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FTIR-spektroskopische Untersuchungen zum Aktivierungsmechanismus von bovinem und humanem Rhodopsin

Kazmin, Roman 13 August 2015 (has links)
Das aus dem Apoprotein Opsin und dem kovalent gebundenen Liganden bestehende Rhodopsin dient als Modellsystem für den Aktivierungsmechanismus der größten Klasse von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR). Infolge einer photochemischen Reaktion vollführt Rhodopsin eine Bewegungsabfolge von Sekundärstrukturelementen, wodurch es aktiviert wird, das G-Protein bindet und den Stimulus auf zellinterne Signalwege überträgt. Mithilfe der ortsspezifischen Mutagenese wurden Mutanten des bovinen Rhodopsins erzeugt, in eine künstliche Lipidumgebung eingelagert und hauptsächlich mittels FTIR-Spektroskopie untersucht. Anhand der Y191F- und Y192F-Mutanten konnte die Translokation des transienten Gegenions der Schiffschen Base Glu181 während der Aktivierung bestimmt werden. Die Interaktionen des Tyr206 sind für die gekoppelte Bewegung von EL2 und TM5 mitbestimmend, was mittels Y206F-Mutante gezeigt wurde. Eine Anhäufung von Methioninen auf der cytoplasmatischen Seite des Rezeptors ist u.a. für das Ausklappen der TM6 zuständig. Diese Bewegung ist wichtige Determinante der Rezeptoraktivierung. Hierfür wurden insgesamt fünf Mutanten verwendet. Im zweiten, hauptsächlichen Teil der Arbeit wird das bislang kaum untersuchte humane Rhodopsin mit dem bovinen Rezeptor verglichen. Ausgehend von verschiedenen Dunkelzuständen, konnte gezeigt werden, dass die Aktivierungsmechanismen beider Rezeptoren voneinander divergieren, um letztlich bei der Bildung der aktiven Spezies wieder zu konvergieren. Über die Analyse der Aminosäuresequenzen der Mammalia-Rhodopsine wurden zwei Bereiche hoher Variabilität identifiziert, die u.a. die molekulare Ursache für diese Diskrepanzen liefern. Diese Feststellung wurde mit human-bovinen-Rhodopsinchimären bewiesen. Ergänzend zu dieser Studie wurde Schafsrhodopsin einem Vergleich sowohl mit bovinem als auch mit humanem Rezeptor unterzogen. Es zeigte, als eine weitere natürlich vorkommende Variante des Lichtrezeptors, einen eigenständigen Weg der Aktivierung. / Rhodopsin, which consists of the apoprotein opsin and its covalently bound ligand, is used as a model system to understand the activation mechanism of the large family of G protein coupled receptors (GPCRs). As a result of a photochemical reaction, rhodopsin undergoes activating structural changes, enabling it to bind the G protein and transmitting the stimulus to intracellular signaling pathways. In the first part of this work, site-directed mutants of bovine rhodopsin were produced, incorporated into an artificial lipid environment, and studied mainly by FTIR spectroscopy. The translocation of the transient Schiff base counterion (Glu181) during the activation process was determined using the Y191F- and Y192F-mutants. The interactions of Tyr206 contributed to the coupled movement of EL2 and TM5, which was shown by Y206F-mutant. A striking accumulation of methionines on the cytoplasmic side of the receptor was observed to be a key-player for the activating outward motion of TM6. In the second and primary part of this work, human rhodopsin, which has been rarely studied, was compared with the bovine receptor. Starting from various dark states, it was shown that the activation mechanisms of both receptors diverge from each other and yet ultimately converge in the formation of the active species. By analyzing the amino acid sequences of mammalian rhodopsins, two regions of high variability were identified, which provide the molecular basis for these discrepancies. This finding was verified by the investigation of human/bovine rhodopsin chimeras. In addition to this study, ovine rhodopsin was compared with both the bovine and human forms. It showed, as another naturally occurring variant of the light receptor, an independent pathway of activation.
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Modulation orthostérique et allostérique du PAFR par des molécules synthétiques

