HuR est une protéine liant l’ARN, qui contrôle l’expression des gènes au niveau post-transcriptionnel. Dans le cytoplasme, HuR module la stabilité et la capacité de traduction des ARNm sur lesquels elle se fixe. Nos résultats montrent que HuR est surexprimée dans le carcinome hépatocellulaire (CHC) humain et dans des lignées de CHC en culture. HuR est anormalement retrouvée dans le cytoplasme des cellules hépatiques tumorales, et participe à leur prolifération. En combinant l’analyse globale des gènes régulés par l’extinction d’HuR, celle des ARNm liés à HuR et celle du transcriptome des CHC humains, nous avons identifié 2 gènes dont l’expression est régulée par HuR. Ces gènes sont sous-exprimés dans les tissus de CHC et participent à la mise en place du phénotype cancéreux (résistance à l’apoptose, prolifération cellulaire, invasion,...). / HuR is a RNA binding protein that controls gene expression at post-transcriptional level. In the cytoplasm, HuR modulates the stability and capacity of mRNA translation upon which it binds. Our results show that HuR is overexpressed in hepatocellular carcinoma (HCC) and in human HCC cell lines in culture. HuR is abnormally found in the cytoplasm of liver tumor cells, and contribute to their proliferation. By combining the global analysis of genes regulated by the extinction of HuR, the mRNAs associated with HuR and the transcriptome of human HCC, we identified two genes whose expression is regulated by HuR. These genes are under-expressed in HCC tissues and participate in the development of cancerous phenotype (resistance to apoptosis, cell proliferation, invasion ,...).

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est un cancer de très mauvais pronostic, disposant de peu d’options thérapeutiques. Il est urgent de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Notre équipe a montré antérieurement que l’expression du récepteur Frizzled-7 (FZD7) dans le CHC jouait un rôle dans le contrôle du phénotype cancéreux. Le but de ma thèse était de développer une stratégie pour inhiber le signal FZD7 et d’étudier l’effet anti-tumoral potentiel d’une telle inhibition. A l’aide d’une approche peptidique inhibitrice de la liaison du récepteur avec son adaptateur cytoplasmique (Dishevelled), j’ai pu démontrer que l’inhibition du signal FZD7 exerce un effet anti-tumoral sur des lignées cellulaires de CHC, mais également in vivo, dans un modèle murin transgénique de CHC. J’ai élucidé une partie des mécanismes de cet effet anti-tumoral en étudiant l’impact du peptide sur les voies qui sont potentiellement activées par FZD7 dans des lignées cellulaires de CHC. Cette approche peptidique m’a permis de valider l’inhibition de FZD7 comme cible thérapeutique pour le CHC. Parallèlement, nous avons développé une collaboration avec l’entreprise IMAXIO qui a mis au point un test double-hybride permettant de cribler des molécules inhibitrices d’une interaction. Nous avons identifié 8 molécules chimiques qui inhibent l’interaction FZD7/Dishevelled. La poursuite de ce projet va permettre d’identifier, parmi ces 8 molécules, celles qui ont un potentiel anti-tumoral comparable à l’approche peptidique que j’ai développée, grâce aux modèles cellulaires et murins disponibles au laboratoire / Hepatocellular carcinoma (HCC) is a very bad prognostic cancer, with few therapeutic options. The development of new therapeutic strategies is an emergency. In previous studies, our team showed that overexpression of Frizzled-7 receptor (FZD7) in HCC plays a role in the control of cancer phenotype. The aim of my thesis was to develop a strategy to inhibit the FZD7 signal and study the potential antitumor effect of such an inhibition. I used a small-peptide approach to inhibit the binding between FZD7 and its cytoplasmic adaptator, Dishevelled, and showed that the inhibition of FZD7 signal display antitumor effects in vitro on HCC cell lines, as well as in vivo, in a murine transgenic model of HCC. I explored the molecular mechanisms of this antitumor effect on a HCC cell line. Thanks to this small-peptide approach, I validated the inhibition of FZD7 signal as a target for HCC therapy. We also developed a two-hybrid high throughput screening with IMAXIO (Lyon) to identify chemicals able to inhibit the FZD/Dvl interaction and we identified 8 compounds. Prospects of this study are to test the potential anti-tumor effect of these compounds on HCC cell lines and HCC in vivo models.

