Die zirkadiane Uhr ist ein endogenes Zeitmesssystem, das die Anpassung physiologischer Prozesse an die geophysikalische Zeit ermöglicht. Die zirkadiane Uhr besteht aus einem zentralen Schrittmacher und peripheren Uhren in jeder Zelle. Bei Säugern ist eine bestimmte Anzahl von Uhr-Genen in regulatorischen Schleifen miteinander verbunden, wodurch Oszillationen in der Expression der Uhr-Gene sowie in zahlreichen Zielgenen erzeugt werden. Zielgene der zirkadianen Uhr sind unter anderem an zellulären Prozessen beteiligt, die eine Rolle bei der Tumorentstehung und -progression spielen. Funktionsstörungen der zirkadianen Uhr stehen im Zusammenhang mit verschiedenen Krankheitsbildern, unter anderem Krebs. Ziel dieses Projekts war es, die Rolle der zirkadianen Uhr bei der Tumorentstehung und entwicklung zu untersuchen. Der Fokus lag dabei auf tumorspezifischen Stoffwechselwegen. Die Rolle einer deregulierten zirkadianen Uhr wurde in einem in vitro Zellmodel untersucht. Die SW480 Zelllinie wurde aus einem Primärtumor isoliert und die SW620 Zelllinie aus einer Lymphknotenmetastase desselben Patienten. Die untersuchten Zelllinien zeigten deutliche Unterschiede in Bezug auf ihre Uhr Phänotypen mit globalen Konsequenzen auf oszillierende Gene und Stoffwechselwege. Die Runterregulation des Uhrgens Bmal1 führte in SW480 Zellen zu einem metastatischen Phänotyp, der stark dem von SW620 Wildtypzellen ähnelte. Darüber hinaus führte die Runterregulation von Bmal1 zu einer Veränderung des metabolischen Phänotyps und zu einer modifizierten Antwort auf die Behandlung mit einem Glykolyseinhibitor. Die in diesem Projekt erzielten Ergebnisse unterstützen die postulierte Rolle von Bmal1 als Tumorsuppressor und verdeutlichen das reziproke Wechselspiel zwischen der zirkadianen Uhr und dem Stoffwechsel von Krebszellen und zeigen mögliche Auswirkungen einer deregulierten Uhr auf den Zellmetabolismus während der Tumorentwicklung. / The circadian clock is an internal timing system that allows the entrainment of physiological and behavioural processes to the geophysical time with a periodicity of about 24 hours. It consists of a central pacemaker and peripheral clocks in every cell. In mammals, a distinct set of genes is interconnected in regulatory feedback loops, thereby generating oscillations in gene expression in the core-clock itself as well as in many target genes. Clock target genes are, among others, involved in cellular processes connected to tumour development and progression, including metabolic pathways, drug response pathways and the cell cycle. Malfunctions of the circadian clock are associated with different pathologies including cancer. The aim of this project was to study the role of the circadian clock in tumour development and progression with a focus on cancer metabolism and treatment response. The role of a deregulated clock was investigated in SW480 cells derived from a primary tumour and SW620 cells derived from a lymph node metastasis of the same patient. The investigated cell lines showed clear differences with respect to their clock phenotypes with consequences on global oscillating gene expression and alterations in metabolic pathways. A knockdown of the core-clock gene Bmal1 in SW480 cells induced a metastatic phenotype similar to SW620 wild type cells, as indicated by faster proliferation, lower apoptosis rate and a highly energetic metabolic phenotype. Furthermore, Bmal1-KD induced metabolic phenotype rewiring as seen by altered glycolytic activity and mitochondrial respiration and modified treatment response to metabolism-targeting anticancer treatment. The results obtained in this project reinforce the postulated role of Bmal1 as a tumour suppressor and elucidate a reciprocal interplay between the circadian clock and cancer metabolism with implications in metabolic phenotype rewiring during tumour progression.

