Made available in DSpace on 2017-07-25T19:30:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cristiane Romanek.pdf: 2518407 bytes, checksum: a9fd5d1b1e96d98a44dfc90dfaa0a4b6 (MD5) Previous issue date: 2014-12-12 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The objectives of this study were to characterize the resistance/susceptibility of the F2:3 maize progenies to anthracnose leaf blight (Colletotrichum graminicola), to estimate the genetic parameters associated with resistance, and map the genomic regions associated with quantitative resistance loci (QRL) by means molecular markers microsatellites (SSRs) and AFLPs. The inbred lines L04-2 (resistant) and L95-1 (susceptible) were crossed to generate an F2 population. Individuals of this population were selfed resulting F2:3 progenies, these were evaluated in three trials conducted in a randomized block design, with three replications. The treatments were consisted of 121 F2:3 progenies, parental lines and F1 generation. Plants were inoculated in two times between the stages V6 and V7, the second inoculation made seven days after the first. Three evaluation of the severity of anthracnose leaf blight were conducted: the 1st in VT (flowering) stage, 2nd in R2 and 3rd in R3 through a note scale with amplitude from 1 to 6. From the point assessments, was calculated the area under the disease progress curve (AUDPC). The results showed highly significant effects for both point assessments for AUDPC, indicating high genetic variability for resistance to anthracnose leaf blight among the F2:3 progenies. The high magnitude of genetic parameters indicate that the genetic control of resistance to anthracnose leaf blight of corn is associated with the expression of genes of great phenotypic effect. QRL mapping was conducted based on phenotypic analysis of 121 F2:3 progenies, evaluated in three experiments for three point assessments and AUDPC. Linkage analysis between the markers (microsatellites and AFPLs) and QRLs was performed by analysis of multiple linear regression and by composite interval mapping. Multiple linear regression identified mark SSRs and AFPLs highly associated with resistance alleles, the E55139 and E56386 AFLPs loci with the highest partial regression coefficients for the three experiments, with amplitudes from 6,67 to 31,31 % and 6,12 to 21,78 %, respectively. Were mapped 19 QRLs to anthracnose leaf blight in eight linkage groups. Six QRLs were the most stable environments for different evaluation and responsible for the large magnitude of the phenotypic variation in resistance. The high number of QRLs mapped in this population confirms the pattern of quantitative inheritance of resistance in tropical maize to anthracnose leaf blight caused by C. graminicola. / Os objetivos deste trabalho foram caracterizar a resistência/suscetibilidade de progênies F2:3 de milho à antracnose foliar (Colletotrichum graminicola), estimar os parâmetros genéticos associados à resistência, e mapear as regiões genômicas associadas à resistência quantitativa (QRL) por meio de marcadores moleculares microssatélites (SSRs) e AFLPs. As linhagens endogâmicas L04-2 (resistente) e L95-1 (suscetível) foram cruzadas entre si a fim de gerar uma população F2. Os indivíduos desta população foram autofecundados dando origem as progênies F2:3 que foram avaliadas em três experimentos, conduzidos no delineamento de blocos casualizados com três repetições. Os tratamentos foram constituídos de 121 progênies F2:3, linhagens parentais e geração F1. As plantas foram inoculadas por duas vezes entre os estádios V6 e V7, sendo a 2ª inoculação realizada sete dias após a 1ª. Foram realizadas três avaliações da severidade da antracnose foliar: a 1ª no estádio VT (pendoamento), a 2ª em R2 e a 3ª em R3 através de uma escala de notas com amplitude de 1 a 6. A partir das avaliações pontuais, calculou-se a área abaixo da curva de progresso da doença (AACPD). Os resultados evidenciaram efeitos altamente significativos tanto para as avaliações pontuais quanto para a AACPD, indicando grande variabilidade genética para a resistência à antracnose foliar entre as progênies F2:3. As elevadas magnitudes dos parâmetros genéticos indicam que o controle genético da resistência de milho à antracnose foliar esteja associado à expressão de genes de grande efeito fenotípico. O mapeamento de QRLs foi realizado com base na análise fenotípica das 121 progênies F2:3, avaliadas em três experimentos para as três avaliações pontuais e para a AACPD. A análise de ligação entre os marcadores (microssatélites e AFPLs) e os QRLs foi efetuada por meio da análise de regressão linear múltipla e pelo mapeamento por intervalo composto. A regressão linear múltipla identificou marcas SSRs e AFPLs altamente associadas a alelos de resistência, sendo os locos AFLPs E55139 e E56386 com os maiores coeficientes de regressão parciais para os três experimentos, com amplitude de 6,67 a 31,31 % e de 6,12 a 21,78 %, respectivamente. Foram mapeados 19 QRLs à antracnose foliar em 8 grupos de ligação. Seis QRLs foram mais estáveis para os diferentes ambientes de avaliação e responsáveis por grande magnitude da variação fenotípica em resistência. O elevado número de QRLs mapeados nesta população confirma o padrão de herança quantitativa da resistência de milho tropical à antracnose foliar causada por C. graminicola.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:28:31Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-07-10Bitstream added on 2014-06-13T19:16:33Z : No. of bitstreams: 1 silva_va_me_jabo.pdf: 515451 bytes, checksum: 2c88c0c9ded654221844f7613d8b5158 (MD5) / Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA) / O presente trabalho teve como objetivo avaliar genótipos de milho quanto à resistência a Colletotrichum graminicola, em condições de campo e casa de vegetação, por inoculações artificiais com isolados do patógeno obtidos de áreas de ocorrência da doença. Os experimentos foram instalados em dois locais: Fazenda experimental da FCAV/UNESP Campus Jaboticabal-SP em dezembro de 2004 e Embrapa Milho e Sorgo - CNPMS Sete Lagoas, MG, em janeiro de 2005 e em maio de 2005, em casa de vegetação do CNPMS. De acordo com os dados obtidos no experimento, existe evidência da existência de raças de Colletotrichum graminicola entre os isolados. No ensaio de Jaboticabal, os menores valores de AACPD foram observados nos genótipos BRS 3003 (híbrido triplo), seguido do BRS 2020 (híbrido duplo). Em Sete Lagoas, os menores valores de AACPD foram para os híbridos BRS 3003 e CMS 101142 (híbrido simples). Em geral, o híbrido BRS 3003 apresentou os menores valores da AACPD, sugerindo que a maior variabilidade genética (intercruzamento de três genótipos) desse material conferiu maior proteção contra o patógeno. / This research had as an objective to evaluate genotype of corn to see the resistance to Colletotrichum graminicola, in field conditions and greenhouse conditions, through artificial inoculations with isolated pathogens obtained in locations where the disease is prevelant. The research was setup in two locations: Fazenda Experimental da FCAV/Unesp Câmpus Jaboticabal - SP in December 2004 and Embrapa Milho e Sorgo/CNPMS Sete Lagoas - MG in January 2005 and may 2005 in the greenhouse of CNPMS. According to the data obtained in the experiment, there is evidence of the existence to races of Colletotrichum graminicola among the isolates. In the plots of Jaboticabal, the lowest values of AUDPC were observed in the genotypes BRS 3003 (triple hybrid), followed by BRS 2020 (double hydrid). In Sete Lagoas, the lowest values of AUDPC were from the hybrids BRS 3003 and CMS 101142 (simple hybrid). In general the hybrid BRS 3003 showed the lowest values of AUDPC, suggesting that the greater genetic variability (intercrossing of three genotypes) of this material was better protection against the pathogen.

