Le carcinome hépatocellulaire figure parmi les cancers les plus meurtriers et, encore en 2015, les infections aux virus de l'hépatite B et C sont en tête de lice des principales causes d'apparition de cancer du foie. En effet, 80% des cas de carcinomes hépatocellulaires sont attribuables à une infection virale par un de ces deux agents pathogènes. D'un point de vue épidémiologique, le carcinome hépatocellulaire n'est pas celui qui frappe le plus d'individus en Amérique du Nord. En effet, seulement une personne sur 264 sera affectée par ce cancer. Toutefois, il est important de l'étudier en raison de son faible taux de survie, ce qui le classe en cinquième place des cancers les plus meurtriers. Dernièrement, les recherches font mention des modifications dans l'épissage alternatif comme mécanisme d’apparition de plusieurs types de cancer, notamment les cancers du sein, de l'ovaire et de la prostate. C'est pour cette raison que nous avons investigué l'implication des virus de l'hépatite B et C dans l'épissage alternatif de gènes cellulaires, afin de mettre à jour un nouveau mécanisme de carcinogénèse utilisé par les oncovirus pour transformer leurs cellules hôtes. L'étude présentée dans ce mémoire rapporte des changements dans l'épissage alternatif de plusieurs gènes cellulaires, lorsque l’on évalue les patrons d’épissage alternatif des transcrits provenant d’analyse de séquençage d’ARN à haut débit de tumeurs du foie comparativement à des tissus hépatiques sains. Ces analyses ont permis de déterminer certains changements attribuables à la présence de chacun des deux virus hépatotropiques au niveau de l’épissage alternatif, et d’identifier certains changements qui pourraient impliquer la transformation du tissu sain en tissu cancéreux. Il serait intéressant de faire une validation des effets directs d’une protéine virale du virus de l’hépatite B, la protéine trans-activatrice HBx, et de vérifier si la présence de HBx en cellule serait responsable de changements au niveau de l’épissage alternatif de gènes impliqués dans le processus carcinogénique.

La découverte d'adjuvants de vaccination est en pleine expansion dans un contexte règlementaire de plus en plus strict. L'objectif de ce travail de thèse a été de proposer un adjuvant hautement caractérisé de la famille de la lysophosphatidylcholine (LPC) pour un développement clinique. Il avait été précédemment montré que la LPC d'oeuf de poule présentait des propriétés adjuvantes in vitro et in Vivo. Cependant, il s'agit d'un mélange hétérogène d'espèces moléculaires de LPC peu exploitable en clinique. Nous avons donc cherché à 1/ cribler in vitro 5 différentes espèces moléculaires de LPC ayant des activités adjuvantes, et 2/ évaluer chez la souris l'aptitude des molécules sélectionnées à induire des réponses humorales et cellulaires.Deux candidats, les LPC C16 :0 et C18 :0, induisent in vitro la maturation de cellules dendritiques humaines caractérisée par l'augmentation de l'expression des marqueurs de surface, la production de chimiokines pro-Th1 et l'engagement vers un profil Th1 de lymphocytes T CD4+. Chez la souris, l'injection i. v. des candidats induit une réponse inflammatoire transitoire et modérée au profil Th2 (IL-5, IL-6). De plus, ces espèces induisen une réponse humorale spécifique contre 3 antigènes viraux après injection s. c. ou i. m. (NS3du VHC, HBsAg du VHB et gp120 du VIH), proche de celle obtenue avec l'alun et à des doses faibles supposées non toxiques. Dans ces modèles, en revanche, les LPC individuelles ne semblent pas induire de réponses cellulaires spécifiques.L'ensemble de ces résultats ouvre d'intéressantes perspectives pour l'utilisation des LPC C16 :0 et C18 :0 en tant qu'adjuvants de vaccination de réponses immunitaires humorales.