Le métabolisme des monocarbones relie le métabolisme cellulaire à la machinerie épigénétique à travers une molécule commune, la S-adénosylméthionine (SAM). Les changements dans le potentiel de méthylation cellulaire (ratio SAM/SAH) sont impliqués dans plusieurs maladies, notamment l'hépatocarcinome et les défauts de fermeture du tube neural (NTD). La perturbation du ratio SAM/SAH peut être liée à des déficits enzymatiques ou à une exposition à un facteur environnemental. La reméthylation de l'homocystéine (HCY) en méthionine est catalysée par la méthionine synthase (MTR) ou la bétaïne homocystéine méthyltransférase (BHMT) dans le foie. En comparant le tissu tumoral au tissu sain environnant dans le foie, les transcrits de BHMT étaient fortement diminués dans les échantillons mais pas les transcrits de MTR. La protéine BHMT n'a pas été détectée dans les cellules HepG2 et dans 5 des 6 échantillons tumoraux analysés. L'absence d'expression de BHMT était due à un variant génétique conduisant un codon stop prématuré. Une déficience pré-natale en donneurs de méthyle aggrave la susceptibilité face à certaines maladies. La fumonisine B1 (FB1) est une mycotoxine qui contamine les céréales et a été identifiée comme étant un facteur de risque de survenue de tumeur et des NTD. Nous avons étudié les récepteurs des folates et 4 marques de l'hétérochromatine dans le foie des foetus de rat issus de mères exposées à un régime déficient en donneurs de méthyle et/ou à la FB1 à une dose deux fois supérieure à la dose journalière admissible. Le régime carencé et la FB1 diminuent le ratio SAM/SAH. La FB1 inverse le mécanisme d'adaptation consistant en une régulation positive de l'expression des récepteurs des folates lors d'une carence seule. Le régime carencé diminue H4K20me3 mais une combinaison carence/FB1 diminue encore d'avantage H4K20me3 et augmente H3K9me3. Cette augmentation de H3K9me3 peut être vu comme un mécanisme de défense incitant la cellule à résister à la désorganisation de l'hétérochromatine. H3R2me2 et H4K16ac varient également selon ce mécanisme. Cette étude est pertinente car elle suggère que de faibles doses de FB1 interagissent avec la carence en donneurs de méthyle pour perturber le profil épigénétique / Folate-mediated 1-carbon metabolism is a conduit that links cellular metabolism to the epigenetic machinery through the common molecule, AdoMet. There is strong evidence that changes in the cellular methylation potential (AdoMet/AdoHcy ratio) is involved in several types of disease notably tumor proliferation like hepatocarcinoma and developmental disease like neural tube defects. Perturbation of AdoMet/AdoHcy ratio may be related to a cellular cause like enzyme defect or to exposure to an environmental factor. The remethylation of homocysteine to methionine is catalyzed either by methionine synthase (MTR) or by betaine-homocysteine methyltrnasferase (BHMT) in the liver. By comparing tumor tissue to surrounding healthy tissue in the liver we have found that BHMT transcripts, but not MTR, are strongly decreased in tumor samples. Consistently, BHMT protein was not detected in HepG2 cells and in 5/6 tumors investigated. Abolition of BHMT expression was due to a genetic variant producing a premature termination codon. Prenatal methyl deficient diet (MDD) enhances susceptibility to disease. Fumonisin FB1 is a corn contaminating mycotoxin identified as a risk factor for tumor occurrence and neural tube defects. We have investigated folate receptors and 4 heterochromatin markers in rat foetuses liver derived from dams exposed to MDD and/or FB1 administered at a dose twice higher than the Provisional Maximum Tolerable Daily Intake. We found that MDD and even FB1 by itself decrease the AdoMet/AdoHcy ratio. FB1 reverses the adaptation mechanism consisting in upregulating folate receptors in case of folate depletion. MDD decreased H4K20me3 but combined MDD/FB1 decreased H4K20me3 even more and increased H3K9me3. The elevated H3K9me3 can be viewed as a defence mechanism inciting the cell to resist heterochromatin disorganisation. H3R2me2 and H4K16Ac varied according to this mechanism. This study is relevant because it suggests that low doses of FB1 interact with methyl depletion to disrupt the epigenetic landscape

