Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / El uso de micropartículas de polímeros naturales ha sido descrito como una innovadora técnica de formulación de adyuvantes para diversas vacunas. En este estudio se prepararon micropartículas de quitosano (MPQ) y de carragenina (MPC) como también de diferentes proporciones volumétricas (1:1; 1:3; 3:1) usando soluciones de quitosano de 0.1 a 1% (p/v) y carragenina al 0.83% (p/v), respectivamente, las cuales se utilizaron como adyuvantes en forma de micropartículas para una vacuna peptídica contra la hormona liberadora de gonadotrofinas (GnRH-I). Las micropartículas de quitosano y carragenina (MPQC) fueron obtenidas mediante una técnica combinada de coacervación compleja, usando agitación mecánica y ultrasonicación y la técnica de secado por atomización. Lográndose un método optimizado de formación de micropartículas. Se determinó el porcentaje de rendimiento (R) de las micropartículas y se caracterizaron las propiedades de tamaño, morfología y potencial zeta. Adicionalmente, se evaluaron los parámetros de eficiencia de encapsulación (EE), capacidad de carga (CC) en estudios in vitro de encapsulación. Así mismo se estudió la cinética de liberación in vitro de las proteínas de albúmina sérica de bovino (BSA) y de un análogo de la hormona liberadora de gonadotrofinas (GnRH G/Q) en solución de buffer fosfato de pH 7.4 a 37 ºC. Las micropartículas MPQC obtenidas por la técnica de ultrasonicación fueron elegidas para el presente estudio. El análisis morfológico mediante microscopia SEM de las MP mostró diversas morfologías y tamaños, siendo las MPQC (3:1) de forma elíptica, bordes definidos, superficie lisa, las características más constantes, cuyos tamaños fluctuaron entre 4 a 7 μm. Los resultados de Z potencial confirmaron la carga neta positiva del quitosano con valores promedios para las MPQ de +47,91 mV y de -52,86 mV para la carga negativa de carragenina. Los valores de Z potencial de las micropartículas MPQC fueron +49,89, + 27,88 y -41,79 para las relaciones de 3:1, 1:1 y 1:3. Los tamaños obtenidos por el analizador de tamaño de partículas fluctúo entre 1495,9 nm y 13302,6 nm, siendo mayor para las MPQC. El valor de R mayor fue de las MPQ. Los valores de EE y CC fue mayor en MP compuestas por complejos poliiónicos cargadas con GnRH G/Q. La cinética de liberación in vitro presentó dos picos de liberación a los 7 y 14 días aprox. de estudio. En conclusión, fue posible la obtención de MP en base a quitosano-carragenina con diferentes formas, tamaños y potencial zeta. A su vez las MP compuestas por complejos poliiónicos presentaron valores elevados de EE y CC, como también una sostenida y prolongada cinética de liberación in vitro, concluyéndose que esta formulación de complejos poliiónicos podría utilizarse como una nueva opción de adyuvante para la vacuna peptídica contra GnRH-I / Proyecto FONDEF D08I1085

A Gonadotrofina Coriônica Eqüina (eCG) é produzida pela égua prenhe e tem ação folículo estimulante e luteinizante em animais domésticos não eqüídeos. Um pool formado por plasma de 4 éguas prenhes, com média de 69 dias de gestação, foi purificado em coluna cromatográfica com resina de afinidade Blue Sepharose FF (BS). As frações que adsorveram à resina BS foram purificadas em coluna cromatográfica com resina de afinidade Concanavalina A 4B (ConA). As frações que não adsorveram à resina BS também foram purificadas em coluna cromatográfica com resina de afinidade ConA. O mesmo pool de palsma foi diafiltrado, em cartucho de hemodiálise. O diafiltrado foi aplicado em coluna cromatográfica com resina de afinidade ConA. Atividade biológica (UI/mL) do plasma, do diafiltrado e das frações purificadas foram quantificadas por ensaio biológico com ratas impúbres. As atividades biológicas encontradas no plasma e no plasma diafiltrado foram de 3,63 e 5,14UI/mL, respectivamente. A atividade biológica encontrada nas frações que adsorveram à BS foi de 3,50UI/mL. Não foi encontrarda atividade biológica nas frações que não adsorveram à BS. A atividade biológica contida nas frações que adsorveram à BS e que também adsorveram a ConA foi de 3,65UI/mL. O rendimento do processo cromatográfico onde o plasma foi adsorvido pela BS e pela ConA, foi de 69,52%. Não foi encontrada atividade biológica nas frações obtidas da aplicação do plasma diafiltrado em coluna de ConA. O processo cromatográfico com uso de BS seguido de ConA mostou-se eficaz em purificar a eCG do plasma de éguas prenhes. / The equine Chorionic Gonadotrophin (eCG) is produced by the pregnant mare and has follicle-stimulant and luteinizing actions on non-equine domestic animals. A pool formed by the plasma of 4 pregnant mares (with mean gestation of 69 days) was purified in chromatographic column with Blue-Sepharose FF affinity resin (BS resin). Fractions adsorbed by BS resin were then purified in chromatographic column with Concavalin A 4B affinity resin (ConA resin). The fractions not adsorbed by the BS resin were also purified in chromatographic column with ConA resin. The same plasma pool was dialyzed in hemodialysis cartridge. The dialyzed was applied in chromatographic column with ConA resin. Biological activities (in IU/mL) of the plasma, of the dialyzed and of the purified fractions were quantified in a biological assay with female rats that did not reach puberty. The biological activities found in the plasma and dialyzed were of 3.63 and 5.14 IU/mL, respectively. Fractions that were adsorbed by BS had a biological activity of 3.50 IU/mL. No biological activity was found in fractions that were not adsorbed by BS. Biological activity found in fractions adsorbed by both BS and ConA was of 3.65 IU/mL. When plasma was both adsorbed by BS and ConA, the chromatographic process yield had results of 69.52%. No biological activity was found in the fractions obtained from the administration of dialyzed plasma in ConA column. The BS - followed by ConA -chromatographic process showed efficacy in purifying the eCG from the plasma of pregnant mares.