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L'une des principales cibles pour la thérapie visant le virus de l'hépatite C (VHC) est l'ARN polymérase dépendante de l'ARN NS5B indispensable à la réplication du génome virale. NS5B est l'une des enzymes clefs du cycle virale de VHC et son activation met en jeu aussi bien des interactions intramoléculaires que des interactions avec des cofacteurs viraux et cellulaires au sein du complexe de réplication. Nous avons développé une nouvelle stratégie d'inhibition de NS5B basée sur l'élaboration de peptides courts dérivés de motifs exposés à la surface de l'enzyme dans le but de cibler les nombreuses interactions impliquées dans l'activation de cette protéine. En associant une analyse fine de la structure cristallographique de NS5B avec de la modélisation moléculaire, nous avons élaboré des peptides courts mimant les motifs « hotspot » de la protéine. Ces peptides ont été évalués sur système réplicon de génotype 1b et nous avons ainsi identifié un peptide leader Moon1 de 15 résidus correspondant à un motif hautement conservé du domaine "thumb". Dans ce travail, nous avons étudié en détail la structure et le mécanisme moléculaire de ce nouvel inhibiteur de NS5B. Moon1 inhibe l'activité polymérase de la forme sauvage de NS5B ainsi que celle de mutants résistants au inhibiteurs nucléosidiques et non nucléosidiques. Nous avons démontré que la fixation de Moon1 entraine un changement de conformation de NS5B et se fait préférentiellement avec NS5B dans une conformation fermée. Ce peptide inhibe spécifiquement l'interaction entre NS5B et l'ARN double brin, indépendamment de la présence d'ions métalliques et de manière dose-dépendante. Moon1 bloque la transition entre l'étape d'initiation de novo de la synthèse d'ARN et l'extension du primer. Nous avons démontré que les résidus essentiels à l'activité de Moon1 sont hautement conservés à travers les différents génotypes et sous-types de VHC. De plus, nous avons établi une séquence minimale pour l'activité de Moon1. Nos travaux permettent de valider l'intérêt d'une stratégie interfaciale ciblant une enzyme clef du cycle du VHC et les interactions intra et intermoléculaires nécessaires à son activation. / The non-structural protein RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) NS5B plays a key role in hepatitis C virus (HCV) replication and is currently considered as one of the most relevant target to develop safe anti-HCV agents. Although many small molecules have been identified as inhibitors of NS5B, very few are active in clinic. The structure and function of NS5B have been well characterized and as other polymerases, NS5B adopts a typical “right-hand” conformation containing the characteristic fingers, palm and thumb subdomains. The activation of NS5B requires conformational changes involving intramolecular contacts as well interactions with viral proteins and host factors in the replication complex. We developed a new strategy for NS5B inhibition based on short interfacial peptides derived from NS5B surface accessible motifs that target protein-protein interfaces or essential motifs involved in NS5B-activation. Combining the NS5B crystallogaphic structure and molecular modelling, we have designed short peptides derived from NS5B surface “hotspots” that were screened using HCV genotype 1b replicon cell system. We have identified Moon1, a short 15-residu peptide, derived from a well-conserved motif located in the NS5B thumb domain that inhibits HCV replication in the low nanomolar range. Moon1 tightly binds NS5B in a conformational-dependent manner and induces NS5B conformational changes. This peptide specifically inhibits double-stranded RNA/NS5B interactions in a dose-dependent and metal ions-independent manner. Moon1 blocks the transition between RNA de novo initiation and primer-extension. We showed that residues required for Moon-1 anti-polymerase activity are well-conserved among HCV genotypes and subtypes and a minimal Moon1 active motif was established. Taken together, these results demonstrate that NS5B structural dynamics constitute an attractive target for HCV chemotherapeutics and for the design of more specific new antiviral drugs.