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est la tumeur maligne primitive du foie la plus fréquente (90 % des cas). Le CHC est le cinquième cancer par ordre de fréquence à l'échelon mondial, la troisième cause de décès par cancer dans le monde entier et son incidence est actuellement croissante. Parmi Les principaux facteurs prédictifs de survenue de CHC ; les altérations génétiques, l'alcool et les infections par les virus des hépatites B (VHB) et C (VHC). Les travaux de thèse en cotutelle menés entre l’Universités Paris Sud 11-France et l’Université Mohammed V- Rabat –MAROC ont porté essentiellement sur l’étude de deux facteurs de risque impliqués dans le développement du carcinome hépatocellulaire ; le polymorphisme génétique et l’infection par le virus de l’hépatite C. Dans un premier temps, ce travail de recherche s’est focalisée sur l’éventuelle relation pouvant liée les polymorphismes génétiques des gènes PCAF, P300 au carcinome hépatocellulaire. Sur le plan génétique nous avons constaté que les génotypes Val/Val de EP300 et Ser/Ser de PCAF apparaissent comme les plus associés à l’hépatocarcinome. Par ailleurs, ces derniers se trouvent associés d’une manière significative au carcinome hépatocellulaire. Par la suite, notre travail a consisté à mieux caractériser la variabilité génétique du HCV et l’épidémiologie des souches virales chez la population marocaine pour lesquelles peu de données étaient disponibles. Les analyses phylogénétiques des régions NS5B et E2 et les données épidémiologiques recueillies ont permis de répondre à ces questions. Enfin, La dernière partie des travaux de cette thèse vise à identifier des facteurs cellulaires essentiels à la réplication du VHC, dans l’objectif de définir de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement des hépatites virales C. Nous avons pu identifier la septine 9 comme facteur cellulaire impliqué dans le cycle de vie virale du HCV, ainsi que les protéines PIAS1 et SUMO1 comme protéines régulatrices de la septine 9. De plus nous avons pu établir la relation entre ces protéines cellulaires dont la présence est nécessaire à la fois à la production des protéines virales ( CORE et E2) et à la réplication du virus dans la cellule hôte. / Hepatocellular carcinoma (HCC) is the fifth most common cause of cancer worldwide and the third most common cause of cancer mortality. HCC is one of the few cancers with welldefined major risk factors. Major causes of HCC include hepatitis B, hepatitis C, alcoholic liver disease, nonalcoholic, steatohepatitis, hereditary hemochromatosis, and geneticalteration. The multifactorial causes of HCC might explain its complex molecular pathogenesis. Detailed understanding of epidemiologic factors and molecular mechanisms associated with HCC ultimately could improve our current concepts for screening and treatment of this disease. With a view toward current concepts for screening of this disease, first, we analyzed a genetic susceptibility to hepatocellular carcinoma. The aim of the current study was to assess the impact of the Ile997Val in EP300 and Asn386Ser in PCAF polymorphisms on the risk of HCC. we found that the Val/Val of the EP300 at codon 997 and Ser/Ser of the PCAF at codon 386 were associated with an increased risk of HCC in the Moroccan population. A higher risk of HCC was observed in HCV-negative subjects. We also found that male with Ser/Ser in thePCAF gene and women with Val/Val genotype of the EP300 had a higher risk to develop HCC. It appears that variants of the transcriptional coactivator genes (EP300 and PCAF) may influence HCC risk in populations with low mutations or hromosomal instability rates. Additional surveys are warranted to confirm this first report. The incidence of HCC is increasing in Western countries, mostly because of the high prevalence of hepatitis C virus (HCV) infection. In this sense, we have tried to identify new host factors involved in replication of HCV. Hepatitis C virus (HCV) replicates in the liver,and chronic infection often leads to cirrhosis, steatosis, and hepatocellular carcinoma. There is no vaccine to protect against HCV infection. Major improvement has been recently achieved regarding treatment