No description available.

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L'objectif de cette thèse a été de contribuer à la compréhension des stratégies d'infection du pathogène opportuniste Aspergillus fumigatus. Ce pathogène est une cause émergente de morbidité et de mortalité chez les patients dont l'immunité est compromise et dans les milieux hospitaliers. Une infection avec Aspergillus est en général appelée une Aspergillose et ellepeut se développer dans un certain nombre d'organes, le plus fréquemment dansl'appareil respiratoire (poumons et sinus). Outre les infections (Aspergillosis invasive), la colonisation par ce champignon peut causer des réactions allergiques (Aspergilloses broncho pulmonaire allergique) et de l'asthme. Le nombre de patients immunodéprimés augmente régulièrement à cause des avancées des traitements du SIDA, du cancer, de la mucoviscidose ainsi que par le nombre grandissant de transplantation d'organes. De nouveaux médicaments antifongiques et des médicaments préventifs sont nécessaires pour venir en soutienaux soins médicaux des patients. Bien que plusieurs fongicides existent déjà sur le marché, l'Aspergillosisinvasive reste souvent fatale. Ceci est lié d'une part à la difficulté d'établir le diagnostic, et d'autre part au fait que des résistances émergent rapidement. La motivation de cette thèse est de comprendre les mécanismes impliqués dans le premier contact entre les conidies et le tissu de l'hôte. Ces mécanismes d'adhésion initiaux sont souvent réalisés par des liaisons entre les lectines et les carbohydrates. Le tissu épithélial et la surface muqueuse du système respiratoire sont couverts de structures possédants des carbohydratestels que les glycoprotéines, les glycolipides et les glycosaminoglycanes. L'identification des lectines d'A. fumigatus et leurs caractérisations devraient dorénavant contribuer à la compréhension de la glycostratégie de ce pathogène opportuniste ainsi que des mécanismes impliqués dans l'adhésion et l'infection. L'analyse détaillée de la structure des lectines permettra d'établir le rôle de cesprotéinesdans la virulence et de guider la conception de glycomimétiques, afin d'inhiber le phénomène d'adhésion. Cettenouvelle approche consistant à bloquer l'adhésion de l'agent pathogène plutôt que sa prolifération, vise à diminuer les résistances par une réduction de la pression évolutive. Deuxstratégies différentes ont été utilisées pouridentifier de nouvelleslectines. Tout d'abord une purification des lectinesà partir d'extraits fongiques brutsa été tentée et d'autre part un criblage pour trouver des séquences similaires avec les protéines codées par A. fumigatusa été réalisé parmi une banque de lectines fongiques connues. / The aim of this thesis was to contribute to the understanding of infection strategies of the opportunistic pathogen Aspergillusfumigatus. This pathogenic mould is an emerging cause of morbidity and mortality in immuno-compromised patients and hospital environments. An infection with Aspergillus is generally referred to as Aspergillosis; it can develop in a variety of organs but the most common sites are the respiratory apparatus i.e. lungs and sinuses. Besides infections (invasive aspergillosis), colonization with the fungus can cause allergic reactions (allergic broncho pulmonary aspergillosis) and asthma. The number of immuno-suppressed patients is steadily increasing due to advancement in the HIV, cancer and cystic fibrosis medical care, as well as an increasing number of organ transplantations. Needless to say that new antifungal drugs and preventive medication is desperately needed to support medical care for those patients. Even though several fungicides already exist on the market, invasive aspergillosis remains to be often fatal. On one hand, this is due to difficulties in diagnosis and on the other hand, resistances are emerging rapidly. The motivation behind this thesis is to understand the underlying mechanisms that are involved in the first contact between conidial spores and host tissues. Initial adhesion steps often involve carbohydrate binding proteins, called lectins. They recognize glycoconjugates such as glycoproteins, glycolipids and glycosaminoglycans which cover the epithelial tissue and mucosal surface of the respiratory tract.. Identification and characterization of the lectins from A. fumigatus will therefore contribute to the understanding of the glycostrategy of this opportunistic pathogen and of the mechanisms involved in adhesion and infection. Detailed structural analysis of the carbohydrate-protein interactions will allow ascertaining the lectins role in virulence and guide the design of glycomimetics, as adhesion inhibitors. With this novel approach of targeting the pathogen adhesion rather than its proliferation, resistances are believed to be less frequent due to the lack of evolutionary pressure. In this work, two different strategies were employed to obtain novel lectins. Firstly, lectins were purified from crude fungal extracts and secondly the A. fumigatus genome was screened for encoded proteins showing sequence similarity with known fungal lectins. While lectin purification from the crude extracts was inconclusive due to low lectin activity in the starting material, genome screening showed that several putative lectins were present. One of these lectins, named AFL6, belonged to the cyanovirin-N homolog (CVNH) family and it was recombinantly expressed and purified. Glycan array and micro calorimetry techniques were carried out to investigate its carbohydrate binding specificityand the three dimensional structure was determined using X-ray crystallography. The structure showed an overall similarity with other CVNHs with slight differences in the presumed carbohydrate binding sites. Unlike other family members, it shows a low affinity for mannosides and an apparent affinity for lactosamine containing glycan structures.