The energy metabolism of most tumor cells relies on aerobic glycolysis (Warburg effect) characterized by an increased glycolytic flux that is accompanied by the increased formation of the cytotoxic metabolite methylglyoxal (MGO). Consequently, the rate of detoxification of this reactive glycolytic byproduct needs to be increased in order to prevent deleterious effects to the cells. This is brought about by an increased expression of glyoxalase 1 (GLO1) that is the rate-limiting enzyme of the MGO-detoxifying glyoxalase system. Here, we overexpressed GLO1 in HEK 293 cells and silenced it in MCF-7 cells using shRNA. Tumor-related properties of wild type and transformed cells were compared and key glycolytic enzyme activities assessed. Furthermore, the cells were subjected to hypoxic conditions to analyze the impact on cell proliferation and enzyme activities. Our results demonstrate that knockdown of GLO1 in the cancer cells significantly reduced tumor-associated properties such as migration and proliferation, whereas no functional alterations where found by overexpression of GLO1 in HEK 293 cells. In contrast, hypoxia caused inhibition of cell growth of all cells except of those overexpressing GLO1. Altogether, we conclude that GLO1 on one hand is crucial to maintaining tumor characteristics of malignant cells, and, on the other hand, supports malignant transformation of cells in a hypoxic environment when overexpressed.

Mycoplasma pneumoniae ist ein parasitär lebendes Bakterium, das eine atypische Pneumonie beim Menschen verursacht. Aufgrund seiner geringen Genomgröße besitzt dieser Organismus einen eingeschränkten Metabolismus sowie eine limitierte Zahl an Pathogenitätsfaktoren. Dennoch ist dieser Mikroorganismus perfekt an seinen Wirt angepasst und es war zu vermuten, dass neben dem komplexen Adhäsionsapparat von M. pneumoniae auch glykolytische Enzyme eine Rolle bei der Interaktion mit humanen Zellen spielen. Diese Enzyme sind maßgeblich bei intrazellulär ablaufenden Stoffwechselprozessen beteiligt. Es wurde jedoch bereits bei anderen Bakterien gezeigt, dass glykolytische Enzyme ebenfalls auf der Bakterienoberfläche zu finden sind und dort mit Komponenten der extrazellulären Matrix des Wirtes interagieren können. Dieser Vorgang trägt offensichtlich zur erfolgreichen Kolonisation des Wirtes bei. Ziel dieser Arbeit war es, alle glykolytischen Enzyme von M. pneumoniae hinsichtlich ihrer Lokalisierung zu beschreiben und Teilaspekte ihrer Funktion in der Interaktion mit Wirtskomponenten zu analysieren. Die glykolytischen Enzyme wurden rekombinant produziert und für die Herstellung von monospezifischen polyklonalen Antikörpern verwendet. Die Lokalisation der Enzyme wurde durch Nachweis in der Membran- und Zytosolfraktion des M. pneumoniae Gesamtantigens untersucht. Mittels Immunfluoreszenz, Colony Blot und Protease-Verdau intakter Bakterienzellen wurde bestätigt, dass acht (Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, Lactatdehydrogenase, Transketolase, Pyruvatdehydrogenase, Phosphoglyceratmutase und Pyruvatdehydrogenase Untereinheiten A-C) der 19 glykolytischen Enzyme mit der Bakterienoberfläche assoziiert vorkommen. Die Untersuchung von Mutanten ergab, dass die Lokalisation der Enzyme nicht an das