Noël, Cynthia Jenny January 2008 (has links)
Le PAF (facteur d'activation des plaquettes) est un médiateur lipidique de l'inflammation très puissant impliqué dans plusieurs conditions pathophysiologiques.Le PAF agit principalement via un seul récepteur, le PAFR qui appartient à la famille des récepteurs couplés aux protéines G, les GPCRs. Le"two state model" assume que les GPCRs existent dans un état d'équilibre entre un état inactif (R) et un état actif (R*). L'isomérisation de R vers R* peut arriver de façon spontanée, c'est à dire indépendamment de la liaison d'un agoniste. Dans ces travaux de recherche, nous avons tenté de déterminer la propriété antagoniste et agoniste inverse des molécules orthostériques (WEB2086, PCA4248, FR49175, bromure d'octylonium, CV3988 et le Trans BTP dioxolane) à activer la voie des MAPK ainsi que le cycle biochimique des inositols phosphates dans la lignée cellulaire HEK 293 transfectée de façon stable avec le récepteur du PAF. De plus, l'activité potentiellement allostérique sur le PAFR de modulateurs synthétiques tels le THG-315, le THG-316 et MAREK a également été investiguée dans la même lignée cellulaire. Finalement, des surnageants d'hybridome 9H1/1C1, 9F5/1H4, 9F5/1H4, 9F5/1F8, 9F5/2B3 et 9F5/2E4 contenant des anticorps monoclonaux, dirigés tous contre un peptide qui équivaut à la région C-terminale de la troisième boucle extracellulaire du PAFR: GFQDSKfHQA ont également été utilisés, afin : (1) de déterminer le meilleur clone en terme d'affinité et de spécificité et (2) effectuer des tests pour savoir s'ils possèdent des propriétés agonistes ou antagonistes sur le PAFR. En conclusion, les résultats obtenus nous indiquent que : (1) l'efficacité des molécules orthostériques à antagoniser les réponses induites par le PAF dépend de leur nature et de leur concentration, (2) les modulateurs potentiellement allostériques utilisés ne modulent aucune des voies majoritairement connues pour être activées par le PAFR, et (3) qu'il n'y a aucun marquage spécifique du PAFR avec les surnageants d'hybridomes utilisés.
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The Role of the Central Region of the Third Intracellular Loop of D1-Class Receptors in Signalling

Charrette, Andrew 17 July 2012 (has links)
The D1-class receptors (D1R, D5R) each possess distinct signaling characteristics; however, pharmacological selectivity between them remains elusive. The third intracellular loops (IL3) of D1R and D5R harbour divergent residues that may contribute to their individual signalling phenotypes. Here we probe the function of central region of IL3 of D1R and D5R using deletion mutagenesis. Radioligand binding and whole cell cAMP assays suggest that the N-terminal and C-terminal moieties of the central IL3 oppositely contribute to the constitutive and agonist-dependant activity of D1-Class receptors. Whereas the N-terminal deletions ablated constitutive activity and decreased DA-induced activation, C-terminal deletions induced robust increases. These data, interpreted in concert with structural predictions generated from homology modeling implicate the central IL3 as playing an important role in the activation and subtype-specific characteristics of the D1-class receptors. This study may serve as a basis for the development of novel drugs targeting the central IL3 region.
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La voie de signalisation ERK1/2 couplée au récepteur 5-HT4 et sa régulation par GRK5 / ERK1/2 signalling coupled to 5-HT4 receptor and its regulation by GRK5