Nous avons évalué les déterminants nutritionnels et génétiques du métabolisme de l’homocystéine en fonction des associations avec des pathologies prévalentes, en Afrique de l’Ouest. Nous avons montré qu’il existe une traduction phénotypique du polymorphisme MTHFR 677C>T sur l’homocystéinémie en rapport avec la prévalence de la carence en folates. Le statut en folates est associé avec la fréquence allélique MTHFR 677T, en comparant des populations de différents continents. Nous avons trouvé une association favorable de cet allèle avec l’hépatite virale B en Afrique. Nous avons remarqué également que le polymorphisme TCN 776C>G n’a pas d’influence sur l’homocystéinémie. Par contre la comparaison des populations migrantes et autochtones pour le polymorphisme TCN 776C>G fait ressortir une pression sélective par rapport au paludisme. De plus TCN776C>G est le seul déterminant génétique du métabolisme des monocarbones associé à la gravité de la maladie, en période d’accès palustre. L’association des déterminants de l’homocystéine avec les marqueurs clinico-biologiques du syndrome métabolique est surtout observée chez les femmes en Afrique et porte essentiellement sur les marqueurs du transport lipidique, dont ApoA et HDL. / In this work we had analysed nutritional and genetics determinants involved in homocysteine metabolism according to geographical areas, environment-gene interactions and their association with the most prevalent diseases in West Africa, viral B hepatitis, malaria and metabolic syndrome linked to obesity. We had shown that MTHFR 677C>T polymorphism had a dramatic influence on homocysteinemia, in relation with folates deficit. Folates status was associated with MTHFR 677T allelic frecuency, when comparing populations worldwide. There was not migrational influence, when African populations were compared with those from North America. We had found an association between T allele and favourable evolution of viral B hepatitis in Africa. In the other hand, we observed no influence of TCN776C>G on homocysteinemia. When comparing TCN 776C>G polymorphism in migrant and autochthonous populations, our results suggested a selection pressure related to malaria. This polymorphism was associated with the severe form of malaria fever. Influence of homocysteine determinants on clinical and biological markers of metabolic syndrome in Africa was preferably observed in women, with a significant association with ApoA and HDL.

Environ 350 millions de personnes dans le monde sont infectées par le virus de l’hépatite B (VHB), dont un million meurent chaque année des conséquences d’une infection VHB chronique. Cette chronicité implique la capacité du VHB de moduler l’apoptose. Dans le cadre du projet présent, l’influence de la capside du VHB sur l’apoptose au niveau du clivage de la Nucléoporine153 (Nup153) par la caspase 3 et l’influence de la protéine core en général sur l’apoptose ont été analysées. Pour répondre à l’effet de la capside sur le clivage de la Nup153 par la caspase 3, des systèmes analytiques in vitro et in vivo ont pu être mis en place. Après avoir purifié la GST-Nup153, l’impact de la capside du VHB sur son clivage a été analysé. Il a été constaté que la capside du VHB n’avait pas d’influence sur le clivage de la Nup153. Ce résultat a été confirmé par le système in vivo qui consistait en des cellules HeLa perméabilisées par la digitonine dans lesquelles la Nup153 a été également clivée en présence ou absence de la capside du VHB. Pour accrocher la capside à la Nup153, des essais de transport ont été réalisés avant le clivage par la caspase 3 recombinante. Dans la deuxième partie, l’influence de la protéine core du VHB sur l’apoptose induite par le récepteur Fas a été étudiée. Des cellules HepG2 ont été transfectées soit avec un vecteur codant pour la construction GFP-core, soit avec le vecteur de contrôle codant pour la GFP sans fusion. Après induction de l’apoptose par le ligand IgFasL, l’apoptose a été mesurée soit par l’analyse de l’activité de la caspase 3, soit par réduction du signal GFP. Les cellules contenant la GFP-core démontraient un taux apoptotique fortement réduit, comparées aux cellules transfectées avec la GFP, indiquant une fonction anti-apoptotique de la protéine core du VHB. / Around 350 million people worlwide are infected with the hepatitis B virus (HBV) and one million of people per year die because of the consequences of a chronic HBV-infection. The capacity of the HBV to become chronic suggests that this virus is capable to modulate the apoptosis. In the context of the present project, the influence of the HBV-capsid on the cleavage of the Nucleoporin153 (Nup153) by the caspase 3 and the influence of the HBV-core protein on the apoptosis in general have been investigated. In order to address the effect of the capsid on the cleavage of the Nup153 by the caspase 3, in vitro and an in vivo analytical systems have been developed. After the purification of the GST-Nup153, the impact of the HBV-capsid on his cleavage has been analyzed. It has been observed, that the HBV-capsid has no effect on the cleavage of the Nup153. This result has been confirmed by the in vivo system which has been represented by digitonin-permeabilized HeLa cells, in which the Nup153 has also been cleaved in presence or absence of the HBV-capsid. In order to attach the capsids on the Nup153, nuclear transport assays have been realized before the cleavage with the recombinant caspase 3. In the second part, the influence of the hepatitis core protein on the Fas induced apoptosis has been investigated. HepG2 cells have been transfected either with a vector coding for the construction GFP-core or with a control vector coding for the GFP-protein without any fusion. After induction of apoptosis by the ligand IgFasL, the apoptosis has been measured by the analysis of the caspase 3 activity and by the decreasing of the GFP signal. Cells containing GFP-core showed a strong decreasing regarding the amount of apoptosis compared to the cells transfected with GFP. This result suggests an anti-apoptotic function of the core protein of the HBV.