Les lectines de type C (CLRs) sont des récepteurs impliqués dans la reconnaissance d’oligosaccharides et principalement exprimés à la surface des cellules présentatrices d’antigène (APCs) et notamment des cellules dendritiques (DCs), véritable sentinelle de notre système immunitaire. Elles sont impliquées dans la reconnaissance de motifs spécifiques exprimés à la surface d’agents pathogènes et sont capables de stimuler le système immunitaire afin de déclencher une réponse adaptée. Ce rôle crucial joué par les CLRs dans l’équilibre de la réponse immunitaire confère aux interactions CLR/glycane des perspectives d’applications pharmaceutiques. L’objectif à long-terme du projet de recherche dans lequel cette thèse s’intègre consiste à utiliser ces CLRs pour modeler les réponses du système immunitaire. A cette fin, des néoglycoconjugués spécifiques de chaque CLR doivent être développés. Au cours de cette thèse, 9 CLRs ont été produits BDCA2, DC-SIGN, DC-SIGNR, dectin-1, dectin-2, langerin, LSECtin, MCL and Mincle. Différentes stratégies de production ont été testées en parallèle, incluant des techniques d’adressage au périplasme en vue d’obtenir des protéines solubles et fonctionnelles et de l’expression cytoplasmique, sous forme de corps d’inclusion suivie d’étapes de renaturation qui s’est révélé la plus efficace au final. Une stratégie permettant de construire des tétramères artificiels de CLRs, appelés TETRALEC, a été mise au point. Cet outil permettant le criblage et la caractérisation des lectines a été obtenu avec DC-SIGNR par un marquage spécifique de la lectine. Le complexe TETRALEC a été caractérisé au niveau structural et des tests fonctionnels ont été menés sur des puces à glycanes et des cellules pathogènes. La série de CLRs que nous avons produites a été utilisée pour cribler des puces à glycanes et à glycomimétiques. Ces études nous ont permis de mettre en évidence des interactions dépendantes de l’environnement du glycane et d’identifier de nouveaux glycanes ou glycomimétiques spécifiques de certains CLRs. En effet, de manière étonnante, plusieurs des CLRs testés sont capables, pour un glycane donné, de discriminer des isomères de position ouvrant ainsi de nouveaux questionnements sur la signification biologique de cette sélectivité. De plus des glycomimétiques reconnaissant préférentiellement dectin-2 par rapport à DC-SIGN, DCSIGNR et langerin ont été identifiés. Le choix des glycomimétiques et l’évaluation des étapes de leur optimisation ont été permis par diverses études biophysiques qui ont quantifié la force et la spécificité des interactions. Ceci a permis le développement d’un ligand optimisé sélectif de DC-SIGN. La co-cristallisation de la protéine avec ce ligand a révélé un intéressant mode de liaison qui amène également de nouvelles questions. Simultanément à l’optimisation de ligands monovalents, un premier pas a été réalisé vers la conception d’une molécule pour permettre une vaccination contre le cancer médiée par les CLRs. Les résultats de SPR ont identifié des candidats potentiellement intéressants et des tests biologiques préliminaires ont été réalisés. / C-type Lectin Receptors (CLRs) are carbohydrate-binding proteins mainly expressed on Antigen Presenting Cells (APCs), including dendritic Cells (DCs), the sentinel of the innate immune system. They recognize pathogens or damaged cells by interacting with glycan features and the encounter between the CLR and its ligand constitutes a necessary step for the activation of the adaptive immune system. This crucial role played by CLRs in the balance of immune responses offers to CLR-glycan interactions pharmaceutical applications. The long-term objective of the research project in which this PhD is included is to use these CLRs as modulators in order to tailor the immune system responses. To do so, neoglyco-conjugates selective to each individual CLR have to be developed.Nine different CLRs were produced in this work: BDCA2, DC-SIGN, DC-SIGNR, dectin-1, dectin-2, langerin, LSECtin, MCL and Mincle.Several approaches have been explored in parallel for CLR production, ranking from bacterial periplasmic targeting, aiming to express soluble and functional protein, to inclusion bodies production into the bacterial cytoplasm, with subsequent protein refolding. Our collection of CLRs were used to screen glycan and glycomimetic arrays, highlighting context-dependent binding and identifying natural ligands or glycomimetics selective to each CLRs. Thus, several CLRs were surprisingly able to differentiate between positional isomers of a given N-Glycan, which opens new questions regarding the biological significance. Moreover, glycomimetics with a selectivity towards dectin-2 over DC-SIGN, DC-SIGNR and langerin CLRs have been identified.To guide the choice of the glycomimetics and estimate their optimisation, diverse biophysical studies were performed to evaluate the strength and specificity of the interaction. This enabled the development of an ultimate ligand selective towards DC-SIGN. A co-crystallised structure of the protein with this ligand revealed an interesting binding mode that also opens new questions.Simultaneously to monovalent ligand optimization, a first step towards the design of a highly defined molecule for cancer vaccination by CLR targeting was made. SPR results revealed potential candidates to exploit and preliminary biological assays were performed. Finally, a strategy for tetrameric lectin engineering as been explored, termed TETRALEC. This tool for screening and lectin characterization, has been obtained with one the lectin of the study, DC-SIGNR, by a site-specific labelling of the lectin. The TETRALEC complex was structurally characterised and functional assays were performed on glycan array and pathogen cells.