Carrat, Gaëlle 19 November 2010 (has links)
Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) peuvent activer des voies de signalisation indépendantes des protéines G. Cependant, la régulation de ces voies, et en particulier leur désensibilisation, est peu connue. Le récepteur de la sérotonine de type 4 (R-5-HT4) est un RCPG exprimé dans le cerveau et les organes périphériques. Il est impliqué dans des fonctions physiologiques importantes comme la mémoire, l'apprentissage, la prise de nourriture, le contrôle respiratoire et la mobilité gastro-intestinale. Le R-5-HT4 est couplé à la protéine Gs. De plus, il active la voie Src/ERK1/2, indépendamment des protéines G et des β-arrestines.Nous avons montré que GRK5, physiquement associé à la région C-terminale (C-ter) du R-5-HT4 inhibait la voie Src/ERK1/2 couplée au récepteur, mais pas la voie Gs. Ce résultat a été observé dans la lignée de cellules HEK-293 mais aussi dans des neurones de collicules en culture. Cette inhibition nécessite deux séquences d'évènements : l'association de la β-arrestine1 à une région riche en sérines et thréonines, localisée dans le domaine C-ter du récepteur et la phosphorylation par GRK5, de la β-arrestine1 (en sérine 412) liée au récepteur. La β-arrestine1 phosphorylée empêche l'activation de Src, constitutivement liée au récepteur, nécessaire à l'activation d'ERK1/2. Ceci constitue la première démonstration que la phosphorylation d'une β-arrestine par une GRK régule la signalisation indépendante des protéines G. En plus de ces résultats, nous avons démontré que l'activation d'ERK1/2 par le R-5-HT4, indépendante des β-arrestines, implique la libération d'un ligand induite par une métalloprotéase, conduisant à la transactivation d'un autre récepteur. Par une approche protéomique, nous avons également identifiés plusieurs partenaires potentiels du R-5-HT4. L'étude de ces partenaires pourrait apporter un éclairage supplémentaire sur les voies de signalisation du récepteur et leur régulation. / G protein-coupled receptors (GPCRs) have been found to trigger G protein-independent signalling. However, the regulation of G protein-independent pathways, especially their desensitization, is poorly characterized.The 5-Hydroxytryptamine 4 receptor (5-HT4R) is a GPCR widely expressed in the brain and at the periphery. It is implicated in important physiological functions such as memory, cognition, feeding, respiratory control and gastrointestinal motility. 5-HT4R couples to the Gs/cAMP/PKA pathway. Moreover, this receptor can activate a Src/ERK pathway independently of both G proteins and β-arrestins.Here, we show that the G protein-independent 5-HT4R-operated Src/ERK pathway, but not the Gs pathway, is inhibited by GPCR kinase 5 (GRK5), physically associated with the proximal region of receptor C-terminus, in both HEK-293 cells and colliculi neurons. This inhibition requires two sequences of events: the association of β-arrestin1 to a phosphorylated serine/threonine cluster located within the receptor C-terminal domain and the phosphorylation by GRK5 of β-arrestin1 (at Ser 412) bound to the receptor. Phosphorylated β-arrestin1 prevents in turn activation of Src constitutively bound to 5-HT4R, a necessary step in receptor-stimulated ERK signalling. This is the first demonstration that β-arrestin phosphorylation by a GRK regulates G protein-independent signalling.In addition to these results, we also demonstrated that the β-arrestin-independent activation of ERK1/2 by the 5-HT4R involves a metalloprotease-dependant ectodomain shedding and transactivation of another receptor. By a proteomic approach, we also identified several potential partners of the 5-HT4R. Study of these proteins may provide a better understanding of 5-HT4R signalling and his regulation.
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Nouvelles stratégies d’imageries afin de faciliter l’étude des interactions entre les récepteurs couplés aux protéines G

Héroux, Isabelle 08 1900 (has links)
L’étude de l’assemblage et de l’acheminement à la membrane plasmique des complexes de signalisation des RCPGs va jouer un rôle crucial dans le développement de nouveaux médicaments ayant moins d’effets secondaires. Des outils permettant l’étude de ces phénomènes existent déjà, mais un outil polyvalent qui permettrait d’étudier plusieurs aspects pourrait grandement faciliter et accélérer ces études. L’étiquette SNAP est un candidat intéressant puisqu’avec cette étiquette il est possible de marquer une seule construction avec une variété de différents substrats. Une construction encodant pour le récepteur β2AR avec une étiquette SNAP à son extrémité C-terminale a été ingénérée. Cette construction est apte à lier son ligand, à être acheminée à la membrane plasmique et à homodimériser. La protéine exprimée a été marquée avec le fluorophore BG-430. De la fluorescence non spécifique a été détectée dans la cellule (même en absence de l’étiquette SNAP sur le récepteur). Un essai BRET a été développé, utilisant la construction HA-β2AR-SNAP en tant qu’accepteur et est fonctionnel. L’étiquette SNAP, comme utilisée ici, ne présente pas un aussi bon candidat qu’attendu, puisque le substrat n’ayant pas réagi demeure coincé dans la cellule. Le facteur activateur de plaquette (PAF) et son récepteur (PAFR) jouent un rôle critique dans plusieurs réponses inflammatoires et le récepteur FP est impliqué dans l’accouchement prématuré. Une meilleure compréhension des complexes de signalisation associés à ces récepteurs pourrait être la première étape dans la compréhension de leur signalisation dans des situations normales ou de maladies. Des expériences de BRET étudiant des interactions de bases entre les récepteurs et leurs partenaires d’interactions connus ont été réalisées. Elles ont permis de déterminer que : les récepteurs PAF et FP homodimérisent, que les récepteurs PAF et FP hétérodimérisent, que les protéines Gβγ interagissent de manière constitutive avec ces récepteurs et qu’aucun signal de BRET n’a été détecté avec la protéine Gα et ce, en présence ou en absence de stimulation par un agoniste (suggérant qu’il est nécessaire d’optimiser le système présentement utilisé). / Studies of the assembly and plasma membrane trafficking of G protein-coupled receptor (GPCR) signalling complexes will play an important role in the development of new drugs with fewer side effects. Tools for this purpose have already been developed, but a more versatile tool which would allow assessment of multiple aspects of GPCR trafficking and protein/protein interaction could greatly facilitate and expedite these studies. The SNAP tag is without doubt an interesting candidate for this task. Using this tag, it is possible to label one receptor construct, with a variety of different substrates. A construct encoding the β2AR receptor was engineered with a C-terminal SNAP tag. This construct, when expressed in HEK 293 cells, was able to bind ligand, to traffic to the plasma membrane and to form homodimers. The expressed protein was then labelled with the BG-430 fluorophore. Non-specific fluorescence was detected in the cell, even in the absence of the SNAP tag. A BRET assay was developed using the HA-β2AR-SNAP as a BRET acceptor. The SNAP tag as used in this initial study was not as good as thought previously because uneacted substrate remains trapped in cells (i.e. the background was too high). Platelet-activating factor (PAF) and its receptor (PAF-R) play a critical role in many inflammatory responses and the receptor for prostaglandin F (FP) plays a role in pre-term labour. A better understanding of signalling complexes associated with these receptors might be the first step in a better understanding of their signalling in health and disease. As an initial step in this direction, we used BRET to study basic interactions between these receptors and known signalling partners. PAF-R and FP receptors homodimerize. A heterodimer between the FP and PAF receptors was also detected. Gβγ subunits interact with these receptors in a constitutive way. In the case of the Gα, no BRET signal was detected with or without agonist stimulation suggesting more work is required to optimize the system.
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Multiplexed cell-based assays to profile GPCR activities and cellular signalling