Lorsque l'hépatite chronique C a occasionné une cirrhose et que, du fait de ses complications, le pronostic vital est en jeu au terme de quelques mois, la transplantation hépatique (TH) représente l'unique traitement efficace,. Malheureusement, la récidive quasi-systématique de la cirrhose C, après la transplantation hépatique, est la principale barrière à la survie du greffon. De nombreux facteurs ont été associés à la sévérité des récidives, et une implication des lymphocytes T régulateurs CD4+CD25+ (Treg) et de certains immunosuppresseurs a été suggérée. Par ailleurs, le patient transplanté peut également être confronté au problème du rejet aigu d’allogreffe, qui est partiellement contrôlé par les Treg et par une thérapie immunosuppressive rigoureuse. Paradoxalement, plusieurs études ont suggéré que certains immunosuppresseurs sont moins efficaces que d’autres dans la prophylaxie du rejet d’allogreffe et peuvent même être associés à des épisodes de rejet plus fréquents. Il existait donc un besoin urgent d’évaluer le rôle joué par les immunosuppresseurs sur les Treg dans la récidive de la fibrose C et dans le rejet du greffon. Dans un premier temps, nous avons confirmé l’implication des Treg dans la progression de la récidive de l’hépatite C. En effet, les marqueurs associés à cette population sont surexprimés dans le foie et dans le sérum de patients, 1 an et 5 ans après la TH, et ce proportionnellement à la sévérité de la récidive. Dans un deuxième temps, nous avons évalué l’effet d’immunosuppresseurs utilisés après la TH (cyclosporine A (CsA), tacrolimus, rapamycine et mycophénolate mofétif) sur l’activité des Treg. Nous avons ainsi montré que seule la CsA a une action inhibitrice sur l’activité des Treg, et ce, uniquement aux doses thérapeutiques de 20 et 40 ng/mL (doses administrées au long terme, 5 ans après la TH). Cette inhibition de l’activité des Treg par la CsA ne modifie pas leur phénotype (expression protéique ou génique), mais conduit à la sécrétion d’IL-2 et d’IFN-γ par les Treg, cytokines de la voie Th1. Le mécanisme immunosuppresseur de la CsA étant d’inhiber la transcription de l’IL-2, via la voie calcineurine/N-FAT, nous avons tenté d’identifier si elle agissait sur les Treg par cette voie ou par une voie indépendante de la calcineurine. Deux observations ont renforcé l’hypothèse d’un mode d’action calcineurine/N-FAT - indépendant : (i) le fait que le tacrolimus, qui a le même mécanisme immunosuppresseur que la CsA, n’inhibe pas l’activité des Treg et (ii) le fait que NIM811, un analogue de la CsA n’agissant pas sur la voie de la calcineurine, inhibe l’activité des Treg aux mêmes doses que la CsA. Cette hypothèse a par ailleurs été directement confirmée par l’absence de modification du profil de déphosphorylation du facteur de transcription N-FAT, en présence de CsA. Enfin, bien que les corticoïdes soient connus pour préserver l’activité des Treg et induisent leur prolifération in vitro, ils sont incapables de reverser l’effet inhibiteur de la CsA sur les Treg. Nos résultats suggèrent donc qu’une dose thérapeutique de CsA inhiberait l’activité des Treg CD4+CD25+. Les cellules T régulatrices jouent un rôle important dans la tolérance du greffon et dans la sévérité des récidives après la TH, leur inhibition par la CsA pourrait alors favoriser le rejet du greffon et diminuer la sévérité des récidives. Ces résultats sont importants dans la mesure où la transplantation hépatique est à l’heure actuelle la seule alternative de survie au stade du carcinome hépatocellulaire, et qu’il n’existe aucun traitement efficace contre le rejet du greffon ou la récidive de l’hépatite C. Le traitement immunosuppresseur idéal n’existe pas, cependant il ne devrait pas augmenter l’activité suppressive des Treg, au risque de favoriser la récidive de l’hépatite C, ni inhiber cette activité, au risque de favoriser le rejet du greffon. / Liver transplantation (LT) remains the only effective therapeutic approach for cirrhosis related HCC patients. Inevitable hepatitis C virus (HCV) recurrence after liver transplantation is a major barrier to the survival of a transplanted liver. It may be promoted by immunosuppression and the emergence of CD4+CD25+ regulatory T cells (Treg). Transplanted patients are also been confronted to allograft rejection, which is partially controlled by Treg cells and the