L'immunité, un système de défense incroyable, protège la plupart des organismes vivants des pathogènes nuisibles. Les composantes innée et acquise de l'immunité travaillent ensemble pour assurer une protection efficace de l'homme ainsi que de tous les autres vertébrés à mâchoires. Les cellules dendritiques, la composante de l'immunité innée, passent régulièrement en revue les tissus périphériques, capturent et traitent les agents pathogènes envahisseurs et enfin, présentent les antigènes aux lymphocytes T pour stimuler les réponses immunitaires adaptatives spécifiques. Ces cellules reconnaissent les organismes étrangers à l'aide de plusieurs "Pattern Recognition Receptors" (PRRs), qui se lient spécifiquement à des molécules à la surface des agents pathogènes, dits "Pathogen Associated Molecular Patterns (PAMPs). Parmi les PRR, les récepteurs lectine de type C (CLRs) ont un rôle important dans la reconnaissance et dans la capture des pathogènes. Cependant, DC-SIGN, l'un de ces CLR, peut être détourné par de nombreux agents pathogènes dangereux, y compris le VIH, afin de promouvoir leur infection. Ce travail vise à développer des antagonistes de DC-SIGN, qui serait en mesure de bloquer l'utilisation de ce récepteur par des agents pathogènes. Pour atteindre cet objectif, la stratégie du développement de ligands glycomimétique de DC-SIGN et la présentation multivalente des glycomimétiques monovalents sélectionnés a été employée. Les études présentées ont été réalisées en collaboration avec plusieurs groupes de chimistes, qui ont conçu et synthétisé différents composés glycomimétiques ainsi que différentes plates-formes multivalentes. Des ligands monovalents de DC-SIGN basés sue le mannose, le fucose et sur les composés C-glycosidiques ont été explorés et différentes plates-formes de valence avec différents modes de présentation dans l'espace ont été étudiées. En utilisant la résonance plasmonique de surface (SPR), l'activité des composés à inhiber DC-SIGN a été estimée. De plus, les composés ont été évalués pour leur sélectivité pour DC-SIGN par rapport à la Langerine, un autre CLR ayant un rôle protecteur contre l'infection par le VIH. Certains de ces composés ont été caractérisés par cristallographie aux rayons X et par spectrométrie RMN. Les études de SPR de composés multivalents ont confirmé l'amélioration de l'activité, mais a également révélé des complications possibles. Dans l'ensemble, ces études ont permis d'identifier les deux meilleurs nouveaux composés et de suggérer des perspectives pour l'amélioration de ces composés et des plates-formes de présentation multivalentes. / An amazing defense system, the immunity, protects most of the living organisms from harmful pathogens. The innate and acquired immunity components work together to provide efficient protection of humans as well as all other jawed vertebrates. Dendritic cells, the component of the innate immunity, routinely survey the peripheral tissues, capture and process the invading pathogens, and finally, present the antigens to the T cells to boost the pathogen specific adaptive immune responses. These cells recognize the foreign organisms with the help of multiple pattern recognition receptors (PRRs), which specifically bind molecules on the pathogen surfaces, so-called pathogen associated molecular patterns (PAMPs). Among PRRs, the C-type lectin receptors (CLRs) have an important role in pathogen recognition and capturing. However, one of these CLRs, DC-SIGN, has been shown to be hijacked by many dangerous pathogens, including HIV, to promote their infection. This work aims to develop the antagonists of the C-type lectin receptor DC-SIGN, which would be able to block the use of this receptor by pathogens. To achieve that, the strategy of the development of glycomimetic ligands of DC-SIGN and the multivalent presentation of the selected monovalent glycomimics has been employed. The presented studies were accomplished in collaboration with several chemists groups, who have designed and synthesized different glycomimetic compounds as well as different multivalent platforms. The mannose-based, fucose-based and the C-glycosidic compounds were explored as monovalent DC-SIGN ligands, and multivalent platforms with different valence as well as ligand presentation in space were investigated. Using surface plasmon resonance (SPR), the activity of the compounds to inhibit DC-SIGN was estimated. Moreover, the compounds were evaluated for their selectivity to DC-SIGN vs langerin, another CLR with a protective role from HIV infection. Some of the compounds were structurally characterized by X-ray crystallography and NMR spectrometry studies. The SPR studies of multivalent compounds confirmed the improved activity, but also revealed possible complications Overall, these studies allowed to identify two new monovalent leads and to draw perspectives for their further improvement, and suggested the improvement of multivalent presentation platforms.

