV/PI demonstrou uma elevação na marcação de células U87XiP+ com os dois marcadores, indicando uma maior indução de morte celular em relação aos controles. Além disso, como consequência da modulação combinada de p53 e XIAP, os níveis das proteínas pró-apoptóticas Bax e PUMA aumentaram tanto na linhagem U87wt, quanto na linhagem U87Xi, ao superexpressar p53. Além disso, os níveis de p21 e da proteína anti-apoptótica Bcl-xL foram reduzidos na linhagem U87Xi em relação ao controle U87wt. Outra constatação importante foi o aumento dos níveis de caspase-3 na linhagem U87Xi em relação ao controle U87wt e um aumento ainda maior nas células com a intervenção combinada (U87XiP+). Todos estes dados convergem para o fato de que a combinação do silenciamento de XIAP e superexpressão de p53 é mais efetiva na redução da proliferação e indução de morte na linhagem de glioma U87, do que as manipulações gênicas realizadas de forma isoladas, além de sugerir uma possível via de integração entre XIAP e p53, tendo como ponto de conexão o controle dos níveis citoplasmáticos da proteína p21 tanto por p53, quanto por XIAP, mostrando que a modulação combinada de proteínas da via apoptótica é capaz de potencializar os efeitos produzidos pelas intervenções de forma isoladas, representando uma nova e promissora estratégia no desenvolvimento de novas terapias para o tratamento de Gliomas.