As the global population rises, the demand for food increases which underscores a need for improvement in food security. Disease pressures are a major concern surrounding sustainable agriculture. Static crop populations, containing little to no genetic diversity, are vulnerable to diverse pathogen populations. Wild relatives of crop plants are a reservoir for new disease resistance traits that can be introgressed into cultivated crops. The identification of novel disease resistance is of paramount importance because pathogen co-evolution is not only defeating current resistance genes (R genes) but chemical controls as well. Phytophthora sojae (P. sojae), the causal agent of Phytophthora root and stem rot disease, reduces soybean harvests worldwide. We developed an approach to screen for new R genes that recognize core effectors from P. sojae. We expect R genes identified by these screens to be durable because P. sojae requires core effectors for virulence. We utilized effector-based screening to probe Glycine soja germplasm with core RXLR effectors from P. sojae to search for novel R genes. We developed segregating populations from crosses of P. sojae resistant G. soja germplasm with susceptible G. max cultivar Williams to determine inheritance of potential R genes in germplasm that responded to core effectors. We are using marker assisted breeding to map disease resistance traits in recombinant inbred (RI) lines. To better understand pathosystems, we examined host resistance and susceptibility using bioinformatics. We analyzed the interaction between Arabidopsis thaliana ecotype Col-0 and Hyaloperonospora arabidopsidis isolate Emwa1 using a publicly available RNA time-course experiment. We describe a new algorithm to sort genes into time-point specific clusters using activation and repression parameters. Gene ontology annotations were used to identify defense genes with unique expression profiles, and A. thaliana null mutants for these genes were significantly more susceptible to Emwa1 than wild-type. We plan to use these tools to rapidly identify and guide introgression of durable disease resistance into crop species. / Ph. D.