In this thesis, carbohydrate mimicry is investigated through the syntheses of carbohydrate analogues and evaluation of their inhibitory effects on carbohydrate-processing enzymes. Galactofuranosides are interesting structures because they are common motifs in pathogenic microorganisms but not found in mammals. M.tuberculosis, responsible for the disease tuberculosis, has a cell wall containing a repeating unit of alternating (1→5)- and (1→6)-linked β-D-galactofuranosyl residues. Synthetic inhibitors of the enzymes involved in the biosynthesis of the cell wall could find great therapeutic use. The first part of this thesis describes the first synthesis of the hydrolytically stable carbasugar analogue of galactofuranose, 4a-carba-β-D-Galf, and the synthetic work of synthesising β-linked pseudodisaccharides containing carba-Galf, which were tested for glycosyltransferease inhibitory activity. The pseudodisaccharide carba-Galf-(β1→5)-carba-Galf was found to be a moderate inhibitor of the glycosyltransferase GlfT2 of M.tuberculosis. The thesis also describes how a general method towards biologically relevant α-linked carba-Galf ethers was developed. The final part of this thesis is focussed on the formation of nitrogen-linked monosaccharides without the participation of the anomeric centre. Such a mode of coupling is called tail-to-tail neodisaccharide formation. The couplings of carbohydrate derivatives via the Mitsunobu reaction are successfully reported herein. The method describes the key introduction of an allylic alcohol in the electrophile and the subsequent functionalisation of the alkene to obtain the neodisaccharide. Two synthesised neodisaccharides presented in this thesis have been sent to be tested for glycosidase inhibitory activity. / At the time of the doctoral defense, the following papers were unpublished and had a status as follows: Paper 3: Manuscript. Paper 4: Manuscript. Paper 5: Manuscript. Paper 6: Manuscript.

Les composantes innée et acquise de l'immunité travaillent ensemble pour assurer une protection efficace de l'organisme. Les cellules dendritiques, cellules sentinelles de l’immunité capturent via des récepteurs de surface les agents pathogènes et les présentent aux lymphocytes T pour stimuler les réponses immunitaires adaptatives spécifiques. Une famille de ces récepteurs, nommée Récepteurs Lectines de type C (CLRs) ont un rôle important dans la reconnaissance de motifs oligosaccharides des pathogènes. Leurs fonctions sont parfois détournées par certains pathogènes à leur avantage et notamment le VIH. La reconnaissance du virus par DC-SIGN, une des CLRs, favorise la dissémination du virus. A l’inverse, la langerine, autre CLR, est considérée comme une barrière naturelle au VIH. Ainsi, DC-SIGN est devenue une cible thérapeutique prometteuse mais sa reconnaissance des ligands osidiques est largement partagée par la langerine.Ce travail vise à développer des antagonistes de DC-SIGN spécifiques et de hautes affinités permettant de rivaliser avec la présentation multivalente des glycosylations de gp120 du VIH avec DC-SIGN. Une approche rationnelle a été employée dans le développement de ligands glycomimétiques hautement sélectifs pour DC-SIGN à partir de l’étude du site de liaison des deux CLRs. Puis, des plates-formes de présentations de ces glycomimétiques, de valences et de géométries différentes, sont comparées par SPR. Les améliorations spectaculaires d'affinités parfois observées sont liées à différents mécanismes d’interactions multivalentes responsables d’un phénomène d’avidité.Sur une des architecture de présentation sélectionnée (RODs), un travail de caractérisation fine des mécanismes responsables de ce gain d’affinité et/ou d’avidité a été conduit par la combinaison de plusieurs techniques biophysiques (SPR, ITC, polarisation de fluorescence et AUC). L’influence de la topologie de cette structure sur les mécanismes d’interactions est ainsi mise en évidence. Par les travaux menés, plusieurs ligands multivalents ont montré des affinités sans précédent pour DC SIGN atteignant des affinités du nanomolaire et représentant les meilleurs inhibiteurs connus à ce jour.Associé au développement d’antagonistes multivalents, une CLR (DCIR) a été identifiée récemment comme impliquée dans la dissémination du VIH, comme DC¬SIGN. Dans une perspective future de développement de glycomimétique, des travaux ont été menés sur la caractérisation structurale et fonctionnelle de ce nouvel acteur dans la problématique VIH. / The innate and acquired immunity components work together to provide efficient protection of organisms. Dendritic cells, sentinel cells of the immunity, are able to capture pathogens through their receptors on the surface and they can present the antigens to lymphocytes T in order to stimulate specific adaptive immune responses. Among these receptors, there is a family named C-type lectin receptors (CLRs), which has an important role in the recognition of pathogenic oligosaccharide motifs. CLRs can be hijacked by many pathogens including HIV. DC-SIGN, one of the CLRs, interacts with the virus and promotes its dissemination. Unlike DC-SIGN, langerin, another CLR, has a protective role against the HIV infection. In this context, DC-SIGN became a promising therapeutic target but it shares ligand specificities with langerin.This work aims to develop highly specific antagonists against DC-SIGN in order to compete with the multivalent glycosylated gp120 protein of HIV. Using the study of the two lectins binding sites as starting point, a rational approach has been exploited to develop highly selective glycomimetics against DC SIGN. The SPR technique was used to investigate multivalent platforms with different valencies as well as ligand presentation in space. The amazing improvement of the affinity observed in some cases can be linked to different mechanisms of multivalent interactions, leading to an avidity phenomenon. On a selected scaffold (RODs), we characterized the different mechanisms responsible for the affinity and/or avidity gains, using a combination of different biophysical techniques (SPR, ITC, fluorescence polarization, AUC). In this work, we highlighted that the topology of this structure can influence the mechanisms of interactions. Overall, different multivalent ligands showed unique affinities for DC-SIGN, reaching the nanomolar affinity range, and they represent the best inhibitors to date.Finally, another CLR has been recently identified as one of the protein involved in the HIV infection as well as DC-SIGN. In a future perspective of glycomimetic development, structural and functional characterization has been done on this new actor involved in the HIV issue.