administration of an immunosuppressive therapy. However, some immunosuppressive drugs have been associated with more frequent graft rejection. In this context, it was important to assess the effect of immunosuppressive drugs on regulatory T cells, both in HCV recurrence and graft rejection. We have first confirmed the implication of Treg cells in hepatitis C recurrence progression. Indeed, regulatory T cells markers are over-expressed, 1 and 5 years after LT, both in the liver and in periphery and proportionally of the recurrence severity. In a second time, we have analysed the effect of immunosuppressive drugs used after LT (cyclosporine A (CsA), tacrolimus, rapamycine and mycophenolate mofetil) on regulatory T cell activity. We have shown that only low concentrations of CsA (20 and 40 ng/mL) inhibit regulatory T cell activity (these doses are used 5 years after LT). It seems that CsA does not affect regulatory T cell phenotype (protein and gene expression) but lead to a secretion of Th1 cytokines in Treg cells : IL-2 and IFN-γ. As CsA, is known to inhibit IL-2 transcription through the calcineurin/N-FAT pathway, we have tried to identify if CsA inhibits Treg cells via this pathway or via a calcineurin -independent pathway. Two observations have confirmed the hypothesis of a calcineurin -independent pathway : (i) tacrolimus, which have the same immunosuppressive mechanism as CsA, could not inhibit Treg activity, and (ii) NIM811, a calcineurin - independent CsA analog, inhibits regulatory T cell activity at the same concentrations than CsA. Moreover, this hypothesis has been directly confirmed by the absence of of modification of the N-FAT dephosphorylation profile. Lastly, corticoids, known to preserve Treg activity, could induce Treg cell proliferation in vitro. However, they could not reverse the inhibitory effect of CsA on Treg cells. Our results suggest that a therapeutical dose of CsA could inhibit CD4+CD25+ regulatory T cell activity. Treg cells play an important role in graft tolerance and hepatitis C recurrence after LT, so their inhibition by CsA could favour graft rejection and decrease recurrence severity. These results are important, as liver transplantation iscurrently the only survival alternative for HCC related patients. The ideal immunosuppressive therapy does not exist, but it would not increase Treg activity, which may promote hepatitis C recurrence, neither abrogate this activity due to the risk of graft rejection.

L'hépatite virale C est une maladie touchant aujourd'hui aux alentours de 200 millions de personnes dans le monde. C'est la première cause mondiale de greffe hépatique puisque son issue peut être le développement d'un hépatocarcinome. La maladie se déroule en 2 phases, une aigue, asymptomatique, dont environ 30% des maladies guérissent spontanément. Les autres vont voir leur maladie devenir chronique, avec installation d'une fibrose, puis d'une cirrhose et enfin un risque de 3% supplémentaires par an de développer un cancer du foie. Il n'existe à ce jour aucun vaccin préventif. Le traitement standard utilisé est une combinaison d'interféron alpha pégylé et de ribavirine et n'est efficace que dans 50% des cas pour le génotype 1, majoritaire. A ce jour, les mécanismes d'action du traitement lors de la phase chroniques sont très flous. Les objectifs de ce travail ont été d'étudier un panel varié de populations cellulaires périphériques et intrahépatiques au cours de l'hépatite C chronique afin notamment d'en évaluer les impacts causés par le traitement. Nous avons étudié finement les populations de cellules NK qui sont connues pour avoir certainement un rôle important dans la pathologie ainsi que pour subir de lourdes pressions du virus. Nous avons aussi étudié des facteurs immunitaires avant traitement potentiellement capables de nous indiquer quels malades répondront favorablement à la thérapie et quelles cellules produisaient de l'IFN en phase prétraitement. Nous avons étudié une multitude de paramètres immunologiques durant toutes les phases d'un traitement, avant pendant et 6, mois après, afin de pouvoir conclure sur les effets immunologiques de la bithérapie IFN+ribavirine. Enfin nous avons voulu caractériser et élucider la localisation et les rôles exacts des cellules T régulatrices périphériques et intrahépatiques au cours de l'hépatite C. Afin