No description available.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

LSD (Lesion Simulating Disease) é uma família de proteínas dedo de zinco descritas como importantes na resposta hipersensitiva (HR – hipersensitive response), limitando a área da lesão e a morte celular programada (PCD – programmed cell death), regulando negativamente as espécies reativas de oxigênio (ROS – reative oxygen species) geradas em condições de estresse biótico e abiótico. Até o presente momento, a maioria dos estudos incluindo genes LSD foi realizada em Arabidopsis thaliana, havendo poucos relatos em outros organismos. Além disto, a identificação completa dos genes LSD não foi ainda descrita, o que dificulta a reconstrução da história evolutiva desta família. Assim, os objetivos deste estudo foram identificar sequências de genes LSD em diferentes genomas, realizar a análise filogenética dessa família e avaliar o perfil de expressão de genes GmLSD em diferentes órgãos de soja e sob condições de estresse. Nossos resultados permitiram a identificação de 117 possíveis genes LSD exclusivamente em Viridiplantae. Os organismos basais Volvox carteri e Chamydomonas reinhardtii apresentaram uma cópia de genes LSD. Além disso, a expansão do número de cópias gênicas parece ter ocorrido no clado Embriófita. As sequências identificadas foram analisadas quanto à presença do domínio dedo de zinco característico, sendo encontradas proteínas com uma, duas e três cópias de domínios LSD. Foi observada uma ampla conservação das três sequências de domínios LSD, indicando a manutenção destas ao longo da evolução da família. A análise filogenética mostrou que a arquitetura de proteínas com três domínios LSD representa a condição mais ancestral, sendo presente desde os organismos basais. As proteínas com dois domínios LSD foram identificadas somente no clado Embriófita e proteínas que possuem um domínio LSD foram altamente representadas no clado gramíneas. Os genes de monocotiledôneas e dicotiledôneas não formaram grupos separados, indicando que a expansão da família LSD foi anterior à diversificação entre esses clados. A análise de expressão dos genes GmLSD em diferentes órgãos de soja mostrou que estes tem expressão variável dependente do órgão. Foi avaliada a expressão dos genes GmLSD em resposta a Phakopsora pachyrhizi, o agente causador da ferrugem asiática da soja (ASR – Asian Soybean Rust). A abordagem de RNA-seq (no qual foi analisada somente a região da lesão) permitiu a identificação de GmLSD1, GmLSD3 e GmLSD4 nos genótipos suscetível (EMBRAPA48) e resistente (PI561356), enquanto que GmLSD6 e GmLSD8 foram detectados somente no genótipo resistente PI561356. Por outro lado, o experimento de RT-qPCR (em que foram analisadas folhas de soja infectadas por P. pachyrhizi) revelou que todos os genes GmLSD foram responsivos a inoculação do fungo, embora GmLSD1, GmLSD4 e GmLSD8 tenham sido modulados exclusivamente no genótipo resistente PI561356. A análise do perfil de expressão dos genes GmLSD em raízes e folhas de plantas de soja em condições de déficit hídrico mostrou que a maioria dos genes GmLSD foi modulada em resposta ao estresse. No entanto os genes GmLSD5 (folhas), GmLSD1 e GmLSD2 (raízes) foram diferencialmente expressos somente na cultivar tolerante EMBRAPA48. Esses resultados sugerem um possível envolvimento dos genes GmLSD na PCD causada por estresses bióticos e abióticos, assim como observado em Arabidopsis thaliana. Análises futuras com os genes GmLSD são particularmente interessantes para avaliar o potencial biotecnológico destes genes, sobretudo visando o desenvolvimento de plantas de soja mais tolerantes/resistentes à diferentes condições de estresse. / LSD (Lesion Simulating Disease) is a family of zinc finger proteins described as important in the hypersensitive response (HR), limiting the area of injury and the programmed cell death (PCD), negatively regulating the Reactive oxygen species (ROS) generated under biotic and abiotic stress conditions. To date, most studies including LSD genes were performed in Arabidopsis thaliana, with few reports in other organisms. Moreover, the complete identification of LSD genes has not yet been described, which difficult the reconstruction of the evolutionary history of this family. The goals of this study were to identify LSD gene sequences in different genomes, perform a phylogenetic analysis of this family and evaluate the expression profile of GmLSD genes in different soybean organs and under stress conditions. Our results allowed the identification of 117 putative LSD genes exclusively in Viridiplantae. Volvox carteri and Chamydomonas reinhardtii basal organisms showed one copy of LSD gene. Furthermore, the expansion of the number of genes copies seems to be occurred in Embryophyte clad. The identified sequences were analyzed for the presence of the characteristic zinc finger domain, being found proteins with one, two and three copies of LSD domains. We observed a wide conservation of the three sequences of LSD domains, indicating their maintenance throughout the evolution of the family. Phylogenetic analysis showed that the architecture of proteins with three LSD domains is the most ancestral condition, being present since the basal organisms. Proteins with two LSD domains have been identified only in Embryophyte clad and proteins having one LSD domain were highly represented in the Grass clad. The monocots and dicots genes not formed separate groups, indicating that the expansion of the LSD family was prior to diversification between these clades. The expression analysis of GmLSD genes in different soybean organs showed that these having an organ dependent variable expression. We evaluated the expression of GmLSD genes in response to Phakopsora pachyrhizi, the Asian Soybean Rust (ASR) causal agent. The RNA-seq approach (wherein only the lesion site was analyzed) allowed the identification of GmLSD1, and GmLSD3 GmLSD4 in both susceptible (EMBRAPA48) and resistant (PI561356) genotypes, while GmLSD6 and GmLSD8 were detected only in PI561356 resistant genotype. Moreover, the RT-qPCR experiment (in which soybean leaves infected by P. pachyrhizi were analyzed) showed that all GmLSD were responsive to fungus inoculation, although GmLSD1, GmLSD4 and GmLSD8 were differentially expressed only in PI561356 resistant genotype. The analysis of GmLSD genes expression profile in roots and leaves of soybean plants under water deficit conditions showed that the majority GmLSD genes were modulated in response to stress. However, GmLSD5 (leaves), and GmLSD1 GmLSD2 (roots) genes were differentially expressed only in EMBRAPA48 tolerant cultivar. These results suggest a putative involvement of GmLSD genes in the PCD caused by biotic and abiotic stresses, as observed in Arabidopsis thaliana. Further analyzes with GmLSD genes are particularly interesting to evaluate the biotechnological potential of these genes, especially for the development of soybean plants more tolerant / resistant to various stress conditions.