L’importance des oligosaccharides, et plus particulièrement des β-glucanes et des mannanes, dans les processus biologiques, confère à ces familles de biomolécules des propriétés riches et variées. Celles-ci permettent d’envisager des applications potentielles dans de nombreux domaines, et notamment dans le cas de problèmes de santé publique majeurs, tels que les maladies cardiovasculaires, le cancer ou encore les infections. Néanmoins, malgré les énormes avancées faites en glycochimie, la synthèse d’oligosaccharides à longue chaîne reste un défi synthétique important. La synthèse de glycomimétiques, proches structurellement des sucres naturels et accessibles via une chimie efficace, nous a semblé judicieuse. Inspirés du design des glycomimétiques existants, nous avons élaboré la synthèse de deux mimes du centre anomérique : le premier de type phosphonate et le second de type hydroxylamine.Le lien phosphonate a été choisi car il nous permet de garder un centre stéréogène sur la position anomérique, donnant ainsi la possibilité de créer les deux configurations α et β. Ceci nécessite cependant l’élaboration d’une synthèse stéréosélective. Le lien inter-résidus a donc été construit par couplage stéréosélectif entre une espèce phosphonite-borane diastéréopure et un alcool de type phostone, suivi d’une oxydation stéréospécifique de la fonction phosphonite-borane en phosphonate. Les phosphonite-boranes ont été obtenus en cinq étapes à partir du D-glucal (Schéma 2). L’étape clé de couplage passe par un mécanisme faisant intervenir deux activations successives de la fonction phosphorée apportant la réactivité nécessaire pour une attaque de l’alcool. Des stéréosélectivités variables ont été obtenues en fonction des conditions réactionnelles et du groupement protecteur en position 2 du substrat de départ. Cependant, seuls des alcools primaires peuvent être introduits. Trois dimères phostone-phostone possédant un lien (1→6) ont ainsi été obtenus. Le choix du lien hydroxylamine a été motivé par le fait que la barrière d’inversion de l’azote dans ce type de fonction est faible, ce qui implique que l’atome d’azote n’est pas stéréogène. Cette particularité permet d’éviter une synthèse stéréosélective du centre anomérique. De plus, les hydroxylamines étant peu basiques, elles ne seront pas protonées en milieu physiologique et pourraient donc être de bons mimes des glycanes naturels. Le lien inter-résidus a été construit via une double amination réductrice entre un dialdéhyde et une hydroxylamine portée par une pipéridine polyhydroxylée. Ces deux composés ont été obtenus par un processus diastéréo- et énantiosélectif à partir du cyclopentadiénylure de sodium. La combinaison de deux groupements protecteurs Boc sur l’hydroxylamine s’est révélée être la plus adéquate pour le bon déroulement de l’étape clé de double amination réductrice. Cette séquence implique deux étapes « one-pot » consistant en la formation d’une dioxime, qui subit dans un second temps une réduction, pour former l’hétérocycle. Ce processus de création du lien inter-résidus a pu être réitéré avec succès pour la synthèse d’un dimère / The importance of oligosaccharides in biological processes and particularly β-glucanes and mannanes, gives to these families of biomolecules numerous properties. These natural polymers may find potential applications in many areas, particularly in the case of major public health problems such as cardiovascular disease, cancer or infections.Despite many advances in this field, many challenges remain particularly pertaining to the assembly of higher oligosaccharides. The synthesis of glycomimetics, structurally close to natural sugars and accessible via an efficient chemistry could be an alternative. Inspired by the known glycomimetics, we have elaborated the synthesis of two new mimetics of the anomeric center: cyclic phosphonate (phostone) and hydroxylamine. The phosphonate linkage was chosen because it contains a stereogenic center on the anomeric position, with the possibility to create the two configurations α and β via a stereoselective synthesis. The linkage was built by a stereoselective coupling step between a diastereopure phosphonite-borane and a phostone-type alcohol, followed by a stereospecific oxidation of the phosphonite-borane function into phosphonate. The phosphonite-boranes were obtained in five steps from D-glucal (Scheme 2). The mechanism of the key coupling step involves two successive activations of the phosphorus function for the alcohol attack. Different stereoselectivities were obtained depending on the reaction conditions and the protecting group on the position 2. However, only primary alcohols can be introduced. Three phostone-phostone dimers possessing a (1→6) linkage were synthesized.The choice of the hydroxylamino linkage was motivated by the fact that the nitrogen barrier of inversion in this type of function is low, which means that the nitrogen is not stereogenic. This characteristic avoids a stereoselective synthesis of the anomeric center. Moreover, hydroxylamines being weakly basic, they won’t be protonated in physiological conditions and could be good mimetics of natural glycans. The linkage was built via a double reductive amination between a dialdehyde and a hydroxylamine carried by a polyhydroxylated piperidine. These two compounds were obtained by a diastereo- and enantioselective process from sodium cyclopentadienylide. The combinaison of two Boc protecting groups on the hydroxylamine proved to be the most appropriate for the key double reductive amination. This process consists in a « one-pot » two-steps sequence consisting in the formation of a dioxime, followed by its reduction to form the heterocycle. This process could be successfully reiterated for dimer and trimer synthesis