Vorkommen der für die Anheftung der Bakterien an Zielstrukturen wesentlichen Adhäsine wie die Proteine P1, P40 und P90 sowie das Oberflächenprotein P01, gekoppelt ist. Jedoch sind sowohl intakte Zellen von M. pneumoniae als auch die oberflächenlokalisierten glykolytischen Enzyme in der Lage, an verschiedene humane Zellen zu binden. Eine Analyse der nachweisbaren Proteine auf der Oberfläche der Zellen führte zur Auswahl von sechs humanen Proteinen für weiterführende Studien: Plasminogen, Vitronektin, Fibronektin, Fibrinogen, Laminin und Laktoferrin. Mittels ELISA wurde eine konzentrationsabhängige Bindung der oberflächenassoziierten Enzyme von M. pneumoniae mit Wirtsproteinen festgestellt, die hinsichtlich der Intensität jedoch Unterschiede aufwies. So konnten ausgeprägte Interaktionen aller Enzyme mit humanem Plasminogen und Vitronektin nachgewiesen werden. Die Bindung von Fibronektin und Laktoferrin ist dagegen nur für einen Teil der glykolytischen Enzyme zu bestätigen. Die Untersuchung verschiedener Einflussfaktoren ergab, dass alle Bindungen zwischen glykolytischen Enzymen und humanen Proteinen spezifisch durch die entsprechenden Antiseren gehemmt werden und dass der Großteil der Interaktionen ionischen Wechselwirkungen unterliegt. Die Bindung zu Plasminogen basiert überwiegend auf Lysin-Resten. Untersuchungen, ob sich die glykolytischen Enzyme gegenseitig in der Bindung zu Wirtsfaktoren beeinflussen, ergab ein komplexes Muster, das hinsichtlich Plasminogen, Fibronektin und Laminin für eine Überlagerung der für die Interaktion maßgeblichen Proteinbereiche spricht. Die Untersuchung einer möglichen Aktivierung von inaktivem Plasminogen zu proteolytisch aktivem Plasmin ergab, dass in Gegenwart aller oberflächenlokalisierten glykolytischen Enzyme von M. pneumoniae Plasmin gebildet wird. Es wurden jedoch Unterschiede im Aktivierungspotenzial nachgewiesen. Die Pyruvatdehydrogenase Untereinheit B zeigte die höchste, die Pyruvatdehydrogenase Untereinheit C die geringste Plasminproduktion. Die Verwendung des gewebespezifischen Plasminogenaktivators führte zu einer höheren Aktivierung als der Urokinase-Typ Plasminogenaktivator. Die Variabilität der Plasminproduktion kann mit der unterschiedlichen Bindungsaffinität der glykolytischen Enzyme zu Plasminogen begründet werden. So besitzt die Pyruvatdehydrogenase Untereinheit B im Vergleich mit der Pyruvatdehydrogenase Untereinheit C ein höheres Bindepotenzial, das sich in der gemessenen Aktivierung widerspiegelt. Die Bildung von Plasmin kann zum Abbau verschiedener extrazellulärer Matrix-Proteine führen. Diese Prozesse sind physiologisch, z. B. in der Fibrinolyse, von Bedeutung. Während in Gegenwart der glykolytischen Enzyme die humanen Proteine Laktoferrin, Laminin und Fibronektin nicht abgebaut wurde, konnte Fibrinogen in Gegenwart der Pyruvatdehydrogenase Untereinheit B bzw. der Phosphoglyceratmutase und Vitronektin durch alle glykolytischen Enzyme (bis auf die Pyruvatdehydrogenase Untereinheit C) degradiert werden. Mit der erstmals durchgeführten Analyse aller glykolytischen Enzyme eines Mikroorganismus hinsichtlich ihrer Lokalisation und der Bindung zu Komponenten der humanen extrazellulären Matrix wurde ein komplexes Netzwerk an Wirt-Erreger-Interaktionen nachgewiesen.