O principal mecanismo de defesa das plantas frente a uma infecção viral é baseado no fenômeno chamado interferência por RNA (RNAi). Por meio da ação coordenada de proteínas como Argonautas, Dicers, RNA polimerases dependentes de RNA e proteínas de ligação a RNA de dupla fita (DRBs), o RNA viral é reconhecido e clivado a pequenos RNAs de interferência derivados de vírus (vsiRNAs). Os vsiRNAs, acoplados ao complexo proteíco de indução ao silenciamento, atuam sobre sequências de RNA ou DNA virais, podendo promover a clivagem, inibição da tradução ou metilação de seus alvos (para vírus de DNA). Neste trabalho foram realizados dois estudos que abordam mecanismos de defesa baseados em RNAi em plantas. No primeiro capítulo é descrito a integração do RNA1 do Cumcumber mosaic virus (CMV) no genoma de Glycine max. Através da análise de bibliotecas de sequenciamento de alta eficiência de RNA mensageiros (mRNAs), pequenos RNAs e DNAs de diferentes cultivares e diferentes tecidos de soja foi possível identificar que o evento de integração envolveu duas moléculas do RNA1 do CMV, o RNA de um retrotransposon e um mRNA de um gene endógeno. No locus aonde ocorreu esta integração as duas sequências do RNA1 estão em sentidos opostos. Os pequenos RNAs (sRNAs) das nossas bibliotecas alinham majoritariamente na região do RNA1 do CMV e são praticamente ausentes nas outras regiões da sequência integrada, sugerindo fortemente a formação de um grampo aonde hibridizam ambas as sequências do CMV. A presença desses sRNAs derivados do CMV em todos os tecidos estudados sugere uma provável função antiviral dessa sequencia que foi integrada em soja. No segundo capítulo, por microscopia confocal, foi estudada a interação entre as proteínas DRBs e o Potato virus X (PVX) durante a infecção viral em Nicotiana benthamiana. É demonstrado que as DRBs 2, 3 e 5 se realocam de sua posição original e se concentram em estruturas chamadas complexos de replicação viral durante a infecção por PVX. Esse fenômeno é um indicativo que essas proteínas podem estar atuando nos primeiros estágios de defesa da planta frente ao vírus. / The main defense mechanism of plants facing a viral infection is based on the phenomenon called RNA interference (RNAi). Through the coordinated action of proteins such as Argonaut, Dicers, RNA dependent RNA polymerases and double-stranded RNAbinding proteins (DRBs), the viral RNA is recognized and cleaved to virus-derived interfering small RNAs (vsiRNAs). The vsiRNAs, coupled to a protein complex that induce the silencing, act on DNA or RNA viral sequences promoting cleavage, translational inhibition or methylation of their targets (for DNA viruses). This work described two studies that address new defense mechanisms based on RNAi in plants. In the first chapter of this thesis is described the integration of the cucumber mosaic virus (CMV) RNA1 in the genome of Glycine max. Through the analysis of deep sequencing libraries of messenger RNA, small RNAs and DNA from different cultivars and different soybean tissues it was possible to identified that the integration event involved two molecules of CMV RNA1, the RNA of a retrotransposon and the mRNA of an endogenous gene. In the locus where the integration occurred the two RNA1 sequences are in opposite directions. Small RNAs (sRNAs) from our libraries mostly aligned in the region of CMV RNA1 and are practically absent in other regions of the integrated sequence, strongly suggesting the formation of a hairpin where both CMV sequences hybridize. The presence of these CMV-derived sRNAs in all surveyed tissues suggests a probable antiviral function for the sequence that was integrated into soybeans. In the second chapter, the interaction between the DRB proteins and the Potato virus X (PVX) during viral infection in Nicotiana benthamiana is assessed by confocal microscopy. It is shown that the DRBs 2, 3 and 5 relocate from its original position and concentrated in structures called viral replication complexes during infection by PVX. This is an indication that these proteins can act in the early stages of plant defense against the virus.