Galinski, Sabrina 25 February 2016 (has links)
No description available.
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Effects of Cannabinoid Receptor Interacting Protein (CRIP1a) on Cannabinoid Receptor (CB1) Function

Smith, Tricia 25 November 2009 (has links)
EFFECTS OF CANNABINOID RECEPTOR INTERACTING PROTEIN (CRIP1a) ON CANNABINOID (CB1) RECEPTOR FUNCTION. By Tricia Hardt Smith, B.S., M.S. A dissertation submitted in partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy at Virginia Commonwealth University Virginia Commonwealth University, 2009. Major Director: Dana E. Selley, Ph.D., Department of Pharmacology and Toxicology This dissertation examines modulation of cannabinoid CB1 receptor function by Cannabinoid Receptor Interacting Protein (CRIP1a), a novel protein that binds the C-terminus of CB1 receptors. In Human embryonic kidney cells expressing human CB1 receptors (hCB1-HEK) and hCB1-HEK cells stably co-expressing CRIP1a (hCB1-HEK-CRIP1a), quantitative immunoblotting revealed a CRIP1a/CB1 molar ratio of 5.4 and 0.37, respectively, with no difference in CB1 receptor expression. To test the hypothesis that CRIP1a modulates CB1 receptor signaling, G-protein and effector activity were examined with and without full, partial and inverse agonists. [35S]GTPgS binding, which measures G-protein-coupled receptor (GPCR)-mediated G-protein activation, showed that CRIP1a inhibited constitutive CB1 receptor activity, as indicated by the decreased effect of the inverse agonist SR141716A. CRIP1a also decreased CB1 receptor-mediated G-protein activation by high efficacy agonists, whereas moderate and low efficacy agonists were unaffected. In experiments varying Na+ concentration, CRIP1a decreased spontaneous G-protein activation at low Na+ concentrations, where spontaneous GPCR activity is highest. This effect was eliminated by pertussis toxin pre-treatment, indicating that CRIP1a only inhibits GPCR-mediated activity. To determine whether CRIP1a modulates receptor adaptation, hCB1-HEK (±CRIP1a) cells were pretreated with WIN or THC. Both ligands desensitized CB1 receptor-mediated G-protein activation, but desensitization was unaffected by CRIP1a. In contrast, CRIP1a attenuated downregulation of CB1 receptor binding sites by WIN, but not THC. Downstream, CRIP1a attenuated constitutive CB1 receptor-mediated inhibition of cAMP, as indicated by elimination of SR141716A-stimulated cAMP, without affecting agonist-induced cAMP inhibition. Constitutive inhibition was not due to endocannabinoids because LC-ESI-MS-MS did not detect endocannabinoids in hCB1-HEK (±CRIP1a) cells. To determine whether effects of CRIP1a were conserved among cell types, Chinese Hamster Ovary cells expressing CB1 receptors were stably co-transfected with CRIP1a, and had a CRIP1a/CB1 receptor molar ratio of 15 and 1900 with and without CRIP1a over-expression, respectively. In this model, CRIP1a inhibited constitutive CB1 receptor-mediated G-protein activity, but activation by agonists was enhanced, suggesting CRIP1a effects were dependent on stoichiometry of CRIP1a/CB1 receptor or cell type. Overall, these results indicate that CRIP1a decreases constitutive CB1 receptor activity, modulates agonist efficacy, and inhibits CB1 receptor downregulation, in a ligand- and cellular environment-dependent manner.
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Postnatální vývoj GABAb-receptorů v přední mozkové kůře potkana / Postnatal development of GABAb-receptors in the frontal rat brain cortex