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Die zunehmende Ausbreitung des Usutu-Virus in Europa als Ursache für fatale Ausbruchsgeschehen innerhalb der Avifauna, insbesondere unter Sperlingsvögeln (Passeriformes) und Eulenartigen (Strigiformes), stellt in Zusammenhang mit einem neuroinvasiven sowie zoonotischen Potential ein Risiko für die Veterinär- sowie Humanmedizin dar. Trotz dieser Relevanz stehen derzeit keine zugelassenen Therapeutika gegen eine Usutu-Virus-Infektion zur Verfügung. Auf Basis indikationsfremder Substanzen mit pharmakologischer Zulassung im Sinne des drug repositioning sowie auf Grundlage der Gegenregulation viral-induzierter Modulationen des Zellmetabolismus wurde die Identifikation antiviraler Therapieoptionen gegen das Usutu-Virus in vitro angestrebt.:Abkürzungsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis 1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Das Usutu-Virus 2.1.1 Ursprung, Klassifikation und Epidemiologie 2.1.1 Transmissionszyklus und Wirtstropismus 2.1.2 Aufbau des Virions und des Genoms 2.1.3 Veterinärmedizinische Relevanz und pathologische Ausprägung 2.1.4 Humanmedizinische Bedeutung als Zoonose-Erreger 2.1.5 Vergleichende Aspekte zum West-Nil-Virus 2.2 Antivirale Präventions- und Therapieoptionen 2.2.1 Möglichkeiten und Grenzen der Immunprophylaxe 2.2.2 Pharmaka mit potentiell antiviraler Wirkung gegen Flaviviren 2.2.3 Identifizierte Substanzen gegen das Usutu-Virus 2.3 Zelluläre Systeme als antivirale Zielobjekte 2.3.1 Das Interferon-System und seine antivirale Schutzfunktion 2.3.2 Viral-induzierte Modulation des Wirtszellmetabolismus 3 Zielstellungen der Dissertation 4 Material 4.1 Zelllinien 4.2 Viruslinien 4.3 Zellkulturmedien 4.4 Pharmakologische und andere Substanzen 4.5 Chemikalien 4.6 Lösungen und Puffer 4.7 Antikörper 4.8 Reagenzien und Kit-Systeme 4.9 Enzyme und Nukleotide 4.10 Primer 4.11 Verbrauchsmaterialen 4.12 Geräte 4.13 Datenbanken und Software 5 Methodik 5.1 Zellkultivierungstechnik und PBMC-Isolation 5.2 Isolation von Usutu-Virus-Linien aus Gewebeproben in Zellkultur 5.2.1 Aufbereitung aviären Organmaterials 5.2.2 Typisierung von in Deutschland zirkulierenden Usutu-Virus-Linien (2019, 2020) 5.2.3 Virusanzucht in verschiedenen Zellkulturen zur Virusstock-Generierung 5.3 Quantifizierung des extrazellulären Virustiters 5.4 Immunfluoreszenzanalyse 5.5 Präparation pharmakologischer und anderer Substanzen 5.6 Infektionsansätze mit dem Usutu-Virus und WNV 5.7 Durchflusszytometrische Analyse 5.8 Zytotoxizitätsstudien 5.9 Extrazelluläre Fluxanalyse mittels Agilent Seahorse XF-Technologie 5.10 Statistische Analyse 6 Ergebnisse 6.1 Isolation des Usutu-Virus in Zellkultur 6.2 Replikationsdynamik des Usutu-Virus in verschiedenen Zelllinien 6.3 Pharmakologisches Screening zur antiviralen Wirksamkeit gegen das Usutu-Virus 6.4 Identifikation und Charakterisierung der antiviralen Eigenschaften von Ivermectin 6.5 Wirkung von Ivermectin gegen Linie 2 des West-Nil-Virus in einer aviären Zelllinie 6.6 Metabolischer Phänotyp Usutu-Virus-infizierter Zelllinien 6.7 Antivirale Inhibition der Glykolyse durch 2-Deoxy-D-Glukose 6.8 Einfluss von exogenem Interferon auf den Wirtszellmetabolismus unter Infektion 6.9 Auswirkung der Interferon-Rezeptor-Defizienz auf den Metabolismus unter Infektion 7 Diskussion 7.1 Typisierung und Isolation des Usutu-Virus in Zellkultur 7.2 Charakterisierung der zelltypspezifischen Permissivität und Replikationskinetik 7.3 Identifikation antiviral wirksamer Substanzen gegen das Usutu-Virus 7.4 Usutu-Virus-induzierte Modulation des Metabolismus als antiviraler Ansatz 8 Ausblick 9 Zusammenfassung 10 Summary 11 Literaturverzeichnis 12 Anhang 12.1 Zusatzmaterial 12.2 