A Gonadotrofina Coriônica Eqüina (eCG) é produzida pela égua prenhe e tem ação folículo estimulante e luteinizante em animais domésticos não eqüídeos. Um pool formado por plasma de 4 éguas prenhes, com média de 69 dias de gestação, foi purificado em coluna cromatográfica com resina de afinidade Blue Sepharose FF (BS). As frações que adsorveram à resina BS foram purificadas em coluna cromatográfica com resina de afinidade Concanavalina A 4B (ConA). As frações que não adsorveram à resina BS também foram purificadas em coluna cromatográfica com resina de afinidade ConA. O mesmo pool de palsma foi diafiltrado, em cartucho de hemodiálise. O diafiltrado foi aplicado em coluna cromatográfica com resina de afinidade ConA. Atividade biológica (UI/mL) do plasma, do diafiltrado e das frações purificadas foram quantificadas por ensaio biológico com ratas impúbres. As atividades biológicas encontradas no plasma e no plasma diafiltrado foram de 3,63 e 5,14UI/mL, respectivamente. A atividade biológica encontrada nas frações que adsorveram à BS foi de 3,50UI/mL. Não foi encontrarda atividade biológica nas frações que não adsorveram à BS. A atividade biológica contida nas frações que adsorveram à BS e que também adsorveram a ConA foi de 3,65UI/mL. O rendimento do processo cromatográfico onde o plasma foi adsorvido pela BS e pela ConA, foi de 69,52%. Não foi encontrada atividade biológica nas frações obtidas da aplicação do plasma diafiltrado em coluna de ConA. O processo cromatográfico com uso de BS seguido de ConA mostou-se eficaz em purificar a eCG do plasma de éguas prenhes. / The equine Chorionic Gonadotrophin (eCG) is produced by the pregnant mare and has follicle-stimulant and luteinizing actions on non-equine domestic animals. A pool formed by the plasma of 4 pregnant mares (with mean gestation of 69 days) was purified in chromatographic column with Blue-Sepharose FF affinity resin (BS resin). Fractions adsorbed by BS resin were then purified in chromatographic column with Concavalin A 4B affinity resin (ConA resin). The fractions not adsorbed by the BS resin were also purified in chromatographic column with ConA resin. The same plasma pool was dialyzed in hemodialysis cartridge. The dialyzed was applied in chromatographic column with ConA resin. Biological activities (in IU/mL) of the plasma, of the dialyzed and of the purified fractions were quantified in a biological assay with female rats that did not reach puberty. The biological activities found in the plasma and dialyzed were of 3.63 and 5.14 IU/mL, respectively. Fractions that were adsorbed by BS had a biological activity of 3.50 IU/mL. No biological activity was found in fractions that were not adsorbed by BS. Biological activity found in fractions adsorbed by both BS and ConA was of 3.65 IU/mL. When plasma was both adsorbed by BS and ConA, the chromatographic process yield had results of 69.52%. No biological activity was found in the fractions obtained from the administration of dialyzed plasma in ConA column. The BS - followed by ConA -chromatographic process showed efficacy in purifying the eCG from the plasma of pregnant mares.