of HCV infection however there is already evidence for emergence of resistance due to the high genetic variability of the HCV RNA genome. Thus it should be important, to design therapies which avoid genotypic resistance by targeting cellular proteins. Understanding the mechanisms that allow proper assembly and intracellular trafficking of HCV proteins may have a profound impact on the treatment efficacy. An important hallmark of chronic HCV infection is liver steatosis associated with the accumulation of lipid droplets (LDs). The LDs accumulated in the HCV infected cells and the HCV core protein induces the redistribution of LDs, through the clustering of these organelles in the perinuclear area, providing a platform for virus assembly and in the production of infectious particles. Several host proteins have been proposed to facilitate the replication of HCV however much is needed to elucidate the implicated mechanisms. Here we report that HCV infection increases expression and formation of septin 9 filament surrounding HCV core. Data of our study revealed the highest expression of septin 9 in samples from hepatocellular carcinoma (HCC) from patients with chronic HCV infection. Indeed, we brought newperception of septin 9 function regarding both microtubule and lipid structure organization. We proposed that HCV infection conducts to assembly of septin 9 in filaments through PIAS1. This may provide scaffolds to organize the microtubules network and LDs redistribution required for HCV assembly and replication. This study illuminates a new function of septin 9 in HCV life cycle through its association with lipids and microtubules. These events might depend on septin 9 SUMO1 modification by PIAS1. These findings also provide a step forwards in understanding the relationship between HCV and its host and open new therapeutic directions.

Les carcinomes hépatocellulaires (CHC) mutés CTNNB1 ont des caractéristiques phénotypiques propres en termes de polarité et de métabolisme (absence de stéatose). Nous avons émis l’hypothèse que ce phénotype pouvait être secondaire à l’activation du gène suppresseur de tumeurs LKB1 qui code une Ser/Thr kinase multitâches.Nous avons tout d’abord montré qu’il existait effectivement un dialogue complexe entre les voies Wnt/β-Caténine et LKB1 dans le foie. Les mutations de CTNNB1 sont en effet capables d’induire l’expression protéique de LKB1 dans des lignées hépatomateuses humaines, et les CHC mutés CTNNB1 présentent une expression protéique accrue de LKB1 et une signature transcriptionnelle d’activation de LKB1. De plus, dans deux modèles murins d’invalidation hépatospécifique de Lkb1, LKB1 est apparu comme requis pour l’activation complète du programme transcriptionnel de β-Caténine mais de façon dépendante du stade de développement et du contexte nutritionnel. Enfin, la signalisation LKB1 est apparue comme nécessaire à la survie des hépatocytes activés pour β-Caténine dans deux modèles murins différents.Nous avons aussi caractérisé les rôles métaboliques de LKB1 dans le foie. L’invalidation hépatospécifique de Lkb1 induisait une augmentation progressive de la masse grasse corporelle avec utilisation préférentielle des glucides comme substrat énergétique. Il existait une activation de la néoglucogenèse hépatique avec hyperglycémie et une lipogenèse accrue avec accumulation hépatocytaire de lipides. Enfin, nous avons mis en évidence une activation paradoxale de la signalisation AKT dans les hépatocytes, même à jeun, et une dépendance énergétique aux acides aminés. Enfin, nous avons identifié une nouvelle isoforme protéique de LKB1 délétée de son domaine N-Terminal et d’une partie de son domaine kinase. D’expression tissulaire préférentiellement musculaire et myocardique, cette isoforme catalytiquement inactive se comportait comme dominant positif sur l’activation de l’AMPK par la forme conventionnelle mais comme dominant négatif dans l’activité polarisation induite par LKB1. Enfin, elle était capable d’induire, en l’absence de la forme conventionnelle, la prolifération cellulaire et la tumorigenèse chez la souris nude. Elle pourrait exercer des rôles métaboliques particuliers dans les tissus fortement oxydatifs et des rôles oncogéniques dans certains