A viabilidade econômica da produção de etanol de segunda geração (2G) depende do desenvolvimento de tecnologias eficientes e baratas para a hidrólise da biomassa lignocelulósica. Em particular, o grande consumo de água nas plantas de processamento de biomassa pode inviabilizar o processo. As xilanases são enzimas chave na hidrólise enzimática da xilana para a produção de etanol 2G e atualmente é grande o interesse na identificação de xilanases tolerantes a altas concentrações salinas, bem como aos subprodutos de etapas de pré-tratamento da biomassa, o que permitiria reduzir o volume de água empregado em etapas de lavagem e/ou a substituição da água doce pela água do mar. Neste contexto, os objetivos deste trabalho foram a purificação e caracterização bioquímica e cinética de uma endo-xilanase halotolerante e termoestável produzida por uma linhagem de C. graminicola isolada da floresta Amazônica (Brasil). A enzima pura (Excg1) apresentou massa molecular aparente de 20,0 ± 2,4 kDa em SDS-PAGE e 17,3 ± 1,9 kDa por filtração em gel, sugerindo que a enzima nativa é monomérica. O teor de carboidratos totais de Excg1 foi de 97,0 ± 3,7 % (m/m) e o seu ponto isoelétrico correspondeu a 9,200 ± 0,018. A enzima manteve cerca de 85% da atividade controle na presença de NaCl 0,5 mol/L. Em ausência e presença de NaCl em concentração 0,5 mol/L a temperatura e o pH ótimos de atividade de Excg1 foram 65 ºC e 5,5, respectivamente, enquanto na presença de NaCl 2,5 mol/L o pH ótimo foi alterado para 6,0. Excg1 mostrou-se bastante termoestável a 50ºC, com tempo de meia-vida de 48 h na ausência do substrato. Já na presença de NaCl 2,5 mol/L a termoestabilidade foi substancialmente maior, com atividade residual de 75% após o mesmo intervalo de tempo. Excg1 apresentou excelente estabilidade na faixa de pH de 3,0-10,0 na ausência de sal, mantendo-se também completamente estável entre pH 4,0 e 10,0 na presença de NaCl em concentração 0,5 e 2,5 mol/L. Os parâmetros cinéticos determinados para a hidrólise de xilana Beechwood por Excg1 na ausência de NaCl foram Vmax= 481,3 ± 34,0 U/mg e KM= 3,7 ± 0,3 mg/mL, resultando em eficiência catalítica (kcat/KM) de 36,9 mL/s.mg. Parâmetros muito similares foram determinados na presença de NaCl 0,5 mol/L, porém em presença do sal em concentração 2,5 mol/L ocorreu diminuição da afinidade aparente pelo substrato e redução da velocidade máxima, resultando em eficiência catalítica 2,3 vezes menor. Já a hidrólise de xilana Birchwood em ausência de sal ocorreu com constante de afinidade aparente similar e eficiência catalítica cerca de 18% maior, se comparada à hidrolise de xilana Beechwood na mesma condição. Excg1 foi tolerante a K+, Na+, Pb2+, Ni2+, Zn2+, Mn2+, Mg2+, Co2+, Ca2+ e Sr2+ em concentração 10 mmol/L, além de Cu2+, Al3+, Cr3+ e Fe3+ em concentração 1 mmol/L. Além disso, Excg1 foi tolerante a diferentes solventes orgânicos e a acetato. A análise dos produtos de hidrólise de xilana Beechwood por Excg1 revelou que os produtos principais formados foram xilobiose e xilotriose com uma ramificação de ácido 4-O-metilglucurônico. A presença de NaCl 0,5 mol/L não afetou este padrão de hidrólise e a enzima mostrou também boa tolerância aos produtos de hidrólise. Em conjunto, as propriedades de Excg1 sugeriram bom potencial de aplicação na sacarificação da biomassa lignocelulósica, particularmente em condições de salinidade elevada e/ou em presença de resíduos de etapas de pré-tratamento, o que é potencialmente interessante para viabilizar economicamente processos de produção de etanol 2G. / The economic viability of the production of second-generation (2G) ethanol depends on the development of efficient and inexpensive technologies for the hydrolysis of lignocellulosic biomass. In particular, the large consumption of water in the biomass processing plants can make the process unfeasible. The xylanases are key enzymes in the enzymatic hydrolysis of xylan aiming the production of 2G ethanol and there is currently great interest in identifying xylanases tolerant to high salt concentrations and to the byproducts from biomass pretreatment steps, allowing the reduction of the volume of water used in washing steps and/or the replacement of fresh water by sea water. In this context, the objectives of this work were the purification and the biochemical and kinetic characterization of a salt-tolerant and thermostable endoxylanase produced by a strain of C. graminicola isolated from the Amazon forest (Brazil). The pure enzyme (Excg1) showed apparent molecular mass of 20.0 ± 2.4 kDa by SDS-PAGE and 17.3 ± 1.9 kDa by gel filtration, suggesting that the native enzyme is monomeric. The total carbohydrate content of Excg1 was 97.0 ± 3.7% (m/m) and its isoelectric point corresponded to 9.200 ± 0.018. The enzyme retained approximately 85% of control activity in the presence of 0.5 mol.L-1 NaCl. In the absence and presence of NaCl at 0.5 mol.L-1 concentration, the optimum reaction temperature and pH of Excg1 were 65 ° C and 5.5, respectively, while in the presence of 2.5 mol.L-1 NaCl the optimum pH was altered to 6.0. Excg1 was highly thermostable at 50 °C, with a half-life of 48 h in the absence of substrate. In the presence of 2.5 mol.L-1 NaCl the thermal stability was greatly increased, and a residual activity of 75% was determined after 48 h at 50 ºC. Excg1 showed excellent stability in the pH range from 3.0 to 10.0 in the absence of salt, and was likewise completely stable at pH 4.0-10.0 in the presence of NaCl at the concentrations 0.5 mol.L-1 and 2.5 mol.L-1. The kinetic parameters for the hydrolysis of Beechwood xylan by Excg1 in the absence of salt were Vmax = 481.3 ± 34.0 U.mg-1 and KM = 3.7 ± 0.3 mg.mL-1, with a catalytic efficiency (kcat/KM) of 36.9 mL.s-1.mg-1. Similar parameters were determined in the presence of 0.5 mol.L-1 NaCl, while in the presence of a higher salt concentration (2.5 mol.L-1) decreases in the apparent affinity for the substrate and in the maximum velocity were observed, resulting in a catalytic efficiency 2.3 fold lower. In comparison with Beechwood xylan, the hydrolysis of Birchwood xylan in the absence of salt occurred with similar apparent affinity and catalytic efficiency about 18% greater. Excg1 was tolerant to 10 mmol.L-1 K+, Na+, Pb2+, Ni2+, Zn2+, Mn2+, Mg2+, Co2+, Ca2+ or Sr2+, and also to Cu2+, Al3+, Cr3+ e Fe3+ at 1 mmol.L-1 concentration. Furthermore, the enzyme was tolerant to various organic solvents and acetate. The analysis of Beechwood xylan hydrolysis products by Excg1 revealed that the main products were xylobiose and xylotriose with a 4-O-methylglucuronic acid branch. The presence of 0.5 mol.L-1 NaCl has not affected the hydrolysis pattern and the enzyme showed good tolerance to the hydrolysis products. Altogether, the properties of Excg1 suggested good potential for the saccharification of lignocellulosic biomass, particularly under high salinity conditions and/or in the presence of residues of pre-treatment steps, which is potentially interesting for the economically viable production of 2G ethanol.

Atualmente há grande interesse no desenvolvimento de processos enzimáticos eficientes para a hidrólise da biomassa lignocelulósica. O objetivo deste trabalho foi a otimização da produção por fermentação em estado sólido e a caracterização bioquímica, no extrato bruto, das -glucosidases, -xilosidases e xilanases produzidas por Colletotrichum graminicola e das lacases produzidas por Pycnoporus sanguineus. Também foi avaliado o potencial de aplicação dos extratos obtidos em coquetéis enzimáticos para a sacarificação de resíduos agroindustriais. A otimização das condições de cultivo, empregando a Metodologia de Superfície de Resposta, levou à produção de 159,3 ± 12,7 U g-1, 125,88 ± 6,4 U g-1, 378,1 ± 23,3 U g-1 e 138,6 ± 6,4 U g-1 de -glucosidases, -xilosidases, xilanases e lacases, respectivamente. Os meios de cultivo empregados foram constituídos por farelo de trigo suplementado com resíduos agroindustriais. Todas as enzimas produzidas apresentaram pH e temperatura ótimos de reação de 4,5-5,0 e 65ºC, respectivamente, bem como boa estabilidade térmica e ao pH. O coquetel composto pelos extratos brutos obtidos em condições otimizadas para a produção de xilanases (ECg) e lacases (EPs), em mistura com um extrato bruto de Trichoderma reesei rico em celulases (ETr) foi muito eficiente na sacarificação de palha de cana e papelão, sem pré-tratamento, atingindo rendimentos de 41,4 e 71,1% em glicose, respectivamente. Além disso, este coquetel foi mais eficiente na sacarificação de bagaço de cana explodido e in natura bem como de palha de cana in natura, quando comparado a um coquetel contendo celulases comerciais (Celluclast®) em mistura com ECg e EPs. Visando estudos futuros da ação individual de cada enzima sobre a biomassa, foi purificada uma -glucosidase majoritária de C. graminicola. A enzima mostrou temperatura e pH ótimos de reação de 5,0 e 65ºC, respectivamente, boa estabilidade térmica e ao pH, além da estimulação por xilose, propriedade muito interessante para emprego em coquetéis mistos de celulases e xilanases. Os resultados encontrados sugerem que as enzimas produzidas por C. graminicola e P. sanguineus, assim como os coquetéis enzimáticos avaliados, apresentam características muito interessantes para aplicações biotecnológicas, particularmente em processos de sacarificação da biomassa para obtenção de etanol celulósico. / There is currently a great interest in developing efficient processes for the enzymatic hydrolysis of lignocellulosic biomass. The objective of this study was the optimization of the culture conditions for the production of -glucosidases, xylanases and -xylosidases by Colletotrichum graminicola and laccases by Pycnoporus sanguineus under solid state fermentation, followed by the biochemical characterization of the enzymes in the crude extracts. The potential of application of the extracts to compose enzyme cocktails for the saccharification of agroindustrial residues was also investigated. Optimization of the culture conditions using the Response Surface Methodology led to the production of 159.3 ± 12.7 U g - 1, 125.88 ± 6.4 U g- 1, 378.1 ± 23.3 U g - 1 and 138.6 ± 6.4 U g - 1 of -glucosidases, -xylosidases, xylanases and laccases, respectively. The culture media employed consisted mainly of wheat bran, supplemented with agroindustrial residues. All enzymes produced showed optimum pH and temperature of 4.5-5.0 and 65° C, respectively, as well as good thermal and pH stability. A cocktail composed of the crude extracts obtained under optimized conditions for the production of xylanases (ECg) and laccases (EPs), mixed with a Trichoderma reesei crude extract (ETr), rich in cellulases, was highly efficient for the saccharification of sugarcane trash and cardboard, without pretreatment, reaching yields of 41.4% and 71.1% in glucose, respectively. Moreover, this cocktail was more efficient than a cocktail composed of commercial cellulases (Celluclast ®) in combination with ECg and EPs for the saccharification of raw and steam exploded sugarcane bagasse, as well as raw sugarcane trash. Aiming future studies on the individual action of each enzyme on biomass, a majoritary -glucosidase from C. graminicola was purified. The enzyme showed optima of temperature and pH of 5.0 and 65° C, respectively, good thermal and pH stability, as well as stimulation by xylose, a very interesting property for its application in mixed cellulase-xylanase cocktails. The results suggested that the enzymes produced by C. graminicola and P. sanguineus, as well as the cocktails employed in this study, have good potential for biotechnological applications, particularly in biomass saccharification processes for cellulosic ethanol production.