L’Héparane Sulfate (HS) est un polysaccharide linéaire hautement sulfaté largement présent à la surface des cellules ou dans la matrice extracellulaire des tissus animaux. L’HS est l'un des polymères les plus hétérogènes et présente une alternance de domaines fortement sulfatés (S) et faiblement sulfatés (A). L'exposition à la surface cellulaire de ces domaines SAS permet d'établir des interactions spécifiques avec des protéines basiques présentant des topologies de charges complémentaires, permettant la régulation de leurs activités biologiques. CXCL12, une protéine de la famille des chimiokines se liant aux chaînes d’HS, est l'unique ligand naturel du récepteur CXCR4. La signalisation CXCL12/CXCR4 est impliquée dans divers processus biologiques dont l'hématopoïèse, la réponse immunitaire et la migration des cellules cancéreuses et leur prolifération. La conception de glycoligands pouvant se lier spécifiquement à CXCL12 pourrait permettre de moduler son interaction avec son récepteur et donner accès à une substance thérapeutique innovante pour le traitement de plusieurs types de cancer. Nous avons ainsi imaginé la construction d’un ligand tridentate symétrique comportant une partie centrale de type fragment d’HS synthétique (dp4) dont les extrémités réductrice (ER) et non réductrice (ENR) seraient reliées à des ligands capables d'occuper une partie du site de liaison à CXCR4.Grâce à de précédents travaux sur l'IFN-γ, une cytokine se liant aux chaînes HS, notre laboratoire a déjà démontré que la préparation de mimes de SAS pouvait être obtenue en reliant deux fragments d’HS synthétiques (domaines S) par leur ER via des bras espaceurs de type PEG et de longueur différente pour mimer les domaines A. Afin d’adapter cette stratégie à la préparation de neutraligands de CXCL12 et d’une nouvelle génération de mimes de SAS, ce programme doctoral visait (i) à établir une stratégie générale de modification de l’ER et l’ENR de fragments d’HS, (ii) à établir des conditions efficaces de réactions de couplage pour (iii) synthétiser des ligands de CXCL12 ainsi que de nouveaux mimes de SAS. Nous avons sélectionné deux réactions orthogonales de couplage dans le panel de Chimie Click, à savoir la formation de triazole «CuAAC» et la «ligation oxime». Afin de déterminer la faisabilité de transformation des deux extrémités de fragments d’HS pour réaliser ces réactions de couplage, nous avons optimisé les conditions de ces modifications sur un disaccharide modèle dérivé du cellobiose. Tout d’abord, en utilisant la procédure de couplage thiol-ène décrite par notre équipe, nous avons introduit une amine sur l'ER de ce disaccharide et optimisé les conditions d’une séquence monotope transfert de diazo/CuAAC permettant la conversion sélective de cette amine en azoture puis son couplage avec des alcynes vrais. Cette séquence a également pu être appliquée à des acides aminés libres pour la préparation de dérivés organofluorés. Ensuite, l'installation d'un motif aldéhyde sur l’ENR du composé modèle a été obtenue par une séquence en trois étapes comportant une allylation décarboxylante de type Tsuji-Trost de la position O-4 de l'unité NR, une dihydroxylation de l’éther d’allyle obtenu et enfin une coupure oxydante du diol formé. En plus d'explorer la sélectivité de la coupure oxydante en faveur de diols vicinaux acycliques en présence de diols cycliques portés par le squelette saccharidique, nous avons également optimisé les conditions de la réaction de formation d’oximes pour obtenir une seconde procédure monotpe de coupure oxydante/formation d’oxime pour la modification rapide de l’ENR de fragments d’HS. Cette stratégie de fonctionnalisation sélective de l’ER et l’ENR d’oligosaccharides a été implémentée dans notre voie actuelle de synthèse de fragments d’HS : elle a été appliquée de manière représentative à un fragment tétrasaccharidique d’HS qui permettra la préparation de neutraligands de CXCL12 et de mimes de SAS. / Heparan sulfate (HS) is a class of linear and highly sulfated polysaccharides widely present in animal tissues, onto the cell surface or into the extracellular matrix. HS is one of the most heterogeneous polymers and presents an alternation of highly sulfated domains (S domains) and weakly sulfated one (A domains). Exposition of those SAS domains at the cell surface permits the establishment of specific interactions with proteins displaying complementary charge topologies, leading to the regulation of their biological activities.CXCL12, a HS-binding protein, member of the chemokine family of pro-inflammatory mediators, is the unique natural ligand of CXCR4 receptor. CXCL12/CXCR4 signaling is involved in several biological processes, including hematopoiesis, immune response and cancer metastasis. The design of HS type ligands that could bind specifically to CXCL12 to block or modulate its interaction with its receptor should give access to therapeutic substance being able to modulate its activity and allow treatment of several cancer types. To this aim, we planed to construct a symmetric tridentate ligand of CXCL12 in which the reducing end (RE) and non-reducing end (NRE) of a