d'atteindre les buts que nous nous étions fixé, nous avons utilisé une assez vaste combinaison de technologies. Nous avons étudié les phénotypes des cellules par cytométrie de flux en 4 couleurs, mesuré l'expression d'une grande variété de gènes d'intérêts par RT-PCR, mesuré la sécrétion d'IFN spécifique du virus par elispot et enfin la sécrétion d'un panel de 6 cytokines de profil Th1 par CBA. Nous avons travaillé en étroite collaboration avec le département d'hépatogastroentérologie du CHU de Grenoble qui nous a fourni les échantillons sanguins et les biopsies hépatiques dont nous avions besoin. Nous avons tout d'abord étudié les populations NK intrahépatiques et périphériques ainsi que les corrélations entre leurs fréquences, leur phénotype et les paramètres cliniques. Cette étude a été réalise sur des malades chroniques d'hépatite C, mais aussi des témoins sains et atteints d'hépatite B chronique afin d'en extraire les impacts virus-spécifiques. Nous avons trouvé une augmentation du ratio NK cytotoxiques/NK sécrétrices lors de l'hépatite virale C. Nous avons pu mettre en lumière 2 sous-population particulières de NK, l'une associées au contrôle du virus, CD3-CD56dimNKG2A+, et l'autre a contrario associée aux lésions hépatiques, CD3-CD56brightNKG23A+. Notre étude sur les facteurs prétraitement prédictifs de la réponse thérapeutique a permis de déterminer le taux basal d'expression de l'IFN comme étant corrélé positivement à la réponse au traitement. De plus, il est significativement plus élevé chez les malades chroniques que chez les contrôles sains. Nous avons voulu ensuite savoir dans quel type cellulaire il était exprimé chez les futurs répondeurs. Nous en avons conclu que les cellules productrices d'IFN avant thérapie étaient les lymphocytes TNK. Nous avons ensuite suivi la réponse immunitaire T au cours du traitement contre l'hépatite C. Nous avons mesuré l'activation des lymphocytes T CD4+ et CD8+ via l'expression du récepteur CD25 (IL-2R), leur sécrétion d'interféron  en présence de peptides viraux par le biais de la technique de l'elispot, l'expression des gènes antiviraux induits par les IFNs par RT-PCR et les évolutions de leur phénotype, en plus de celui des cellules NK, par cytométrie en flux. Pour se faire, nous avons eut accès à une cohorte de malades issus d'un essai clinique financé par l'ANRS en collaboration avec le département d'hépatogastroentérologie du CHU de Grenoble, le projet Gammatri. Celui-ci consistait en l'évaluation de l'impact de l'ajout d'interféron  en injection pour des patients non-répondeurs à la thérapie classique. Nous avons pu avoir des prélèvements sanguins réguliers des malades avant, pendant les 48 semaines de traitement et après un suivi à la semaine 72, d'où nous avons extrait les cellules mononuclées. Nous avons déduits de cette étude que le traitement n'augmentait pas ni n'améliorait la réponse immunitaire spécifiques au VHC. Au contraire, il semble l'annuler, certainement pour laisser le temps à d'éventuels mécanismes indépendants des cellules de l'immunité adaptative de se mettre en fonctions. Nous avons également mis au point un système de culture de lymphocytes en présence de protéines virales permettant de mesurer l'impact direct de molécules sur la réponse spécifique au virus. Ce système a été utilisé sur des cellules de malades non traités, mises en présence d'IFN et de ribavirine à des doses proches des doses reçues in vivo lors du traitement par les cellules intrahépatiques. Dans ce cadre là, les techniques de PCR, de cytométrie en flux et d'elispot nous ont permis d'observer les modifications cellulaires induites par les molécules ajoutées. En étudiant les effets de l'interféron  et de la ribavirine sur les cellules T CD4+ et CD8+ et les cellules NK et TNK. Nous avons pu montrer que le traitement régulait négativement toutes les populations cellulaires testées à l'exception des cellules TNK, et ce seulement aux tout débuts de la culture. Enfin, nous avons étudié les lymphocytes T régulateurs (TReg) pour déterminer leur localisation et leurs rôles durant la maladie. Il s'est avéré que les TReg n'influençaient pas la charge virale, donc à priori n'inhibaient pas les cellules effectrices spécifiques du virus. En revanche, ils sont colocalisés dans les infiltrats hépatiques CD8+ et participent à la protection du foie des lésions en inhibant