Made available in DSpace on 2017-07-25T19:30:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Hellen Christine Prochno.pdf: 2394554 bytes, checksum: 2bef91782af17469f52e15e3757a8eec (MD5) Previous issue date: 2013-11-18 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The objectives of this study were to measure the resistance/susceptibility of the sixteen maize inbred lines to anthracnose leaf blight (Colletotrichum graminicola (Ces.) G. W. Wils.) and estimate the genetic parameters associated with resistance, as well as study the inheritance of resistance and the genic action involved in the generations descended from crosses between maize inbred lines (Zea mays L.). Firstly, sixteen maize lines were screened for resistance/susceptibility to anthracnose leaf blight in three trials conducted in a randomized block design, with four replications. The plants inoculations were performed when the plants were six to seven completely expanded leaves in two times, the second made seven days after the first inoculation. To quantify the disease severity, six evaluations were performed at weekly intervals, initiated after the first symptoms appear, by use a note scale with amplitude from 1 to 6. Were used the data obtained in the second, fourth and sixth evaluation and data of the area under the disease progress curve (AUDPC) to perform analyzes and estimates of genetic parameters. To study the inheritance of resistance in maize to anthracnose leaf blight, were estimated the genetic parameters of six families derived from crosses between resistant and susceptible lines to C. graminicola. Each family consisted of six generations (P1, P2, F1, F2, RC1 e RC2), which were evaluated for resistance in two trials implanted in a randomized block design in a split-plot, where in the plots were studied the families effects and in splits the generations effects, with three replications. Were used the data estimated in second, fourth and sixth evaluation for the performed the statistical and genetic analysis. The results showed the existence of genetic variability for resistance/susceptibility to anthracnose leaf blight in all inbred lines studied. The inbred lines L 04-2, L 23-1, L 87-3, L 99-4 e L 118-4 stood out for keep the resistance pattern, showing the lowest values of AUDPC in the three trials, were considered important source of resistance to C. graminicola. The estimates genetic parameters indicated low participation of environmental effects on the resistance/susceptibility expression to anthracnose leaf blight and showed the possibility of genetic gains with the artificial selection. The results indicated predominance of additive effects in the inheritance of maize resistance to anthracnose leaf blight in the six families analyzed, explaining up to 99,39% of the phenotypic variation. The high heritability coefficients (broad and narrow sense) observed indicated ease in the artificial selection process by breeding programs. The heterosis estimates were high and negatives in all families studied, revealing the ability of resistant inbred lines (LR 04-2 e LR 23-1) in transmitting the resistance genes for generations affiliated, resulting in lower disease severity. The results showed that the inheritance of maize resistance to anthracnose leaf blight is oligogenic. Predominance of additive genic action, associated with high heritability estimates and oligogenic genetic control, assuming that genetic gains with artificial selection will reach success in the breeding programs that search develop resistant maize populations to anthracnose leaf blight. / Os objetivos do presente trabalho foram avaliar a resistência/suscetibilidade de dezesseis linhagens endogâmicas de milho à antracnose foliar (Colletotrichum graminicola (Ces.) G. W. Wils.) e estimar os parâmetros genéticos associados à resistência, bem como estudar o modo de herança da resistência e a ação gênica envolvida nas gerações descendentes de cruzamentos entre linhagens endogâmicas de milho (Zea mays L.). Primeiramente, dezesseis linhagens de milho foram avaliadas quanto a resistência/suscetibilidade à antracnose foliar em três experimentos instalados no delineamento de blocos casualizados, com quatro repetições. As inoculações das plantas foram realizadas quando as plantas estavam com seis à sete folhas completamente expandidas, em dois momentos, sendo a segunda realizada sete dias após a primeira inoculação. Para a quantificação da severidade da doença, foram realizadas seis avaliações com intervalo semanal, iniciadas após o aparecimento dos primeiros sintomas, pela utilização de uma escala de notas com amplitude de 1 a 6. Foram utilizados os dados obtidos na segunda, quarta e sexta avaliação e os dados da área abaixo da curva de progresso da doença (AACPD) para a realização das análises estatísticas e estimativas dos parâmetros genéticos. Para o estudo da herança envolvida na resistência de milho à antracnose foliar, estimou-se os parâmetros genéticos de seis famílias derivadas dos cruzamentos entre linhagens resistentes e suscetíveis à C. graminicola. Cada família foi constituída de seis gerações (P1, P2, F1, F2, RC1 e RC2), as quais foram avaliadas para resistência em dois experimentos implantados no delineamento de blocos casualizados, em esquema de parcelas subdivididas, onde nas parcelas foi estudado o efeito de famílias e nas subparcelas o efeito das gerações, com três repetições. Foram utilizados os dados estimados na segunda, quarta e sexta avaliação para a realização das análises estatísticas e genéticas. Os resultados evidenciaram a existência de variabilidade genética para a resistência/suscetibilidade à antracnose foliar no conjunto de linhagens estudadas. As linhagens L 04-2, L 23-1, L 87-3, L 99-4 e L 118-4 destacaram-se pela manutenção do padrão de resistência, apresentando os menores valores de AACPD nos três experimentos, sendo consideradas importantes fontes de resistência a C. graminicola. As estimativas dos parâmetros genéticos indicaram baixa participação dos efeitos ambientais na expressão da resistência/suscetibilidade à antracnose foliar e evidenciaram a possibilidade de ganhos genéticos com a seleção artificial. Os resultados indicaram predomínio dos efeitos genéticos aditivos na herança da resistência de milho à antracnose foliar nas seis famílias analisadas, explicando até 99,39% da variação fenotípica. Os elevados coeficientes de herdabilidade (sentido amplo e restrito) observados indicam facilidade no processo de seleção artificial pelos programas de melhoramento. As estimativas de heterose foram altas e negativas em todas as famílias estudadas, revelando a capacidade das linhagens resistentes (LR 04-2 e LR 23-1) em transmitir os genes de resistência para as gerações filiais, resultando na menor severidade da doença. Os resultados demonstraram que a herança da resistência do milho à antracnose foliar é oligogênica. Predomínio de ação gênica aditiva, associada às altas estimativas de herdabilidade e controle genético oligogênico, permitem inferir que os ganhos genéticos com a seleção artificial lograrão êxito nos programas de melhoramento que buscam desenvolver populações de milho resistentes à antracnose foliar.