Dois experimentos foram realizados com o objetivo de verificar o efeito de diferentes doses de eCG, após tratamento com progestágeno e estrógeno, sobre a fertilidade de vacas de corte. No experimento 1 foram utilizadas 133 vacas tipo Braford (½ Nelore x ½ Hereford), multíparas, 150 a 155 dias pós-parto, com idades entre 4 e 6 anos e escore de condição corporal (ECC) médio de 3 (escala de 1-5). Todos os animais foram submetidos a colocação de implante auricular subcutâneo (dia 0) contendo 3 mg de norgestomet (N) e aplicação de solução injetável intramuscular (im) de 3 mg de N e 5 mg de valerato de estradiol (VE). No momento da retirada do implante (dia 10), as vacas foram separadas, aleatoriamente, em 4 grupos distintos: Grupo I (n=33): não recebeu eCG; Grupo II (n=34): 300 UI de eCG; Grupo III: 500 UI de eCG e Grupo IV: 700 UI de eCG. As inseminações artificiais (IAs) foram realizadas em tempo fixo, de 52-54 hs após a retirada do implante, com sêmen de qualidade comprovada através de avaliação prévia. Após 15 dias, as fêmeas permaneceram com touros por 45 dias afim de serem submetidas a monta natural (MN) caso retornassem ao estro. Aos 40 e 100 dias após a IA foi realizado, mediante palpação retal, o diagnóstico de gestação para identificação dos animais que conceberam por IA ou MN respectivamente. As taxas de prenhez da IA foram: Grupo I: 33.3% (11/33); Grupo II: 50,0%(17/34); Grupo III: 39,4% (13/33); Grupo IV: 45,5% (15/33). Para a análise estatística das variáveis foi utilizado o teste Qui-Quadrado. As taxas de prenhez não foram diferentes estatisticamente (p=0,539) em relação a dose de eCG utilizada. As taxas de prenhez totais, após a temporada de MN, foram: Grupo I: 78,8% (26/33); Grupo II: 79,4% (27/34); Grupo III: 90,9% (30/33); Grupo IV: 75,8% (25/33). Também não houve diferença estatística (p=0,411) entre os grupos. No Experimento 2, foram utilizadas 56 vacas ( 27 Nelore x Charolês e 26 Braford), multíparas, não lactantes, cíclicas, com idades variando entre 4 e 7 anos e ECC médio de 3,5. As fêmeas receberam aplicação de implante auricular subcutâneo de 3 mg N e aplicação injetável (im) de 3 mg de N e 5 mg de VE no momento da colocação do implante (dia 0). No momento da retirada do implante (dia 10) os animais foram divididos em 3 grupos com a finalidade de receber aplicação injetável (im) de eCG: Grupo I (n=18): 500 UI eCG; Grupo II (n=19): 1.000 UI eCG e Grupo III (n=19): 1.200 UI eCG. A partir do dia seguinte à retirada do implante e aplicação de eCG, os animais tiveram o estro controlado, duas vezes ao dia em intervalos de 12 hs. As IAs foram realizadas 12 hs após a identificação do estro. Nos animais em que o estro não foi identificado, realizou-se IA em tempo fixo de 52-54 hs após a retirada do implante. O diagnóstico de gestação foi realizado mediante palpação retal aos 45 dias após a IA. Os animais diagnosticados prenhes foram acompanhados durante o período de parição com o propósito de avaliar o número de produtos nascidos, já que foram utilizadas altas doses de eCG que poderiam originar nascimentos múltiplos. Através do Qui-Quadrado, primeiramente analisou-se a presença dos sinais de estro em relação a dose de eCG utilizada a cada grupo. No intervalo de 36 a 48 hs após a retirada do implante, 87,5% do animais apresentaram estro. Não houve diferença significativa (p=0,866) entre os grupos, indicando ausência de relação entre estro e dose de eCG utilizada. As taxas de prenhez obtidas em cada grupo também não resultaram diferentes (p=0,25) em função da dosagem de eCG utilizada. Grupo I: 44,4% (8/18); Grupo II: 36,8% (7/19), Grupo III: 63,2% (12/19). Os índices de prenhez dos animais que não demonstraram sinais de estro e que foram inseminados em tempo fixo, foram analisados mediante Regressão Logística e não diferiram (p=0,666) daqueles que foram inseminados 12 hs após a detecção do estro. Não foram observados partos gemelares e distocia nas vacas dos diferentes grupos experimentais. Nas condições de realização destes experimentos, o uso de eCG, ao final do tratamento com progestágenos e estrógenos, não interferiu nos resultados de prenhez em vacas não-lactantes ou lactantes, inseminadas 12 hs após o estro ou em tempo fixo, não demonstrou efeito sobre o aparecimento de estro em vacas solteiras e, nas doses utilizadas, não originou partos gemelares. A IA de vacas não-lactantes realizada em tempo fixo de 52-54 hs após o tratamento apresentou resultados de prenhez semelhantes aos observados nas IAs realizadas 12 após a identificação do estro.