Publikation 1 12.3 Publikation 2 12.4 Publikation 3 12.5 Weitere Veröffentlichungen 13 Danksagung / The emerge of Usutu virus (USUV) in Europe as a causative agent of fatal outbreaks in avifauna, notably in Passeriformes and Strigiformes, as well as its neuroinvasive and zoonotic potential emphasize a considerable risk in veterinary and human medicine. Despite its relevance, recently, no approved drugs against USUV infections are available. The identification of antiviral therapeutic options against USUV in vitro was addressed based on the analysis of approved drugs of other medical indications in terms of drug repositioning and the counteraction of viral-induced alterations of the cellular metabolism.:Abkürzungsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis 1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Das Usutu-Virus 2.1.1 Ursprung, Klassifikation und Epidemiologie 2.1.1 Transmissionszyklus und Wirtstropismus 2.1.2 Aufbau des Virions und des Genoms 2.1.3 Veterinärmedizinische Relevanz und pathologische Ausprägung 2.1.4 Humanmedizinische Bedeutung als Zoonose-Erreger 2.1.5 Vergleichende Aspekte zum West-Nil-Virus 2.2 Antivirale Präventions- und Therapieoptionen 2.2.1 Möglichkeiten und Grenzen der Immunprophylaxe 2.2.2 Pharmaka mit potentiell antiviraler Wirkung gegen Flaviviren 2.2.3 Identifizierte Substanzen gegen das Usutu-Virus 2.3 Zelluläre Systeme als antivirale Zielobjekte 2.3.1 Das Interferon-System und seine antivirale Schutzfunktion 2.3.2 Viral-induzierte Modulation des Wirtszellmetabolismus 3 Zielstellungen der Dissertation 4 Material 4.1 Zelllinien 4.2 Viruslinien 4.3 Zellkulturmedien 4.4 Pharmakologische und andere Substanzen 4.5 Chemikalien 4.6 Lösungen und Puffer 4.7 Antikörper 4.8 Reagenzien und Kit-Systeme 4.9 Enzyme und Nukleotide 4.10 Primer 4.11 Verbrauchsmaterialen 4.12 Geräte 4.13 Datenbanken und Software 5 Methodik 5.1 Zellkultivierungstechnik und PBMC-Isolation 5.2 Isolation von Usutu-Virus-Linien aus Gewebeproben in Zellkultur 5.2.1 Aufbereitung aviären Organmaterials 5.2.2 Typisierung von in Deutschland zirkulierenden Usutu-Virus-Linien (2019, 2020) 5.2.3 Virusanzucht in verschiedenen Zellkulturen zur Virusstock-Generierung 5.3 Quantifizierung des extrazellulären Virustiters 5.4 Immunfluoreszenzanalyse 5.5 Präparation pharmakologischer und anderer Substanzen 5.6 Infektionsansätze mit dem Usutu-Virus und WNV 5.7 Durchflusszytometrische Analyse 5.8 Zytotoxizitätsstudien 5.9 Extrazelluläre Fluxanalyse mittels Agilent Seahorse XF-Technologie 5.10 Statistische Analyse 6 Ergebnisse 6.1 Isolation des Usutu-Virus in Zellkultur 6.2 Replikationsdynamik des Usutu-Virus in verschiedenen Zelllinien 6.3 Pharmakologisches Screening zur antiviralen Wirksamkeit gegen das Usutu-Virus 6.4 Identifikation und Charakterisierung der antiviralen Eigenschaften von Ivermectin 6.5 Wirkung von Ivermectin gegen Linie 2 des West-Nil-Virus in einer aviären Zelllinie 6.6 Metabolischer Phänotyp Usutu-Virus-infizierter Zelllinien 6.7 Antivirale Inhibition der Glykolyse durch 2-Deoxy-D-Glukose 6.8 Einfluss von exogenem Interferon auf den Wirtszellmetabolismus unter Infektion 6.9 Auswirkung der Interferon-Rezeptor-Defizienz auf den Metabolismus unter Infektion 7 Diskussion 7.1 Typisierung und Isolation des Usutu-Virus in Zellkultur 7.2 Charakterisierung der zelltypspezifischen Permissivität und Replikationskinetik 7.3 Identifikation antiviral wirksamer Substanzen gegen das Usutu-Virus 7.4 Usutu-Virus-induzierte Modulation des Metabolismus als antiviraler Ansatz 8 Ausblick 9 Zusammenfassung 10 Summary 11 Literaturverzeichnis 12 Anhang 12.1 Zusatzmaterial 12.2 Publikation 1 12.3 Publikation 2 12.4 Publikation 3 12.5 Weitere Veröffentlichungen 13 Danksagung