Atualmente há grande interesse no desenvolvimento de processos enzimáticos eficientes para a hidrólise da biomassa lignocelulósica. O objetivo deste trabalho foi a otimização da produção por fermentação em estado sólido e a caracterização bioquímica, no extrato bruto, das -glucosidases, -xilosidases e xilanases produzidas por Colletotrichum graminicola e das lacases produzidas por Pycnoporus sanguineus. Também foi avaliado o potencial de aplicação dos extratos obtidos em coquetéis enzimáticos para a sacarificação de resíduos agroindustriais. A otimização das condições de cultivo, empregando a Metodologia de Superfície de Resposta, levou à produção de 159,3 ± 12,7 U g-1, 125,88 ± 6,4 U g-1, 378,1 ± 23,3 U g-1 e 138,6 ± 6,4 U g-1 de -glucosidases, -xilosidases, xilanases e lacases, respectivamente. Os meios de cultivo empregados foram constituídos por farelo de trigo suplementado com resíduos agroindustriais. Todas as enzimas produzidas apresentaram pH e temperatura ótimos de reação de 4,5-5,0 e 65ºC, respectivamente, bem como boa estabilidade térmica e ao pH. O coquetel composto pelos extratos brutos obtidos em condições otimizadas para a produção de xilanases (ECg) e lacases (EPs), em mistura com um extrato bruto de Trichoderma reesei rico em celulases (ETr) foi muito eficiente na sacarificação de palha de cana e papelão, sem pré-tratamento, atingindo rendimentos de 41,4 e 71,1% em glicose, respectivamente. Além disso, este coquetel foi mais eficiente na sacarificação de bagaço de cana explodido e in natura bem como de palha de cana in natura, quando comparado a um coquetel contendo celulases comerciais (Celluclast®) em mistura com ECg e EPs. Visando estudos futuros da ação individual de cada enzima sobre a biomassa, foi purificada uma -glucosidase majoritária de C. graminicola. A enzima mostrou temperatura e pH ótimos de reação de 5,0 e 65ºC, respectivamente, boa estabilidade térmica e ao pH, além da estimulação por xilose, propriedade muito interessante para emprego em coquetéis mistos de celulases e xilanases. Os resultados encontrados sugerem que as enzimas produzidas por C. graminicola e P. sanguineus, assim como os coquetéis enzimáticos avaliados, apresentam características muito interessantes para aplicações biotecnológicas, particularmente em processos de sacarificação da biomassa para obtenção de etanol celulósico. / There is currently a great interest in developing efficient processes for the enzymatic hydrolysis of lignocellulosic biomass. The objective of this study was the optimization of the culture conditions for the production of -glucosidases, xylanases and -xylosidases by Colletotrichum graminicola and laccases by Pycnoporus sanguineus under solid state fermentation, followed by the biochemical characterization of the enzymes in the crude extracts. The potential of application of the extracts to compose enzyme cocktails for the saccharification of agroindustrial residues was also investigated. Optimization of the culture conditions using the Response Surface Methodology led to the production of 159.3 ± 12.7 U g - 1, 125.88 ± 6.4 U g- 1, 378.1 ± 23.3 U g - 1 and 138.6 ± 6.4 U g - 1 of -glucosidases, -xylosidases, xylanases and laccases, respectively. The culture media employed consisted mainly of wheat bran, supplemented with agroindustrial residues. All enzymes produced showed optimum pH and temperature of 4.5-5.0 and 65° C, respectively, as well as good thermal and pH stability. A cocktail composed of the crude extracts obtained under optimized conditions for the production of xylanases (ECg) and laccases (EPs), mixed with a Trichoderma reesei crude extract (ETr), rich in cellulases, was highly efficient for the saccharification of sugarcane trash and cardboard, without pretreatment, reaching yields of 41.4% and 71.1% in glucose, respectively. Moreover, this cocktail was more efficient than a cocktail composed of commercial cellulases (Celluclast ®) in combination with ECg and EPs for the saccharification of raw and steam exploded sugarcane bagasse, as well as raw sugarcane trash. Aiming future studies on the individual action of each enzyme on biomass, a majoritary -glucosidase from C. graminicola was purified. The enzyme showed optima of temperature and pH of 5.0 and 65° C, respectively, good thermal and pH stability, as well as stimulation by xylose, a very interesting property for its application in mixed cellulase-xylanase cocktails. The results suggested that the enzymes produced by C. graminicola and P. sanguineus, as well as the cocktails employed in this study, have good potential for biotechnological applications, particularly in biomass saccharification processes for cellulosic ethanol production.