les cellules cytotoxiques par contact direct. Ceci ne dure néanmoins pas très longtemps puisqu'au-delà d'un certaine état de fibrose (>Metavir A2/F3), les TReg n'ont plus aucun contrôle sur les lésions hépatique, ce qui pourrait être l'une des causes de l'apparition de la cirrhose. Pour conclure, l'influence du virus sur l'immunité de son hôte est extrêmement complexe et fait intervenir un très grand nombre de facteurs. De notre étude, il en est ressorti que les cellules ayant le plus de potentiel dans le contrôle du virus, et donc devraient être prioritairement ciblées par les futures thérapies, sont les cellules NK CD3-CD56dimNKG2A+, corrélées négativement avec la charge virale, et les lymphocytes TNK, étant les seuls à répondre positivement à la thérapie par une sécrétion d'IFN. De plus, il serait nécessaire d'entretenir l'activité des cellules TReg intrahépatiques au-delà du stade A2/F3 pour empêcher la formation de lésions cirrhotiques menant au cancer du foie. Enfin, la mesure du taux d'expression de l'IFN avant traitement pourrait être un bon prédicateur de la réponse thérapeutique et ainsi permettre de mieux prendre en charge les malades.

L’hépatite est une inflammation du foie pouvant être causée par divers agents. Elle reste un problème de santé publique majeur dans le monde, compte tenu du coût de plus en plus élevé des médicaments. Une meilleure compréhension des mécanismes d’action des plantes médicinales apparaît intéressante pour développer des traitements alternatifs. L’objectif de cette étude était donc d’évaluer les propriétés hépatoprotectrice, puis d’identifier les mécanismes qui pourraient soutendre l’action de Neoboutonia velutina (NV), une plante médicinale camerounaise.Les extraits aqueux (NVH) et éthanolique (NVE) de NV ont été préparés, se référant à la préparation traditionnelle. Les analyses phytochimique et toxicologique ont été effectuées et le potentiel antioxydant évalué in vitro et in vivo. De même, l’effet antiinflammatoire des deux extraits a été évalué sur les cellules et chez la souris. L’hépatite aiguë a été induite par le tétrachlorure de carbone (CCl4) ou la Concanavalin A (ConA), chez la souris qui recevait ou non différentes doses d’extrait par gavage. De plus, l’extrait aqueux a été fractionné pour l’identification des composés bioactifs.NVE contiendrait ainsi des stérols et polyterpènes. Cet extrait a présenté une capacité anti-radicalaire meilleure que celle de NVH. Mais, il s’est avéré plus toxique que NVH; ce qui a limité nos investigations sur cet extrait. En revanche, NVH contiendrait des saponines et glycosides et a révélé une très faible toxicité. De plus, un remarquable effet protecteur de NVH a été noté contre les dommages causés par le CCl4. Cet effet protecteur s’est traduit par une diminution dose-dépendante et significative des transaminases sériques et une importante diminution des lésions hépatiques. Ceci, associé à la capacité antiinflammatoire in vitro et in vivo. En outre, un composé anti-radicalaire a été isolé de NVH. Par ailleurs, dans le modèle ConA, NVH n’a présenté qu’un faible effet protecteur. Ce qui suggère une efficacité sélective de cet extrait.En conclusion, nous avons démontré dans notre étude, un effet hépatoprotecteur de NV à travers l’extrait aqueux qui a présenté un effet hépatoprotecteur modèle dépendant. Cet effet, semble être médié au moins, par la capacité anti-radicalaire de la plante. Nos résultats présentent ainsi les premiers arguments en faveur de l’utilisation traditionnelle de NV contre les hépatites. Des études plus poussées permettraient de mieux comprendre les mécanismes d’action de cette plante et d’exploiter au mieux son potentiel thérapeutique, sans risque de toxicité. Ainsi, bien que présentant une toxicité, l’extrait éthanolique qui mime la préparation traditionnelle, a révélé un potentiel thérapeutique qui pourrait être très intéressant à très faibles doses. / Hepatitis is a liver inflammation caused by different agents. It remains a public health problem worldwide since current treatment methods are increasingly expensive. Medicinal plants are known as an important source of new molecules. A better knowledge of these natural resources appears interesting to develop alternative treatments. The aim of this study was then to evaluate the hepatoprotective effect of Neoboutonia velutina (NV), a Cameroonian medicinal plant, and decipher underlying mechanisms.NV aqueous (NVH) and ethanol (NVE) extracts have been prepared referring to the traditional use. Phytochemical and toxicological analyses were performed in vitro and in vivo. Similarly, extracts antioxidant and antiinflammatory potential was assessed on cells (or not) and in mice. Acute hepatitis was induced with carbon tetrachloride (CCl4) or Concanavalin A (ConA), in mice receiving or not different extracts doses by gavage. NVH fractionation was done to identify active compounds.NVE was containing sterols and polyterpens. Though it displayed a high radical scavenging capacity compared to NVH, it appeared more toxic. Thus, for assays, priority was given to NVH, containing saponins and glycosides. NVH showed a radical scavenging capacity with a very low toxicity. It remarkably protected mice from CCl4-induced liver injuries. As shown by significant dose dependent transaminases serum level decrease and liver injury important limitation. These, associated with NVH anti-inflammatory capacity. Furthermore, NVH fractionation led to a radical scavenging compound isolation. Otherwise, in ConA model NVH displayed weak effects. These findings suggested a selective NVH efficacy. In summary, we showed that NVH presents a model dependent hepatoprotective effect that may be mediated at least, through its radical scavenging property. Our findings are in line with Neoboutonia velutina traditional use and provide the first scientific arguments in favor of the traditional use of NV against hepatitis. Additional studies are needed to better understand NV mechanisms of action and then ensured its safe use. NVE mimics the traditional preparation. Even though that extract appeared toxic, it exhibited a therapeutic potential that could be interesting at very low doses.

La mise au point en 2005 d’un modèle de propagation sur lignée d’hépatocarcinome basé sur la souche hautement réplicative JFH-1 fut une formidable opportunité d’étudier les différentes étapes du cycle infectieux du VHC. Nous avons souhaité étudier les étapes de morphogenèse et de sécrétion du virus, des phases du cycle viral qui sont largement mal connues encore aujourd’hui, mais ou la protéine de capside joue probablement un rôle majeur. Des études comparatives des séquences de capsides de différentes souches du VHC nous ont permis de mettre en évidence 10 résidus spécifiques à la souche JFH-1 qui pourraient expliquer les déficits fonctionnels connus de cette protéine. En effet, le remplacement de ces 10 résidus par ceux plus communément retrouvés dans les souches de génotype 1 et 2 a permis une amélioration significative de l’assemblage et de la sécrétion des particules infectieuses produites. La mise au point de cette souche optimisée pour la production de virus pourrait par ailleurs permettre constituer un atout pour mieux comprendre la structure du virus par des techniques de microscopie électronique ; ce type d’étude n’ayant pas pu être véritablement menée jusqu’à présent, en raison des titres infectieux insuffisants obtenus avec la souche JFH-1 sauvage. / Development and cloning in 2005 of the highly replicative strain JFH-1 was a great opportunity to study the different stages of the infectious cycle of HCV as this strain easily propagate in the hepatocellular carcinoma cell line. Until now, these lates phases of particles assembly remain poorly understood, although the core protein is thought to probably play a major role in initiation of these mechanisms. Comparative studies of the capsid sequences of different strains of hepatitis C have allowed us to identify 10 specific residues in the JFH-1 strain that could explain the functional deficits of this protein. Indeed, the replacement in JFH-1 strain of these 10 residues by those most commonly found in strains of genotype 1 and 2 showed improvement of the assembly and secretion of new infectious particles and new subcellular localization of core. In addition, replacement of these ten residues by most common amino acid found in patients show a great enhancement of in vitro virus production and secretion. As a perspective, development of this optimized virus could also represent a valuable model to better purify and determine viral structure, and true viral assembly site; HCV fields that remain till now largely unknown.