short synthetic HS fragment (dp4) would be connected to ligands able to occupy part of the CXCR4 binding site. Thanks to previous investigation onto IFN-γ, a cytokine that binds tightly to HS chains, our lab already demonstrated that the preparation of SAS mimics should be reached by connecting two synthetic HS fragments (S domains) by their RE through a PEG-type spacer differing in length to mimic internal A domain. To adapt this strategy to the preparation of CXCL12 neutraligands and new type of SAS mimics, this PhD program aimed (i) to establish a general strategy of modification of the HS fragments RE and NRE, (ii) to setup efficient conditions of ligation reactions for (iii) the preparation of CXCL12 neutraligands as well as a second generation of SAS mimics. We selected our two orthogonal ligation reactions into the Click Chemistry panel: “the CuAAC” triazole formation and the “oxime ligation”. In order to setup the practicability of this strategy of transformation of the two HS fragments ends, we optimized reaction conditions onto model disaccharide derived from cellobiose. On one hand, by using thiol-ene coupling procedure reported by our lab, we introduced an amino group to the RE of this disaccharide and optimized reactions conditions of a one-pot diazotransfer reaction/CuAAC sequence, allowing the selective conversion of this amino group into azide and its coupling with alkyne derivatives. To demonstrate the robustness of this sequence, we applied it to the direct modification of free amino acids for the preparation of organofluorine derivatives. On the other hand, the installation of an aldehyde motif onto the NRE of the model compound was obtained via a three steps sequence involving a Tsuji-Trost decarboxylative allylation of the position O-4 of the NRE unit, dihydroxylation of the resulting allyl ether and finally oxidative cleavage of the formed diol. Besides exploring the possibility of the selectivity of the oxidative cleavage in favor of vicinal acyclic diols without affecting cyclic diols of the disaccharide backbone, we also optimized the reaction conditions of oxime ligation to obtain a second one-pot procedure of oxidative cleavage/oxime ligation for the rapid modification of the NRE of HS fragments. This strategy of functionalization of the RE and NRE of oligosaccharides was implemented into our current synthetic pathway of preparation of HS fragments: a tetrasaccharidic HS fragment was representatively modified using this strategy for the synthesis of CXCL12 neutraligands and SAS mimics.

L’accumulation excessive de leucocytes conduisant à un dysfonctionnement de la réponse immunitaire est caractéristique de plusieurs maladies inflammatoires. La première étape du recrutement des leucocytes aux sites d’inflammation est tributaire de l’interaction entre le tétrasaccharide sialyl LewisX (sLeX) et les protéines d’adhésion sélectines P et E, qui sont exprimés sur les cellules endothéliales des parois vasculaires. Par conséquent, les sélectines sont des cibles thérapeutiques importantes. Ainsi, la conception d’antagonistes des sélectines est une stratégie prometteuse pour traiter l'inflammation aiguë. Par exemple, l’administration d’analogues du sLeX chez les patients hospitalisés souffrant de crises vaso-occlusives ou de syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) peut atténuer les enjeux d'accumulation de cellules immunitaires. Tout en se basant sur la première génération d'antagonistes des sélectines développées par notre laboratoire, l’objectif de ce travail était de synthétiser et d'évaluer l’activité biologique d’une nouvelle série d’analogues du sLeX ciblant l'inflammation aiguë. Ce travail établit deux nouvelles stratégies qui permettent d'accéder à des analogues du sLeX incorporant un motif galactopyranoside bicyclique avec une fonctionnalité carboxylate ayant une conformation restreinte. Dans la première approche, l’intermédiaire bicyclique clé est formé en 13 étapes à partir du D-galactose pentaacétate avec un rendement global de 19 %. Indépendamment de la stéréochimie des précurseurs, une réaction de cyclisation intramoléculaire a permis de générer l’intermédiaire clé avec le carboxylate en position axiale. Un contrôle cinétique Curtin-Hammett serait à l'origine de la stéréosélectivité, une hypothèse supportée par une étude expérimentale et par calculs théoriques DFT. La série des carboxylates équatoriales a également été préparée par une stratégie de désilylation basée sur la migration d'un ester β,γ-insaturé. La deuxième approche implique une stratégie de double glycosidation orthogonale qui est influencée par la conformation restreinte du bicycle. L'intermédiaire bicyclique, portant un groupement nitrile en C9 (alpha), a été préparé en 12 étapes avec un rendement global de 53 %. Cette approche a mené à une série d'antagonistes des sélectines incorporant des modifications d'amide, d'amine et de tétrazole, ainsi qu'un analogue incorporant un C6-benzamide. Cette approche modulaire peut être exploitée pour préparer d’autres isostères d'acide carboxylique. Un analogue hybride a été préparé en combinant le galactopyranoside bicyclique avec la fonctionnalisation de la chaîne latérale qui se retrouve sur l’espaceur à base de tartrate. Cette voie de synthèse a également été conçue afin d'accéder aux analogues du sLeX portant une sonde de photoaffinité. Cet analogue servira comme outil dans le marquage par photoaffinité des sélectines pour élucider