A viabilidade econômica da produção de etanol de segunda geração (2G) depende do desenvolvimento de tecnologias eficientes e baratas para a hidrólise da biomassa lignocelulósica. Em particular, o grande consumo de água nas plantas de processamento de biomassa pode inviabilizar o processo. As xilanases são enzimas chave na hidrólise enzimática da xilana para a produção de etanol 2G e atualmente é grande o interesse na identificação de xilanases tolerantes a altas concentrações salinas, bem como aos subprodutos de etapas de pré-tratamento da biomassa, o que permitiria reduzir o volume de água empregado em etapas de lavagem e/ou a substituição da água doce pela água do mar. Neste contexto, os objetivos deste trabalho foram a purificação e caracterização bioquímica e cinética de uma endo-xilanase halotolerante e termoestável produzida por uma linhagem de C. graminicola isolada da floresta Amazônica (Brasil). A enzima pura (Excg1) apresentou massa molecular aparente de 20,0 ± 2,4 kDa em SDS-PAGE e 17,3 ± 1,9 kDa por filtração em gel, sugerindo que a enzima nativa é monomérica. O teor de carboidratos totais de Excg1 foi de 97,0 ± 3,7 % (m/m) e o seu ponto isoelétrico correspondeu a 9,200 ± 0,018. A enzima manteve cerca de 85% da atividade controle na presença de NaCl 0,5 mol/L. Em ausência e presença de NaCl em concentração 0,5 mol/L a temperatura e o pH ótimos de atividade de Excg1 foram 65 ºC e 5,5, respectivamente, enquanto na presença de NaCl 2,5 mol/L o pH ótimo foi alterado para 6,0. Excg1 mostrou-se bastante termoestável a 50ºC, com tempo de meia-vida de 48 h na ausência do substrato. Já na presença de NaCl 2,5 mol/L a termoestabilidade foi substancialmente maior, com atividade residual de 75% após o mesmo intervalo de tempo. Excg1 apresentou excelente estabilidade na faixa de pH de 3,0-10,0 na ausência de sal, mantendo-se também completamente estável entre pH 4,0 e 10,0 na presença de NaCl em concentração 0,5 e 2,5 mol/L. Os parâmetros cinéticos determinados para a hidrólise de xilana Beechwood por Excg1 na ausência de NaCl foram Vmax= 481,3 ± 34,0 U/mg e KM= 3,7 ± 0,3 mg/mL, resultando em eficiência catalítica (kcat/KM) de 36,9 mL/s.mg. Parâmetros muito similares foram determinados na presença de NaCl 0,5 mol/L, porém em presença do sal em concentração 2,5 mol/L ocorreu diminuição da afinidade aparente pelo substrato e redução da velocidade máxima, resultando em eficiência catalítica 2,3 vezes menor. Já a hidrólise de xilana Birchwood em ausência de sal ocorreu com constante de afinidade aparente similar e eficiência catalítica cerca de 18% maior, se comparada à hidrolise de xilana Beechwood na mesma condição. Excg1 foi tolerante a K+, Na+, Pb2+, Ni2+, Zn2+, Mn2+, Mg2+, Co2+, Ca2+ e Sr2+ em concentração 10 mmol/L, além de Cu2+, Al3+, Cr3+ e Fe3+ em concentração 1 mmol/L. Além disso, Excg1 foi tolerante a diferentes solventes orgânicos e a acetato. A análise dos produtos de hidrólise de xilana Beechwood por Excg1 revelou que os produtos principais formados foram xilobiose e xilotriose com uma ramificação de ácido 4-O-metilglucurônico. A presença de NaCl 0,5 mol/L não afetou este padrão de hidrólise e a enzima mostrou também boa tolerância aos produtos de hidrólise. Em conjunto, as propriedades de Excg1 sugeriram bom potencial de aplicação na sacarificação da biomassa lignocelulósica, particularmente em condições de salinidade elevada e/ou em presença de resíduos de etapas de pré-tratamento, o que é potencialmente interessante para viabilizar economicamente processos de produção de etanol 2G. / The economic viability of the production of second-generation (2G) ethanol depends on the development of efficient and inexpensive technologies for the hydrolysis of lignocellulosic biomass. In particular, the large consumption of water in the biomass processing plants can make the process unfeasible. The xylanases are key enzymes in the enzymatic hydrolysis of xylan aiming the production of 2G ethanol and there is currently great interest in identifying xylanases tolerant to high salt concentrations and to the byproducts from biomass pretreatment steps, allowing the reduction of the volume of water used in washing steps and/or the replacement of fresh water by sea water. In this context, the objectives of this work were the purification and the biochemical and kinetic characterization of a salt-tolerant and thermostable endoxylanase produced by a strain of C. graminicola isolated from the Amazon forest (Brazil). The pure enzyme (Excg1) showed apparent molecular mass of 20.0 ± 2.4 kDa by SDS-PAGE and 17.3 ± 1.9 kDa by gel filtration, suggesting that the native enzyme is monomeric. The total carbohydrate content of Excg1 was 97.0 ± 3.7% (m/m) and its isoelectric point corresponded to 9.200 ± 0.018. The enzyme retained approximately 85% of control activity in the presence of 0.5 mol.L-1 NaCl. In the absence and presence of NaCl at 0.5 mol.L-1 concentration, the optimum reaction temperature and pH of Excg1 were 65 ° C and 5.5, respectively, while in the presence of 2.5 mol.L-1 NaCl the optimum pH was altered to 6.0. Excg1 was highly thermostable at 50 °C, with a half-life of 48 h in the absence of substrate. In the presence of 2.5 mol.L-1 NaCl the thermal stability was greatly increased, and a residual activity of 75% was determined after 48 h at 50 ºC. Excg1 showed excellent stability in the pH range from 3.0 to 10.0 in the absence of salt, and was likewise completely stable at pH 4.0-10.0 in the presence of NaCl at the concentrations 0.5 mol.L-1 and 2.5 mol.L-1. The kinetic parameters for the hydrolysis of Beechwood xylan by Excg1 in the absence of salt were Vmax = 481.3 ± 34.0 U.mg-1 and KM = 3.7 ± 0.3 mg.mL-1, with a catalytic efficiency (kcat/KM) of 36.9 mL.s-1.mg-1. Similar parameters were determined in the presence of 0.5 mol.L-1 NaCl, while in the presence of a higher salt concentration (2.5 mol.L-1) decreases in the apparent affinity for the substrate and in the maximum velocity were observed, resulting in a catalytic efficiency 2.3 fold lower. In comparison with Beechwood xylan, the hydrolysis of Birchwood xylan in the absence of salt occurred with similar apparent affinity and catalytic efficiency about 18% greater. Excg1 was tolerant to 10 mmol.L-1 K+, Na+, Pb2+, Ni2+, Zn2+, Mn2+, Mg2+, Co2+, Ca2+ or Sr2+, and also to Cu2+, Al3+, Cr3+ e Fe3+ at 1 mmol.L-1 concentration. Furthermore, the enzyme was tolerant to various organic solvents and acetate. The analysis of Beechwood xylan hydrolysis products by Excg1 revealed that the main products were xylobiose and xylotriose with a 4-O-methylglucuronic acid branch. The presence of 0.5 mol.L-1 NaCl has not affected the hydrolysis pattern and the enzyme showed good tolerance to the hydrolysis products. Altogether, the properties of Excg1 suggested good potential for the saccharification of lignocellulosic biomass, particularly under high salinity conditions and/or in the presence of residues of pre-treatment steps, which is potentially interesting for the economically viable production of 2G ethanol.