Dois experimentos foram realizados com o objetivo de verificar o efeito de diferentes doses de eCG, após tratamento com progestágeno e estrógeno, sobre a fertilidade de vacas de corte. No experimento 1 foram utilizadas 133 vacas tipo Braford (½ Nelore x ½ Hereford), multíparas, 150 a 155 dias pós-parto, com idades entre 4 e 6 anos e escore de condição corporal (ECC) médio de 3 (escala de 1-5). Todos os animais foram submetidos a colocação de implante auricular subcutâneo (dia 0) contendo 3 mg de norgestomet (N) e aplicação de solução injetável intramuscular (im) de 3 mg de N e 5 mg de valerato de estradiol (VE). No momento da retirada do implante (dia 10), as vacas foram separadas, aleatoriamente, em 4 grupos distintos: Grupo I (n=33): não recebeu eCG; Grupo II (n=34): 300 UI de eCG; Grupo III: 500 UI de eCG e Grupo IV: 700 UI de eCG. As inseminações artificiais (IAs) foram realizadas em tempo fixo, de 52-54 hs após a retirada do implante, com sêmen de qualidade comprovada através de avaliação prévia. Após 15 dias, as fêmeas permaneceram com touros por 45 dias afim de serem submetidas a monta natural (MN) caso retornassem ao estro. Aos 40 e 100 dias após a IA foi realizado, mediante palpação retal, o diagnóstico de gestação para identificação dos animais que conceberam por IA ou MN respectivamente. As taxas de prenhez da IA foram: Grupo I: 33.3% (11/33); Grupo II: 50,0%(17/34); Grupo III: 39,4% (13/33); Grupo IV: 45,5% (15/33). Para a análise estatística das variáveis foi utilizado o teste Qui-Quadrado. As taxas de prenhez não foram diferentes estatisticamente (p=0,539) em relação a dose de eCG utilizada. As taxas de prenhez totais, após a temporada de MN, foram: Grupo I: 78,8% (26/33); Grupo II: 79,4% (27/34); Grupo III: 90,9% (30/33); Grupo IV: 75,8% (25/33). Também não houve diferença estatística (p=0,411) entre os grupos. No Experimento 2, foram utilizadas 56 vacas ( 27 Nelore x Charolês e 26 Braford), multíparas, não lactantes, cíclicas, com idades variando entre 4 e 7 anos e ECC médio de 3,5. As fêmeas receberam aplicação de implante auricular subcutâneo de 3 mg N e aplicação injetável (im) de 3 mg de N e 5 mg de VE no momento da colocação do implante (dia 0). No momento da retirada do implante (dia 10) os animais foram divididos em 3 grupos com a finalidade de receber aplicação injetável (im) de eCG: Grupo I (n=18): 500 UI eCG; Grupo II (n=19): 1.000 UI eCG e Grupo III (n=19): 1.200 UI eCG. A partir do dia seguinte à retirada do implante e aplicação de eCG, os animais tiveram o estro controlado, duas vezes ao dia em intervalos de 12 hs. As IAs foram realizadas 12 hs após a identificação do estro. Nos animais em que o estro não foi identificado, realizou-se IA em tempo fixo de 52-54 hs após a retirada do implante. O diagnóstico de gestação foi realizado mediante palpação retal aos 45 dias após a IA. Os animais diagnosticados prenhes foram acompanhados durante o período de parição com o propósito de avaliar o número de produtos nascidos, já que foram utilizadas altas doses de eCG que poderiam originar nascimentos múltiplos. Através do Qui-Quadrado, primeiramente analisou-se a presença dos sinais de estro em relação a dose de eCG utilizada a cada grupo. No intervalo de 36 a 48 hs após a retirada do implante, 87,5% do animais apresentaram estro. Não houve diferença significativa (p=0,866) entre os grupos, indicando ausência de relação entre estro e dose de eCG utilizada. As taxas de prenhez obtidas em cada grupo também não resultaram diferentes (p=0,25) em função da dosagem de eCG utilizada. Grupo I: 44,4% (8/18); Grupo II: 36,8% (7/19), Grupo III: 63,2% (12/19). Os índices de prenhez dos animais que não demonstraram sinais de estro e que foram inseminados em tempo fixo, foram analisados mediante Regressão Logística e não diferiram (p=0,666) daqueles que foram inseminados 12 hs após a detecção do estro. Não foram observados partos gemelares e distocia nas vacas dos diferentes grupos experimentais. Nas condições de realização destes experimentos, o uso de eCG, ao final do tratamento com progestágenos e estrógenos, não interferiu nos resultados de prenhez em vacas não-lactantes ou lactantes, inseminadas 12 hs após o estro ou em tempo fixo, não demonstrou efeito sobre o aparecimento de estro em vacas solteiras e, nas doses utilizadas, não originou partos gemelares. A IA de vacas não-lactantes realizada em tempo fixo de 52-54 hs após o tratamento apresentou resultados de prenhez semelhantes aos observados nas IAs realizadas 12 após a identificação do estro.