les résidus clés du site actif. Les analogues de la deuxième génération ont été évalués pour leur capacité à se lier aux sélectines et d’empêcher les cellules immunitaires d’adhérer. Une méthode qualitative permettant de classer l’affinité de nos composés aux sélectines à l'aide de la spectroscopie SPR ainsi qu'une expérience préliminaire d'inhibition compétitive en solution ont été développées. Les principaux composés ont également été évalués à l'aide de tests in vitro d'adhésion de cellules HL-60 et de roulement par imagerie des cellules vivantes. Un essai de migration cellulaire par lavage péritonéal in vivo a été utilisé pour valider l’activité de nos composés principaux et leur capacité à inhiber le recrutement des neutrophiles dans un modèle d'inflammation aiguë. Nos résultats démontrent l’augmentation de la puissance et de l’activité de nos analogues de deuxième génération comparativement à la première. La série de galactopyranosides a démontré une spécificité pour l'inhibition de la P-sélectine, alors que la série des arabinopyranosides, incorporant un motif tétrazole, a démontré une activité remarquable vers la E-sélectine. La combinaison des deux modifications ont produit une activité pan-sélectines exceptionnelle qui justifie une enquête plus approfondie. / The first step for leukocyte adhesion and rolling along the vascular endothelium during the immune system inflammatory response involves the recognition of the tetrasaccharide sialyl LewisX (sLeX) by selectin glycoproteins. Dysfunction of the immune response, a consequence of several pathologies of inflammatory disease, leads to an excessive influx of leukocytes that necessitates therapeutic intervention. The development of glycomimetics, small molecule therapeutics that imitate complex glycans, is a promising strategy for treating inflammation. Specifically, a targeted approach amenable to severe acute inflammation, such as in hospitalized patients suffering from vaso-occlusive crises (VOC) or acute respiratory distress syndrome (ARDS). Building off the first generation of selectin antagonists developed by our laboratory, the aim of this work was to synthesize and evaluate the potency of a new class of sLeX glycomimetics for use as selectin antagonists targeting acute inflammation. This work describes the development of two novel strategies for sLeX glycomimetics incorporating a challenging trans-bicyclo[4.4.0] 3-O,4-C-fused galactopyranoside scaffold with a conformationally restricted carboxylate moiety. In the first approach, the key bicyclic galactopyranoside intermediate was accessed through a 13-step sequence with 19% overall yield from D-galactose pentaacetate. An unprecedented intramolecular cyclization reaction provided the desired axially configured bicyclic intermediate independent of the precursor stereochemistry. The origin of stereoselectivity was proposed to be under Curtin-Hammett kinetic control; a hypothesis supported by an experimental study and theoretical DFT calculations. The equatorial carboxylate series was also prepared using a desilylation strategy capitalizing on the migration of an β,γ-unsaturated ester. The second approach is highlighted by an orthogonal dual-glycosidation strategy that takes advantage of the conformationally restricted scaffold. The key bicyclic intermediate, bearing an α-configured C9 nitrile moiety, was prepared in 12 steps with a 53% overall yield. This approach led to a series of selectin antagonists incorporating axially-locked amide, amine, and tetrazole modifications at the C9 position, as well as an analogue incorporating a C6-benzamide. The modular galactopyranoside framework achieved using this approach can be exploited to prepare additional carboxylic acid bioisosteres for future SAR studies. A hybrid analogue was prepared, that combines the bicyclic galactopyranoside scaffold and a synthetic approach to selectin antagonists incorporating sidechain modifications to the first-generation tartrate diester. This synthetic route was also elaborated to access sLeX glycomimetics bearing a benzophenone-based photoaffinity probe. This analogue will serve as a valuable tool in the photoaffinity labeling of selectin proteins to elucidate key active site residues. The second-generation analogues were evaluated for their ability to inhibit selectin adhesion. A qualitative method to rank the binding strength towards recombinant P- and E-selectin proteins using SPR biosensor technology was developed, as well as a preliminary competitive inhibition in solution experiment with immobilized PSGL-1. Several compounds were also evaluated using an in vitro HL-60 cell adhesion assay, and a live-cell imaging experiment. An in vivo peritoneal lavage cellular migration assay was used to validate the potency of our lead compounds at inhibiting neutrophil recruitment in an acute inflammation model. Key results from the biological evaluations include an improvement in activity by restricting the conformation of the carboxylate moiety to the axial configuration, as well as an enhancement in potency over the lead compound from the first-generation series. Remarkably, specificity for P-selectin inhibition was observed with the galactopyranoside series, while the arabinopyranoside series, incorporating a tetrazole bioisostere, displayed significant activity towards E-selectin. The combination of the two modifications yielded remarkable pan-selectin activity that warrants further investigation.