Accroître la diversité végétale au sein d'une culture par l'utilisation d'associations variétales est une stratégie qui permet de limiter la sévérité des maladies à dispersion éolienne. Les potentialités de cette pratique culturale restent à être caractérisées de manière précise dans le cas des maladies à dispersion pluviale, telle que la septoriose du blé durant sa phase épidémique. Cette maladie foliaire, due au champignon pathogène Mycosphaerella graminicola, est prédominante sur blé et est capable de causer des pertes substantielles de rendement, allant jusqu'à -40 %. Des expérimentations au champ ont été menées durant cinq années, de 2008 à 2012, sur le site INRA de Grignon (Yvelines, France), avec une association constituée de deux variétés de blé ayant des niveaux contrastés de résistance à M. graminicola, et dont les proportions étaient de une plante sensible pour trois assez résistantes. Par rapport à leur culture monovariétale respective, nous avons observé une diminution de la sévérité de la septoriose sur la plus sensible des variétés (en moyenne, 45 % de surface pycnidiale foliaire en moins sur les trois dernières feuilles), sans affecter significativement la variété plus résistante. Une méthodologie originale semi-automatisée a été développée pour quantifier le flux de spores dispersés par la pluie en conditions naturelles. Les mesures expérimentales ont permis de corréler l'intensité de plusieurs épisodes pluvieux avec la dispersion de spores au sein de différents couverts incluant des associations variétales. Un modèle mécaniste et stochastique a été développé afin de décrire la progression du potentiel de maladie au sein d'un couvert végétal hétérogène en trois dimensions. Cette approche théorique combine physique et épidémiologie, d'une part, (i) pour calculer l'interception des gouttes de pluie avec les organes végétaux et la trajectoire des gouttelettes d'éclaboussement au sein du couvert et, d'autre part, (ii) pour prendre en compte les niveaux de résistance variétale et la nature polycyclique de l'épidémie. À partir de ce modèle, il a été mis en évidence pour des associations de deux variétés que les proportions, ainsi que le différentiel de résistance entre les variétés à associer, pouvaient être optimisées pour réduire la sévérité de la maladie. Par ailleurs, ce modèle permet d'évaluer et d'identifier les distributions spatiales des variétés les plus propices à une réduction de la progression d'une maladie à dispersion pluviale. Parmi les précédents travaux traitant des potentialités des associations de variétés pour lutter contre des pathogènes dispersés par l'action mécanique de la pluie, certains avançaient des conclusions souvent contradictoires et peu en faveur de cette pratique. Nous avons montré ici qu'il est possible sous certaines conditions d'association de variétés (proportions, agencement spatial, différentiel de résistance globale) et de pluviométrie d'obtenir un effet significatif en termes de réduction de la maladie. / Increasing plant diversity within a crop by the use of cultivar mixtures is a strategy which allows to reduce severity of windborne diseases. Potentialities of this cropping practice have still to be precisely characterized in the case of rain-borne diseases, such as septoria tritici blotch during its spring epidemiological stage. This disease, due to the pathogen fungus Mycosphaerella graminicola, is prevalent on wheat crops and it may be result in substantial yield losses, up to -40%. Field experiments were carried out during five years, from 2008 to 2012, at the Grignon location (Yvelines, France), with a mixture consisting of two wheat cultivars with contrasted resistance to M. graminicola in a 1/3 susceptible/resistant ratio. In comparison with their pure stands, we observed a severity decrease of septoria tritici blotch for the most susceptible cultivar (on average, less 45% of leaf pycnidial leaf surface on the three upper leaf levels), without significantly affect the more resistant cultivar. An original semi-automated methodology was developed to quantify the splash-dispersed spore flux in outdoor conditions. Experimental measurements allowed to correlate intensity of several rainfall events with spore dispersal within different canopies including a cultivar mixture. A mechanistic and stochastic model was implemented in order to describe disease potential progression within a heterogeneous three-dimensional plant canopy. This theoretical approach combines physics and epidemiology in order to, on one hand, (i) compute interception of raindrops with plant organs and the pathway of splash droplets within the canopy and, on the other hand, (ii) take into account cultivar resistance levels and the polycyclism of epidemics. From this model, we highlighted for two-component cultivar mixtures that the proportions and the difference between resistance levels of cultivars to mix together could be optimized in order to reduce disease severity. Furthermore, this modelling approach makes it possible to assess and identify the cultivar spatial distributions the most favourable to a decrease of progression of a splash-dispered disease. Previous studies about potentialities of cultivar mixtures to control splash-dispersed pathogen agents, led in some cases to conclusions with inconsistent and not in favour of this cropping practice. We showed here that it was possible under certain cultivar designing conditions (proportions, spatial arrangement, difference between resistance levels) and rainfall properties to obtain a consistent significant effect in terms of disease reduction.