Dois experimentos foram realizados com o objetivo de verificar o efeito de diferentes doses de eCG, após tratamento com progestágeno e estrógeno, sobre a fertilidade de vacas de corte. No experimento 1 foram utilizadas 133 vacas tipo Braford (½ Nelore x ½ Hereford), multíparas, 150 a 155 dias pós-parto, com idades entre 4 e 6 anos e escore de condição corporal (ECC) médio de 3 (escala de 1-5). Todos os animais foram submetidos a colocação de implante auricular subcutâneo (dia 0) contendo 3 mg de norgestomet (N) e aplicação de solução injetável intramuscular (im) de 3 mg de N e 5 mg de valerato de estradiol (VE). No momento da retirada do implante (dia 10), as vacas foram separadas, aleatoriamente, em 4 grupos distintos: Grupo I (n=33): não recebeu eCG; Grupo II (n=34): 300 UI de eCG; Grupo III: 500 UI de eCG e Grupo IV: 700 UI de eCG. As inseminações artificiais (IAs) foram realizadas em tempo fixo, de 52-54 hs após a retirada do implante, com sêmen de qualidade comprovada através de avaliação prévia. Após 15 dias, as fêmeas permaneceram com touros por 45 dias afim de serem submetidas a monta natural (MN) caso retornassem ao estro. Aos 40 e 100 dias após a IA foi realizado, mediante palpação retal, o diagnóstico de gestação para identificação dos animais que conceberam por IA ou MN respectivamente. As taxas de prenhez da IA foram: Grupo I: 33.3% (11/33); Grupo II: 50,0%(17/34); Grupo III: 39,4% (13/33); Grupo IV: 45,5% (15/33). Para a análise estatística das variáveis foi utilizado o teste Qui-Quadrado. As taxas de prenhez não foram diferentes estatisticamente (p=0,539) em relação a dose de eCG utilizada. As taxas de prenhez totais, após a temporada de MN, foram: Grupo I: 78,8% (26/33); Grupo II: 79,4% (27/34); Grupo III: 90,9% (30/33); Grupo IV: 75,8% (25/33). Também não houve diferença estatística (p=0,411) entre os grupos. No Experimento 2, foram utilizadas 56 vacas ( 27 Nelore x Charolês e 26 Braford), multíparas, não lactantes, cíclicas, com idades variando entre 4 e 7 anos e ECC médio de 3,5. As fêmeas receberam aplicação de implante auricular subcutâneo de 3 mg N e aplicação injetável (im) de 3 mg de N e 5 mg de VE no momento da colocação do implante (dia 0). No momento da retirada do implante (dia 10) os animais foram divididos em 3 grupos com a finalidade de receber aplicação injetável (im) de eCG: Grupo I (n=18): 500 UI eCG; Grupo II (n=19): 1.000 UI eCG e Grupo III (n=19): 1.200 UI eCG. A partir do dia seguinte à retirada do implante e aplicação de eCG, os animais tiveram o estro controlado, duas vezes ao dia em intervalos de 12 hs. As IAs foram realizadas 12 hs após a identificação do estro. Nos animais em que o estro não foi identificado, realizou-se IA em tempo fixo de 52-54 hs após a retirada do implante. O diagnóstico de gestação foi realizado mediante palpação retal aos 45 dias após a IA. Os animais diagnosticados prenhes foram acompanhados durante o período de parição com o propósito de avaliar o número de produtos nascidos, já que foram utilizadas altas doses de eCG que poderiam originar nascimentos múltiplos. Através do Qui-Quadrado, primeiramente analisou-se a presença dos sinais de estro em relação a dose de eCG utilizada a cada grupo. No intervalo de 36 a 48 hs após a retirada do implante, 87,5% do animais apresentaram estro. Não houve diferença significativa (p=0,866) entre os grupos, indicando ausência de relação entre estro e dose de eCG utilizada. As taxas de prenhez obtidas em cada grupo também não resultaram diferentes (p=0,25) em função da dosagem de eCG utilizada. Grupo I: 44,4% (8/18); Grupo II: 36,8% (7/19), Grupo III: 63,2% (12/19). Os índices de prenhez dos animais que não demonstraram sinais de estro e que foram inseminados em tempo fixo, foram analisados mediante Regressão Logística e não diferiram (p=0,666) daqueles que foram inseminados 12 hs após a detecção do estro. Não foram observados partos gemelares e distocia nas vacas dos diferentes grupos experimentais. Nas condições de realização destes experimentos, o uso de eCG, ao final do tratamento com progestágenos e estrógenos, não interferiu nos resultados de prenhez em vacas não-lactantes ou lactantes, inseminadas 12 hs após o estro ou em tempo fixo, não demonstrou efeito sobre o aparecimento de estro em vacas solteiras e, nas doses utilizadas, não originou partos gemelares. A IA de vacas não-lactantes realizada em tempo fixo de 52-54 hs após o tratamento apresentou resultados de prenhez semelhantes aos observados nas IAs realizadas 12 após a identificação do estro.