Kagan, Dmytro January 2015 (has links)
In this work, the detailed analysis of GABAB-R/G protein coupling in the course of pre- and postnatal development of rat brain cortex indicated the significant intrinsic efficacy of GABAB-receptors already shortly after the birth: at postnatal day 1 and 2. Subsequently, both baclofen and SKF97541-stimulated G protein activity, measured as the high-affinity [35 S]GTPγS binding, was increased. The highest level of agonist-stimulated [35 S]GTPγS binding was detected at postnatal days 14 and 15. In older rats, the efficacy, i.e. the maximum response of baclofen- and SKF97541-stimulated [35 S]GTPγS binding was continuously decreased so, that the level in adult, 90-days old rats was not different from that in newborn animals. The potency of G protein response to baclofen stimulation, characterized by EC50 values, was also high at birth but unchanged by further development. The individual variance among the agonists was observed in this respect, as the potency of SKF97541 response was decreased when compared in 2-days old and adult rats. The highest plasma membrane density of GABAB-R, determined by saturation binding assay with specific antagonist [3 H]CGP54626AA, was observed in 1-day old animals. The further development was reflected in decrease of receptor number. The adult level was ≈3- fold lower than...
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Úloha metabotropních glutamátových receptorů a proteinů, které s nimi interagují, ve fyziologické signalizaci a v patologii / Role of metabotropic glutamate receptors and their associated proteins in physiology and pathophysiology

Kumpošt, Jiří January 2011 (has links)
of the thesis Glutamate is a main excitatory neurotransmitter in the brain of mammals, which activates both ionotropic and metabotropic glutamate receptors. Ionotropic receptors are responsible for fast synaptic transmission leading to membrane depolarization and Ca2+ influx into the cell. On the other hand mGlu receptors play an important role in regulation of the transmission via heterotrimeric G-proteins and activation of various signaling pathways. Postsynaptically localized group I mGlu receptors (mGluR1, 5) together with ionotropic NMDA and AMPA receptors share common large receptor signaling complexes, or signalosome facilitating glutamate signal transductions. Individual mGluR1 splice variants are differently associated with signalosome including scaffold proteins like PSD-95 which organize postsynaptic density (PSD). Heterodimerization of different mGluR1 splice variants is a focal point of my thesis together with investigation of recently discovered protein IL1RAPL1 (interleukin-1 receptor accessory protein-like 1) and its role in organization of postsynaptic signalosome. Using biochemical, immunocytochemical and functional assays we showed heterodimers of mGluR1a/1b were expressed on the plasma membrane and that heterodimers are fully functional in the recombinant system. Next we showed...
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Etude de l’interaction canaux calciques de type-N / récepteurs couplés aux protéines G et de son impact dans la tolérance aux effets analgésiques de la morphine. / Study of the interactions between N-type channels and G protein coupled receptors and their impact on morphine tolerance.