A ampla distribuição das ureases na natureza é um indício da grande importância desta enzima para os mais diferentes organismos, fato que levou diversos pesquisadores ao redor do globo a dedicarem-se exclusivamente à caracterização destas enzimas. Apesar de ser uma proteína estudada ha quase um século, até o início deste trabalho apenas três ureases possuíam suas estruturas cristalográficas elucidadas e todas de origem bacteriana. A urease de Canavalia ensiformis (JBU) foi a primeira enzima desta família a ser descrita, em 1926 e ainda assim, apesar dos incansáveis esforços de diferentes grupos na caracterização estrutural e biológica desta proteína, sua estrutura cristalográfica só foi obtida no primeiro semestre de 2010. Tentativas anteriores de obtenção da estrutura cristalográfica de JBU falharam devido a baixa qualidade dos cristais formados por esta proteína através de técnicas convencionais de cristalização. Desta forma, na primeira parte deste trabalho relatamos o uso de técnicas alternativas de cristalização como o uso de ligantes ou aditivos, proteólise in situ e modificação química de resíduos de amino ácidos na obtenção de cristais de JBU com qualidade superior aos anteriormente obtidos, validando o uso destas metodologias na cristalização de proteínas recalcitrantes. Os cristais aqui obtidos, apesar de apresentarem qualidade superior aos previamente descritos na literatura, não foram otimizados ao ponto de obtenção da estrutura cristalográfica da enzima A atividade enzimática das ureases é dependente da presença de dois íons de níquel precisamente incorporados em seus sítios ativos. A biossíntese deste sítio ativo, bem como a incorporação de níquel na enzima consiste de um processo altamente regulado, cuja ocorrência depende da participação de diversas chaperonas (proteínas acessórias) agindo como reguladores pós traducionais. Apesar dos esforços já realizados, o mecanismo de ativação de ureases ainda permanece obscuro. Até hoje, os estudos concentraram-se em ureases de origem microbiana, sendo a informação disponível ainda extremamente limitada. Menos ainda é conhecido para o sistema de ativação de ureases de origem vegetal. Na segunda parte deste trabalho relatamos pioneiramente as primeiras tentativas de produção e caracterização de proteínas acessórias de origem vegetal. As proteínas UreD, UreF e UreG de soja (Glycine max) foram clonadas e expressas em sistema bacteriano. A proteína UreG de soja, purificada diretamente da planta e também produzida de forma recombinante em E.coli, foi caracterizada quanto a sua estrutura, capacidade de ligação a metais e atividade GTPásica, descrevendo algumas características nunca antes observadas para outras proteínas da mesma família. Também descrevemos o primeiro sucesso na obtenção da proteína acessória UreF tipo 5 selvagem na sua forma solúvel e a caracterização estrutural desta proteína foi realizada. As proteínas acessórias de soja também foram caracterizadas em relação ao seu perfil de expressão em diferentes tecidos, ao longo do desenvolvimento da planta, utilizando PCR em tempo real. Observamos uma grande variação dos níveis de expressão dos diferentes mRNAs nos tecidos avaliados. Uma possível relação entre estes níveis de expressão e a atividade ureásica de cada tecido foi investigada, visando uma melhor compreensão da dinâmica entre a expressão e atividade das proteínas responsáveis pela ativação das ureases vegetais. / The wide distribution of ureases in nature is an indication of the importance of this enzyme for the most different organisms, fact that lead researchers all over the world to dedicate their careers exclusively to the study of these enzymes. Despite of being studied for almost a century, until last year only three crystallographic structures of ureases had been solved, all from bacterial source. The urease from Canavalia ensiformis (JBU) was the first member of this family to be described, in 1926 and still, despite the restless efforts from different research groups on the structural and biological characterization of this protein, its structure was not solved until the beginning of 2010. Early trials to obtain the crystallographic structure of JBU have failed due to the poor quality crystals formed by this protein using conventional crystallization techniques. In this panorama, the first part of this work describes the use of alternative crystallization techniques, such as the use of ligands, in situ proteolisis and chemical modification of amino acid residues, for the obtention of JBU crystals with superior quality than the ones previously described in the literature, validating the use of such techniques on the crystallization of recalcitrant proteins. The crystals obtained here, despite of their superior characteristics, were not refined to the point of generating the crystallographic structure of JBU. The enzymatic activity of ureases is dependent of the presence of nickel ions precisely incorporated in their active sites. The bioassembly of these active sites, including the nickel incorporation, consist of a tightly regulated process, whose occurence depends on the participation of several chaperones (accessory proteins) that work as post-translational regulators. A great deal of effort has already been done on the study of the urease’s activation process; however its details remain unclear. To date, all work done concentrates on the study of microbial ureases, but the available information is very limited and even less information is available for the plant ureases activation process. The second part this work presents the first trials on the production and characterization of plant urease accessory proteins. The proteins UreD, UreF and UreG from soybean (Glycine max) were cloned and expressed in bacterial system. The soybean UreG protein, purified directly from the plant seeds and also produced in recombinant fashion in Escherichia coli, was characterized regarding its structure, metal biding capacity and GTPasic activity, describing a few characteristics never before observed for other proteins of the same family. It is also described the first success on the obtention of the wild type ureF accessory protein in its soluble form and a structural characterization was performed. All accessory proteins from soybean were also characterized for its expression profile in several tissues during its development utilizing real-time PCR and a correlation with the levels of urease activity were investigated. Altogether, these data improve the understanding of multiple factors involved on the urease activation process.

Bibliography: leaves [i]-xvi.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

viii, 132 leaves : ill. photos, tables ; 30 cm. / Title page, contents and abstract only. The complete thesis in print form is available from the University Library. / Thesis (Ph.D.)--University of Adelaide, Dept. of Entomology, 1978

viii, 132 leaves : ill. photos, tables ; 30 cm. / Title page, contents and abstract only. The complete thesis in print form is available from the University Library. / Thesis (Ph.D.)--University of Adelaide, Dept. of Entomology, 1978