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / En el presente estudio se determinaron los cambios histológicos gonadales e hipotalámico-hipofisiarios en ratones hembra Balb/c inmunizados con una vacuna peptídica contra la hormona GnRH-I, basada en el antígeno recombinante GnRX/ GQ y quitosano como adyuvante, en una formulación soluble y una estrategia de micropartículas. Los animales inmunizados (días 1 y 30) desarrollaron anticuerpos específicos IgG, IgG1 e IgG2a contra el antígeno recombinante desde la primera vacunación y contra la hormona nativa GnRH-I desde la revacunación. Se observó una disminución del número de cuerpos lúteos y folículos preovulatorios en el parénquima ovárico de los individuos inmunizados, principalmente en el grupo donde se utilizó quitosano soluble como adyuvante. Por otro lado, en los animales inmunizados se determinó mediante inmunohistoquímica, un aumento de células positivas para GnRH-I en la zona hipotalámico-hipofisiaria, sin embargo, en estudios futuros se debe complementar la inmunohistoquímica de encéfalo con un método cuantitativo como qPCR, debido a la difícil estandarización y cuantificación de los resultados obtenidos mediante inmunohistoquímica encefálica en ratones

O biglicam é um proteoglicano é altamente expresso em células trofoblásticas de patologias placentárias com invasividade exacerbada. No entanto, as funções do biglicam no trofoblasto ainda não foram elucidadas. Sendo assim, verificamos a expressão e as funções de biglicam e seus receptores Toll-like (TLR)-2 e TLR-4 nas células trofoblásticas durante a gestação. As células do citotrofoblasto extraviloso (CTEV) foram positivas para todas as moléculas, menos para o biglicam em placentas a termo. Adição exógena de biglicam promoveu migração e invasão das células trofoblásticas. O biglicam estimulou a fosforilação de AKT nos sítios Thr308 e Ser473 nas células trofoblásticas. A migração e a invasão biglicam-dependentes e as fosforilações de AKT foram inibidas após a adição de anticorpos bloqueadores anti-TLR-2 e anti-TLR-4. O silenciamento gênico de AKT1 em células SGHPL-5 aboliu os efeitos do biglicam na motilidade. Em conclusão, o biglicam aumenta a motilidade de células trofoblásticas após sinalização por AKT através da ativação de TLR-2 e TLR-4. / Biglycan is a highly expressed proteoglycan in trophoblast cells from invasiveness-changed placental pathologies. However, biglycan functions in the trophoblast were not yet identified. Therefore, it was verified the expression and functions of biglycan and its receptors Toll-like (TLR)-2 and TLR-4 in trophoblast cells throughout pregnancy. The extravillous cytotrophoblast cells (EVT) were positive to all the molecules, although biglycan was negative in term placentas. Exogenous biglycan promoted migration and invasion of trophoblast cells. Biglycan stimulated AKT phosphorilation at Thr308 and Ser473 sites in trophoblast cells. The biglycan-dependent migration, invasion and AKT phosphorilation were inhibited upon addiction of anti-TLR-2 and anti-TLR-4 blocking antibodies. AKT1 genic silencing in SGHPL-5 cells abolished the motility effects. In conclusion, biglycan increases the motility of trophoblast cells after AKT signaliing throughout TLR-2 and TLR-4 activation.

Vacas leiteira de alta produção têm apresentado declínio da eficiência reprodutiva. Essa redução é devido a causas multifatoriais, entre elas a baixa concentração de estradiol (E2) no proestro e a baixa concentração de progesterona (P4) no ciclo estral subsequentente. O objetivo deste trabalho foi comparar o uso de gonadotrofina exógena na dinâmica folicular e na taxa de prenhez de vacas submetidas ao protocolo Ovsynch (Experimento 1) ou a protocolos utilizando P4 e E2 (Experimento 2). No Experimento 1, animais de primeiro serviço foram pré-sincronizados com dois protocolos (Presynch ou Double-Ovsynch). Já os animais de segundo ou mais serviços foram resincronizados com o protocolo Resynch. Os animais receberam GnRH (1º GnRH), seguido 7 dias depois pela adiministração de prostaglandina F2α (PGF2α). Nesse momento os animais foram divididos homogeneamente por paridade e número de inseminação em um de dois tratamentos: sem FSH (Ovsynch, n = 561) ou com FSH (Ovsynch + FSH, n = 571). O segundo GnRH (2º GnRH) foi administrado 56 horas após a PGF2α e a inseminação em tempo fixo foi realizada 16 horas após. Amostras de sangue foram colhidas no 1º e no 2º GnRH, na PGF2α e 6 e 13 dias após o 2º GnRH para dosagem de P4. Ainda, no 2º GnRH dosou-se também E2 No Experimento 2, os animais foram sincronizados no dia 