Accart, Sylvain 29 March 2013 (has links)
Bien que la régulation des canaux calciques par les récepteurs couplés aux protéines G soit connue depuis une trentaine d'année, ce n'est que récemment qu'il a été découvert que ce phénomène pouvait passer par une interaction directe entre ces deux partenaires. Les RCPGs sont les senseurs d'un grand nombre de paramètres (des simples photons aux molécules odorantes en passant par des hormones, acides aminés et nucléotides) et ils contrôlent un grand nombre de processus cellulaires en fonction de ces différents stimuli, ce qui en fait une cible thérapeutique majeure. Une de leurs cibles est l'activité des canaux calciques voltage dépendants qui est responsable d'un grand nombre de processus tels que le contrôle du potentiel de membrane, le relargage de neurotransmetteurs, la contraction musculaire ou, bien sûr, le contrôle du taux de calcium intracellulaire qui est lui-même un second messager impliqué dans de nombreuses voies de régulations.Il nous a donc paru intéressant de se pencher plus en avant sur ces interactions et de trouver une méthode nous permettant de cribler ces interactions potentielles avec des RCPG ciblés pouvant intervenir dans une thématique de contrôle de la douleur. Pour cela nous avons développé une stratégie de FRET en temps résolu utilisant les cryptates de terres rares à déactivation lente couplés aux ligands du tag SNAP comme donneurs de fluorescence, les canaux calciques étudiées étant fusionnés avec cet épitope et l'eGFP fusionnée aux RCPGs en tant qu'accepteur. Ce test nous a permis de confirmer l'interaction entre CaV2.2 et ORL1 le récepteur de la nociceptine. Nous avons ensuite cherché à caractériser plus précisément cette interaction et nous avons déterminé quelles en étaient les séquences peptidiques responsables au sein des domaines C-terminaux de ces deux protéines grâce à des expériences de GST-pull down. Nous avons synthétisé un peptide reproduisant la séquence d'interaction d'ORL1 que nous avons couplé à la séquence TAT, le rendant ainsi capable de pénétrer les membranes cellulaires. Lorsque nous ajoutons ce peptide leurre dans les expériences de TR-FRET, l'augmentation de fluorescence observée en présence de CaV2.2-SNAP et ORL1-GFP disparait totalement alors que l'ajout d'un peptide contrôle composé des mêmes acides aminés mais présentés dans le désordre n'a aucun effet. Nous avons ensuite cherché à étudier les effets de ce peptide in vivo lors d'un protocole de tolérance à la morphine étant donné que les souris K.O. pour le gène d'ORL1 sont résistantes à l'apparition de cette tolérance. Cette stratégie de découplage CaV2.2 :: ORL1 abolit complètement le phénomène de tolérance aux effets analgésiques de la morphine par une action au niveau spinal. Ce travail peut conduire à l'utilisation d'une telle approche dans une perspective thérapeutique visant à améliorer l'utilisation de morphiniques lors du traitement des douleurs chroniques. / The regulation of the calcium channels by GPCRs has been known for almost thirty years but the direction interaction between those two proteins is a recent breakthrough. GPCRs are sensors for a great number of parameters (photons, smell molecules, hormones, amino acids, nucleotides…) and they control numerous cellular functions according to those parameters making them a major target for pharmacology. One of the GPCR's targets is the calcium channel activity which is responsible for a great number of cellular processes like control of the membrane potential, neurotransmitters or hormonal secretion, muscular contraction and, of course, control of the intracellular calcium level which is a second messenger of numerous cell-regulation pathways.It appears to us that it would be interesting to study more closely those interactions and find a way to screen the GPCR/calcium channels interactions that may occur in pain regulation. We developed a strategy of time resolved FRET, using rare earth cryptate coupled to the ligand of the SNAP tag which is fused to the calcium channel as fluorescence donor and eGFP fused GRPRs as acceptors. That test confirmed the interaction between CaV2.2 and ORL1, the nociceptin receptor. We characterized more precisely the peptide sequence of the carboxy-terminal domain of the two proteins which is responsible for the interaction using GST-pull down experiments. We synthesized a peptide reproducing the ORL1 interaction sequence coupled to the TAT sequence allowing to go through the cell membranes. When we add this decoy peptide to ours TR-FRET experiments we lose all the increase of fluorescence that we see in presence of CaV2.2-SNAP and ORL1-GFP but the adding of a control peptide made of the same peptides but scrambled didn't affect the experiment. Then we look for the effects of this peptide in vivo, during a morphine tolerance protocol as it was reported that the ORL1 knock-out mice were insensitive to this phenomenon. This strategy of uncoupling CaV2.2 and ORL1 leads to a complete suppression of the tolerance to the analgesic effects of the morphine by an action at the spinal level. This work could lead to a therapeutic use of this approach which could enhance the use of morphinic compounds in treatment of chronics pains.

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