Nasal administration has potential for the treatment of indications requiring a fast onset of effect or for drugs with low oral bioavailability. Liquid nasal sprays are relatively common, but can be associated with suboptimal absorption from the nasal cavity; this thesis shows that nasal absorption can be significantly enhanced with a dry powder formulation. It was shown that interactive mixtures, consisting of fine drug particles adhered to the surface of mucoadhesive carrier particles, could be created in a particle size suitable for nasal administration. Sodium starch glycolate (SSG), a common tablet excipient, was used as carrier material. In vitro evaluation of the formulation indicated that the mucoadhesion of the carrier was unlikely to be affected by the addition of a drug. The powder formulation did not improve the in vitro transfer of dihydroergotamine across porcine nasal mucosa compared with a liquid formulation; however, the results were associated with methodological shortcomings. The binding of model substances to SSG and three other excipients was evaluated. Ion exchange interactions were for example detected between SSG and cationic drugs, but these interactions were most extensive at low salt concentrations and should unlikely affect in vivo bioavailability at physiological salt concentrations. Absorption of the peptide drug desmopressin from the SSG nasal formulation, from a novel sublingual tablet formulation and from a commercial nasal liquid spray was evaluated in a clinical trial. While no improvement over the liquid spray was seen with the sublingual tablet, plasma concentrations after the nasal powder formulation were three times higher than those after the liquid spray. All formulations were well accepted by the volunteers. The use of currently available mucoadhesive carrier particles in interactive mixtures offers potential for a new method of producing nasal powder formulations that should also be applicable to large scale production.

La bactérie Erwinia amylovora est responsable de la maladie du feu bactérien des Maleae (pommier, poirier...). Le pouvoir pathogène de cette bactérie dépend d'une seringue moléculaire appelé système de sécrétion de type 3 (SSTT). Ce SSTT permet à la bactérie d'injecter des effecteurs dans les cellules de la plante. Parmi les effecteurs injectés, DspA/E est l'effecteur indispensable au pouvoir pathogène d'E. amylovora. Cet effecteur est à lui seul capable de provoquer la mort des cellules chez le pommier et le tabac et permet à la bactérie de se multiplier de manière transitoire chez A. thaliana. L'objectif de ce travail de thèse était de comprendre la fonction de DspA/E dans la cellule végétale et d'identifier des facteurs végétaux impliqués dans la toxicité de DspA/E. Afin de répondre à cette question, des plantes transgéniques exprimant DspA/E sous contrôle d'un promoteur inductible à l'estradiol ont été construites.Dans un premier temps, la caractérisation phénotypique des lignées exprimant DspA/E a été effectuée. Les résultats obtenus montrent que DspA/E est toxique lorsqu'il est exprimé in planta (il provoque la mort des cellules, inhibe la germination, la croissance racinaire et la traduction) et permet la multiplication in planta d'un mutant dspA/E. Un crible de mutants suppresseurs de la toxicité de l'effecteur DspA/E a été effectué sur une lignée transgénique exprimant DspA/E dans le but d'identifier un ou plusieurs gènes impliqués dans la toxicité de DspA/E. Ce crible suppresseur a permis d'identifier un candidat potentiel impliqué dans la photo-respiration, la glycolate oxydase 2 (GOX2). L'analyse fonctionnelle réalisée sur le mutant gox2-2 a permis de montrer que le gène GOX2 est un régulateur positif des réponses de défense d'A. thaliana en réponse à l'infection par E. amylovora.Enfin, la caractérisation du stress oxydant a permis de montrer que plusieurs formes actives de l'oxygène (H2O2 et O2.-) s'accumulent au cours de l'interaction entre A. thaliana et E. amylovora. Ceci a permis également de comprendre le rôle de DspA/E sur ce stress oxydant. Nos résultats suggèrent que la glycolate oxydase 2 participerait à l'induction du stress oxydant en perturbant le métabolisme des sucres.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(エネルギー科学) / 甲第18612号 / エネ博第308号 / 新制||エネ||63(附属図書館) / 31512 / 京都大学大学院エネルギー科学研究科エネルギー応用科学専攻 / (主査)教授 平藤 哲司, 教授 馬渕 守, 教授 土井 俊哉 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Energy Science / Kyoto University / DGAM

Peptide hormones are responsible for cellular functions critical to the survival of an organism. Approximately 50% of all known peptide hormones are post-translationally modified at the C-terminus. Enzymatic oxidative conversion of C-terminal glycine extended peptide precursors results in an a-amidated peptide and glyoxylate. Peptidylglycine a-amidating monooxygenase (PAM) is the single known enzyme responsible for catalyzing this reaction. PAM is an O2, Cu(II), and Zn(II) dependent bifunctional enzyme. Initially, PAM hydroxylates the glycyl a-carbon followed by dealkylation of the hydroxylated intermediate to an a-amidated product and glyoxylate. PAM is also responsible for the conversion of glycine extended fatty acids to fatty acid amides and glyoxylate. PAM catalyzes the activation of all glycine-extended prohormones including biomolecules ranging from neuro to physio-homeostatic hormones. Identification of a-amidated hormones from a biological source has been severely hindered by the lack of a specific assay for this distinctive class of biological hormones, indicating that numerous a-amidated hormones remain undiscovered. Based on the selective in situ chemistry of PAM, a novel and specific assay was developed for the discovery of a-amidated hormones. The identification of novel a-amidated hormones will lead to an increased understanding of post-translational modifications and will pioneer a new understanding of a-amidated hormone biosynthesis, regulation, and bioactivity. Discovery of novel a-amidated biomolecules could also lead to their use as pharmaceuticals as there are several currently marketed a-amidated peptide based pharmaceuticals.Inhibition of PAM in cell culture leads to the accumulation of glycine-extended hormones in the conditioned medium. The medium was fractionated by chromatographic techniques and each specific fraction was then assayed by the newly developed platform technology for the presence of a-amidated hormones. For every a-amidated hormone synthesized by PAM, glyoxylate is also formed. Based on this 1:1 molar ratio, several novel spectrophotometric, fluorescent, and chemi-luminescent enzyme linked assays for glyoxylate were developed, which when utilized on cell culture fractions proved positive for the identification of a-amidated hormones. Each novel spectroscopic assay was independently verified by a variety of known methodologies. Moreover the assay was utilized to identify two known a-amidated hormones accumulated from cell culture, which were further verified by Mass Spectral analysis.