0 com um dispositivo de P4 associado a 2 mg de benzoato de estradiol. Oito dias após o dispositivo foi removido e os animais receberam uma dose de PGF2α. Neste mesmo momento, as vacas foram divididas homogeneamente por paridade, número de serviços prévios, escore de condição corporal e presença de CL no inicio do protocolo em três tratamentos: Controle (sem tratamento adicional; n = 232); eCG (400 UI de eCG; n = 232) e FSH (20 mg de FSH; n = 230). Todos os animais receberam GnRH e foram insemados 56h após a retirada do dispositivo. Foram colhidas amostras de sangue a cada 48h do dia 11 ao dia 22. No Experimento 1, não houve efeito do FSH na concetração sérica de E2 no 2º GnRH (P = 0,88), no tamanho do maior folículo no 2 º GnRH (P = 0,63), na taxa de ovulação ao 2º GnRH (P = 0,69) ou na concentração sérica de P4 no 6º (P = 0,15) e 13º (P = 0,36) dia após o 2º GnRH. A taxa de prenhez foi semelhante (P> 0,05) entre os animais tratados com Ovsynch (36,2%) e Ovsynch + FSH (39,1%). No Experimento 2, os tratamentos não alteraram o diâmetro do folículo ovulatório (P = 0,15), o intervalo entre a remoção do dispositivo de P4 e a ovulação (P = 0,30) e a taxa de ovulação (P = 0,44). Não houve efeito de tratamento na concentração sérica de P4 (P = 0,15). A taxa de prenhez foi diferente entre os tratamentos aos 30 dias após a IATF (Controle = 28,0a vs FSH = 18,7b vs eCG = 29,7a %; P = 0,01), mas não aos 60 dias (Controle = 21,6 vs FSH = 16,1 vs eCG = 24,1%; P = 0,08) e na perda de gestacional (Controle = 18,8 vs FSH = 14,0 vs eCG = 18,4%; P = 0,39). Assim, o tratamento com FSH não estimulou o crescimento folicular final e a função luteínica de vacas leiteiras de alta produção sincronizadas com os protocolos Ovsynch e P4/E2. / Fertility in high-producing dairy cows has decreased over the years, which has been associated with reduced estradiol (E2) concentrations during proestrus and suboptimal progesterone (P4) concentrations during early stages of gestation. The objectives of the present study were to evaluate the effects of exogenous gonadotropins on follicular dynamics and risk of pregnancy per artificial insemination (P/AI) in cows subjected to the Ovsynch protocol (Experiment 1) or to a P4/E2-based timed AI protocol (experiment 2). In experiment 1, cows were enrolled in the Ovsynch protocol (GnRH, 7 d PGF2α, 56 h GnRH, 16 h IA) either after presynchronization (Presynch or Double-Ovsynch; first AI postpartum) or 32 d after previous AI. At the PGF2α injection, cows were blocked by parity and number of AI and, within each block, randomly allocated to eitherreceive 20 mg of FSH at the moment of the PGF2α(Ovsynch + FSH, n = 571) or to remain as untreated control (Ovsynch, n = 561). Blood was sampled at the 1st and 2nd GnRH and PGF2α injections, as well as on d 6 and 13 after the 2nd GnRH to access P4 and E2 (at the 2nd GnRH only) concentrations. In experiment 2, cows were received a P4 device and 2 mg of estradiol benzoate. The device was removed 8 d later concurrently with an injection of PGF2α, followed by an injection of GnRH and AI at 56 h.At the PGF2α injection, cows were blocked by parity, number of AI, body condition score, and presence of a CL at device insertion.Within each block, cows were randomly allocated to receive either 20 mg of FSH (FSH, n = 230), 400 IU of eCG (eCG, n = 232), or no additional treatment at the moment of the PGF2α (Control, n = 232). Blood was sampled at every 48 h from 1 to 12 d after AI. In experiment 1, there was no effect of FSH on serum E2 at the 2nd GnRH (P = 0.88), follicle diameter at the 2nd GnRH (P = 0.63), ovulatory response to the 2nd GnRH (P = 0.69), or serum P4 on d 6 (P = 0.15) and 13 (P = 0.36) after the 2nd GnRH. Also, P/AI was similar (P > 0.05) between Ovsynch (36.2%) and Ovsynch + FSH (39.1%). In experiment 2, treatment did not affect ovulatory diameter (P = 0.15), interval from P4 device removal and ovulation (P = 0.30), ovulatory response to the 2nd GnRH (P = 0.44), and serum P4 (P = 0.15). Interestingly, treatment with FSH reduced (P = 0.01) P/AI on d 30 (Control = 28.0a vs. FSH = 18.7b vs. eCG = 29.7a %), but not on d 60after timed AI (Control = 21.6 vs. FSH = 16.1 vs. eCG = 24.1%; P = 0.08).The risk of pregnancy loss was not affected by treatment (Control = 18.8 vs. FSH = 14.0 vs. eCG = 18.4%; P = 0.39). In conclusion, treatment with FSH failed to enhance the final growth of the ovulatory follicle and did not improve luteal function after AI in high-producing dairy cows synchronized with either the Ovsynch or P4/E2-based timed AI protocols.