La température est un des principaux facteurs climatiques pilotant le développement des champignons pathogènes foliaires pendant les différentes étapes de leur cycle parasitaire. Puisque ces microorganismes se développent à la surface, puis à l’intérieur des feuilles, c’est la température de feuille (« body temperature » en écologie) qui pilote leur développement. En épidémiologie végétale, c’est toutefois la température d’air qui est utilisée pour caractériser l’effet de la température sur le développement des agents pathogènes foliaires. Or, la température de feuille peut différer significativement de la température d’air en fonction des conditions climatiques. La prise en compte de la température d’air pour étudier la dynamique des maladies foliaires ne peut donc s’affranchir de deux biais : la température mesurée n’est pas celle qui est réellement perçue par l’agent pathogène et l’hétérogénéité spatiale des températures au sein du peuplement n’est pas prise en compte. De plus, la relation entre la température et le développement des agents pathogènes est non linéaire, ce qui limite la gamme de validité autorisant l’utilisation des sommes de températures, pourtant largement employées en protestion des cultures. L’objectif général de cette thèse est de reconsidérer la prise en compte de la température pour l’étude du développement des champignons pathogènes foliaires.Le pathosystème blé-Mycosphaerella graminicola a été choisi en tant qu’objet d’étude. La stratégie adoptée pour atteindre les objectifs de la thèse combine deux approches complémentaires, l’expérimentation et la modélisation. Pour la première fois, la loi de réponse d’un agent pathogène foliaire à la température de feuille a été établie. Un dispositif expérimental innovant a permis d’établir la loi de réponse pour trois isolats sur une large gamme de températures foliaires, via la mesure en continu de la température de 191 feuilles (F et F) inoculées et l’utilisation d’un système de forçage thermique par lampe infrarouge. La loi de réponse de la période de latence de la septoriose à la température de feuille s’apparente au concept de courbe de performance thermique développé en écologie. Celle-ci étant non linéaire sur l’ensemble de la gamme de température étudiée, l’impact de l’amplitude de fluctuations de température de feuille a été caractérisé. Une amplitude élévée a conduit à plusieurs effets négatifs pour le développement de M. graminicola : l’augmentation de la durée du cycle de l’agent pathogène, la diminution de la surface sporulante des lésions et de la densité de pycnides. Les différences de cinétique de développement en fonction de l’amplitude des fluctuations ne sont que partiellement expliquées par l’effet Kaufmann (purement mathématiques), suggérant que M. graminicola atténue les conséquences négatives d’amplitudes de fluctuation plus élevées. Enfin, les simulations du développement de la septoriose réalisées à partir de données de températures foliaires diffèrent signicativement de celles réalisées à partir de températures d’air mesurées de façon standard par une station météorologique. Ces simulations ont également souligné le caractère déterminant du pas de temps considéré.Par le transfert de concepts d’écologie vers l’épidémiologie, cette thèse ouvre des pistes pour améliorer la prise en compte de la température dans les modèles épidémiologiques. Elle contribue au développement d’une meilleure compréhension des mécanismes par lesquels l’environnement affecte les microorganismes, point clé pour le développement de modèles mécanistes de réponses possibles au changement climatique / Temperature is a major force for the development of foliar fungal pathogens. Such organisms develop onto and into leaves during their growth cycle. Thus, leaf temperature is the temperature they actually perceive (“body temperature”). However, air temperature has always been used by plant pathologists to study the effect of temperature on the development of foliar fungal pathogens. Leaf temperature may significantly differ from the air temperature according to weather conditions. Therefore, considering the air temperature to study foliar pathogens can potentially cause two biases: the measured temperature is not the temperature such pathogens actually perceive and the spatial heterogeneity of leaf temperatures within the plant canopy is ignored. In addition, the relationship between temperature and the development of foliar pathogens is nonlinear. This challenges the immoderate use of degree-day sums in plant disease epidemiology. The main objective of this thesis is to reconsider the use of temperature for the study of the development of foliar fungal pathogens.The wheat-Mycosphaerella graminicola pathosystem was chosen as the model of study. The strategy to achieve the objectives of the thesis combines two complementary approaches: experimentation and modelling. For the first time, the impact of leaf temperature on the development of a leaf pathogen was characterized. An original experimental device allowed determining the response law for three isolates over a wide range of leaf temperature, using thermal infrared lamps and measuring continuously the temperature of 191 inoculated leaves (F1 and F2). The response law of M. graminicola latent period to leaf temperature is similar to the concept of thermal performance curve (TPC) developed in ecology. As this TPC is non-linear over the entire leaf temperature range investigated, the impact of the amplitude of leaf temperature fluctuations has been characterized. A high amplitude led to several negative effects on M. graminicola development: an increase in the duration of the pathogen cycle, a decrease in the final sporulating area in the pycnidium density. Differences in kinetics of development depending on the amplitude of the fluctuations were only partially explained by the Kaufmann effect (purely mathematical), suggesting that M. graminicola mitigates the negative consequences of higher amplitudes of temperatures fluctuation. Finally, simulations of the development of M. graminicola performed using leaf temperature data differed significantly from those performed using air temperatures measured in a standard way, by a weather station. Simulations also underlined the importance of the time step considered. By transferring concepts from ecology to epidemiology, this thesis provided guidelines to better take into account temperature in epidemiological models. It helped to develop a better understanding of the mechanisms by which the environment affects micoorganisms, the cornerstone for the development of mechanistic models of possible responses to climate change.

Meloidogyne graminicola est un nématode à galle du genre Meloidogyne spp. (RKN) qui est prépondérant dans les rizières d’Asie du Sud-Est et qui provoque des pertes significatives chez le riz. Malgré son impact négatif sur le rendement, les moyens de control et les méthodes d’identification de cette espèce sont encore limités. Dans cette étude, nous avons évalué l'incidence et la prévalence des RKN dans les rizières du Cambodge, du Laos et du Vietnam grâce à des marqueurs moléculaires développés dans cette étude. Nous avons de plus évalué, sur une séquence de deux ans, les effets de l'Agriculture de conservation (CA) sur la présence et la dynamique des nématodes parasites des racines (RPN) du riz, en relations avec le rendement et la qualité du sol, dans un champ d’expérimentation sableux de bas fond au Cambodge. Nous avons parallèlement évalué la susceptibilité à M. graminicola de 13 plantes adventices couramment utilisées en CA, ainsi que celle de trois variétés de riz, et identifié des plantes réservoir poussant dans les rizières Cambodgiennes. Dans une autre partie, nous avons validé des marqueurs intraspécifiques pour M. graminicola et étudié sa diversité génétique en Asie du Sud-Est. Par des approches de génomique comparative nous avons discuté des relations évolutives qu’il y aurait pu potentiellement y avoir entre M. graminicola et les espèces génétiquement proches. / The rice Root-knot nematode (RKN), Meloidogyne graminicola, reduces significantly rice yield in Southeast (SE) Asia and is prevalent in rice fields in this region. Despite its negative impact on yields, suitable methods of controls and current molecular markers used for M. graminicola identification are still limited. In this study, we evaluated the current occurrence of RKN in rice fields of Cambodia, Laos and Vietnam, and identified those RKN species using molecular markers developed in this study. We then evaluated, during two years sequences, the effects of the Conservation agriculture (CA) on the occurrence and dynamics of root-parasitic nematodes (RPN) of rice, in relation with yields and soil nutrients, in a lowland-sandy field in Cambodia. Host response to M. graminicola of 13 selected cover crops commonly used in CA, of three rice cultivars as well as rice weeds as reservoirs for M. graminicola, were evaluated. Furthermore, we validated intraspecific markers for M. graminicola, studied its genetic diversity in SE Asia, and discussed the potential evolutionary relations of Meloidogyne species using comparative genomics approaches.