Le H2O2 est reconnu comme un signal dans l’activation des mécanismes de défense en réponse à divers stress, et son accumulation est donc régulée étroitement par le système antioxydant des plantes. Puisque la signalisation par le H2O2 peut être transmise par des processus thiol-dépendants, le statut du glutathion pourrait jouer un rôle important. Le rôle de ce composé en tant que molécule antioxydante est bien établi; cependant, son importance en tant que signal reste à élucider. Afin d’étudier cette question, ce travail a utilisé un mutant, cat2, ayant un défaut dans son métabolisme du H2O2 peroxysomal qui engendre, d’une manière conditionnelle, une oxydation et une accumulation du glutathion. Les modifications du glutathion dans cat2 sont accompagnées par l’activation à la fois de réponses dépendantes de l’acide salicylique (SA) ainsi que l’expression de gènes associés à l’acide jasmonique (JA). L’activation des deux voies phytohormonales par le stress oxydant intracellulaire est largement empêchée en bloquant génétiquement l’accumulation du glutathion dans un double mutant, cat2 cad2, qui porte une mutation additionnelle dans la voie de synthèse du glutathion. Les phénotypes contrastants de cat2 cad2 et cat2 gr1, dans lequel la perte de l’activité GR1 aggrave le stress oxydant, suggèrent que des processus glutathion-dépendants relient le H2O2 et l’activation des réponses de pathogenèse SA-dépendantes par un effet qui est additionnel aux fonctions antioxydantes du glutathion. Des comparaisons directes de cat2 cad2 et cat2 npr1 indiquent que les effets de bloquer l’accumulation du glutathion sur l’induction des voies SA et JA chez cat2 ne sont pas causés par une déficience dans la fonction de la NPR1. L’autophagie a été impliquée dans des processus comme la sénescence, et interagirait à la fois avec le stress oxydant et avec la signalisation par le SA. Afin d’explorer des relations entre autophagie et stress oxydant, des mutants atg ont été sélectionnés et croisés avec le cat2. Des analyses phénotypiques ont révélé que l’étendue de lésions SA-dépendantes observée chez cat2 cultivé en jours longs est similaire chez trois double mutants cat2 atg, alors que l’augmentation de la disponibilité en H2O2 peroxysomal liée à la mutation cat2 retarde la sénescence précoce observée chez les mutants atg. Dans son ensemble, le travail suggère que (1) des nouvelles fonctions glutathion-dépendantes sont importantes pour relier la disponibilité en H2O2 intracellulaire et activation des voies de signalisation SA et JA, et (2) que le H2O2 produit par la photorespiration pourrait jouer un rôle antagoniste dans les phénotypes de sénescence précoce observée chez les mutants atg. / H2O2 is a recognized signal in activation of defence mechanisms in response to various stresses, and its accumulation is thus tightly controlled by plant antioxidant systems. Because H2O2 signals may be transmitted by thiol-dependent processes, glutathione status could play an important role. While the antioxidant role of this compound is long established, the importance of glutathione in signaling remains unclear. To study this question, this work exploited a stress mimic mutant, cat2, which has a defect in metabolism of peroxisomal H2O2 that conditionally leads to oxidation and accumulation of glutathione. In cat2, changes in glutathione are accompanied by activation of both salicylic acid (SA)-dependent responses and jasmonic acid (JA)-associated genes in a time-dependent manner. This up-regulation of both phytohormone signaling pathway by intracellular oxidative stress can be largely prevented by genetically blocking glutathione accumulation in a double mutant, cat2 cad2, that additionally carries a mutation in the pathway of glutathione synthesis. Contrasting phenotypes between cat2 cad2 and cat2 gr1, in which loss of GR1 activity exacerbates oxidative stress, suggest that glutathione-dependent processes couple H2O2 to activation of SA-dependent pathogenesis responses through an effect that is additional to glutathione antioxidant functions. Direct comparison of cat2 cad2 and cat2 npr1 double mutants suggests that the effects of blocking glutathione accumulation on cat2-triggered up-regulation of both SA and JA pathways are not mediated by defective NPR1 function. Autophagy has been implicated in processes such as senescence, and may interact with oxidative stress and SA signaling. To explore relationships between autophagy and oxidative stress, selected atg mutants were crossed with cat2. Phenotypic analysis revealed that SA-dependent lesion spread observed in cat2 grown in long days is similar in three cat2 atg double mutants, whereas increased peroxisomal H2O2 availability in cat2 delays an oxidative stress related-senescence triggered by atg in short days. Overall, the work suggests that (1) novel glutathione-dependent functions are important to couple intracellular H2O2 availability to the activation of both SA and JA signaling pathways and (2) H2O2 produced through photorespiration may play an antagonistic role in the early senescence phenotype observed in atg mutants.