O Pirarucu (Arapaima gigas) é um peixe gigante da família Arapaimidae, nativo das bacias amazônicas que pode chegar a dois metros de comprimento e pesar mais de 200 Kg. Está presente no Equador, na Colômbia, no Peru, na Bolívia e no Brasil. Atualmente a espécie está ameaçada de extinção devido à pesca predatória e ao aumento da presença humana em seus viveiros naturais. No presente trabalho, os cDNAs da subunidade (ag-GTHα) e da subunidade β do hormônio folículo estimulante de A. gigas (ag-FSH) foram isolados e clonados pela primeira vez, possibilitando uma melhor compreensão da diversidade e evolução desta glicoproteína em peixes e a futura síntese biotecnológica deste hormônio para fins reprodutivos e alimentícios. Tanto o cDNA do ag-GTHα quanto aquele do ag-FSHβ foram sintetizados pela reação de transcriptase reversa (RT) e pela reação em cadeia da polimerase (PCR) utilizando como molde RNA total proveniente das glândulas hipofisárias de A. gigas. O cDNA da subunidade ag-GTHα possui uma sequência codificadora (Open Reading Frame, ORF) de 348 pb, o que corresponde a uma proteína de 115 aminoácidos com um suposto peptídeo sinal de 24 aminoácidos e com um peptídeo maduro de 91 aminoácidos. Dez resíduos de cisteínas responsáveis pela formação de cinco pontes dissulfeto, dois sítios de N-glicosilação e três resíduos de prolinas apresentaram-se altamente conservados quando comparados com outras espécies de peixes. A comparação baseada em sequências de aminoácidos de GTHα de 38 espécies de peixes revelou alta identidade do A. gigas com membros das seguintes ordens: Acipenseriformes, Anguiliformes, Siluriformes e Cypriniformes (87,1-89,5%), e, a menor identidade com os Gadiformes e Cyprinodontiformes (55%). A identidade com a análoga sequência de GTHα de Homo sapiens foi de 67%. Para a subunidade ag-FSHβ, a ORF correspondente foi de 381 pb, produzindo uma proteína de 126 aminoácidos com um peptídeo sinal de 18 e um peptídeo maduro de 108 aminoácidos. Quando comparado com as sequências de Anguilla marmorata, Acipenser gueldenstaedtii e Homo sapiens, o peptídeo maduro de ag-FSHβ mostrou conter 12 resíduos de cisteínas responsáveis pela formação de seis pontes dissulfeto, duas prolinas e um sítio de glicosilação perfeitamente conservados, apresentando identidades de 63, 50 e 45% respectivamente em suas sequências de aminoácidos. As árvores filogenéticas construídas mostraram, em geral, que o A. gigas, da ordem dos Osteoglossiformes, se apresenta como grupo irmão dos Clupeocefala, enquanto os Elopomorpha (Anguiliformes) formam o grupo mais basal de todos os teleósteos aqui analisados. / Pirarucu (Arapaima gigas) is a giant fish of the Arapaimidae family native to the Amazon river basin, that can reach 3 meters in length, weighing up to 250 Kg. It is present in Equador, Colombia, Peru, Bolivia and Brazil. This species is in danger of disappearing due to exploitation by the fishing industry and increasing human presence in its natural habitat. In the present work the cDNAs of the gonadotropin -subunit (ag-GTH) and of follicle-stimulating hormone β subunit (ag-FSHβ) were isolated and cloned for the first time. As a consequence, a better understanding of the diversity and evolution of this glycoprotein in fish and its future biotechnological synthesis for reproductive and alimentary purposes will be possible. Both cDNAs of ag-GTHα and ag-FSHβ have been synthesized via reverse transcriptase reaction (RT-PCR) and polymerase chain reaction (PCR) using as a template total RNA extracted from A. gigas pituitary glands. Ag-GTHα- subunit has a coding sequence (open reading frame, ORF) of 348 bp, corresponding to a 115 amino acid protein, with a putative signal peptide of 24 aminoacids and a mature peptide of 91 amino acids. Ten cysteine residues, responsible for the formation of five disulfide linkages, two N-glycosylation sites and three proline residues were found highly conserved when compared to other fish species. A comparison based on the amino acid sequence of the GTHα- subunit from 38 different species of fish showed high identity of A. gigas with members of the following orders: Acipenseriformes, Siluriformes and Cypriniformes (87.1-89.5%), while the lowest identity was found with Gadiformes and Cyprinodontiformes (55%). In comparison with the analogous sequence of Homo sapiens an identity of 67% was found. For the ag-FSHβ subunit an ORF of 381 bp, coding for a 126 amino acid protein, with a signal peptide of 18 and a mature peptide of 108 amino acids, was found. When compared with the Anguilla marmorata, Acipenser gueldenstaedtii and Homo sapiens, the mature peptide of ag-FSHβ showed the presence of the twelve cysteine residues responsible for the formation of six disulfide linkages, two proline residues and one glycosylation site, all of them perfectly conserved. The identity with the mentioned species were 63, 50 and 45% respectively. The obtained phylogenetic trees have shown, in general, that A. gigas of the order of Osteoglossiformes appears as sister group of Clupeocephala, while Elopomorpha (Anguilliformes) forms the most basal group of all analyzed teleosts.