contextes. / CTNNB1-Mutated hepatocellular carcinomas (HCC) share a specific polarity and metabolic phenotype without steatosis. We hypothesized that such phenotype could imply the tumor suppressor gene LKB1 that encodes for a multi-Task Ser/Thr kinase.We first demonstrated that a complex crosstalk indeed exists in the liver between LKB1 and the Wnt/β-Catenin pathway. LKB1 proteic expression was controlled by mutant β-Catenin in hepatomatous cell line and CTNNB1-Mutated HCCs had an enhanced LKB1 proteic expression as well a transcriptomic signature of LKB1 activation. In two mouse model of liver-Specific invalidation of Lkb1, we showed that LKB1 was required for full activation of the β-Catenin transcriptomic program, but it depended on the developmental stage and nutritional context. At least, LKB1 appeared to be required for the survival of β-Catenin activated liver cells in two other mouse models.Then, we wanted to caracterize the metabolic roles of LKB1 in the liver. Liver-Specific invalidation of Lkb1 progressively raised the body fat mass and we observed that carbohydrates were preferred as whole-Body energetic fuel. In the liver, gluconeogenesis and lipogenesis were enhanced, resulting in mild hyperglycemia and lipid accumulation in the hepatocytes. At least, we identified an aberrant activation of the AKT signaling in the liver, even during fasting, and an energetic dependence towards amino acids.At least, we identified a novel LKB1 proteic isoform that is deleted of its N-Terminal domain and part of its kinase domain. Highly expressed in the muscle and in the heart, this catalytically inactive isoform however acted as a positive dominant towards AMPK activation by full length LKB1 but as a negative dominant towards LKB1-Induced cell polarization. This isoform is also able to enhance cell proliferation and to induce tumors in a xenograft model, even when expressed alone. It could play specific metabolic roles in oxidative tissues and could be oncogenic in some contexts.

Carcinome hépatocellulaire (CHC) est le sixième cancer et la deuxième cause de mortalité par cancer dans le monde. Dans la majorité des cas, le CHC se développe sur une maladie chronique associée à des étiologies variées telles que l'infection par le virus de l'hépatite B ou l’hépatite C, la consommation excessive d'alcool et des maladies métaboliques. Le développement des maladies chroniques du foie qui conduisent à la cirrhose puis au cancer induisent des modifications de la composition chimique des cellules et des tissus. En effet, la carcinogenèse hépatique est un processus en plusieurs étapes caractérisé par la progression de nodules de régénération, de nodules dysplasiques de bas grade puis de grade et enfin du CHC. Le traitement du CHC reste difficile et la transplantation du foie est la seule option thérapeutique curative à long terme. Le problème est qu'il n'y a pas de marqueur objectifs et quantifiables pour contrôler la qualité d’un greffon. Des biomarqueurs spécifiques marquant la progression du CHC font également défauts.Dans ce travail de thèse, nous avons évalué l’intérêt de la microspectroscopie infrarouge (IR) pour le diagnostic de la stéatose, qui est le facteur le plus important affectant la reprise de la fonction hépatique après greffe de foie. La microspectroscopie infrarouge permet de détecter de façon qualitative et quantitative les caractéristiques biochimiques liées aux différents constituants moléculaires présents dans l'échantillon biologique. Nos travaux ont montré que la progression de la stéatose hépatique correspond non seulement à l'accumulation de lipides, mais également à des changements spectaculaires dans la composition qualitative du tissu. En effet, le bas grade de stéatose présente une diminution de la teneur en glycogène et une augmentation concomitante de lipides par rapport au foie normal. La stéatose intermédiaire montre une augmentation de glycogène et des changements majeurs sont observés en ce qui concerne les lipides, avec une contribution significative des acides gras estérifiés, des chaînes de carbone allongées et des lipides insaturés. Ces caractéristiques sont encore plus prononcées dans les hauts degrés de stéatose. De plus, nous avons mis en évidence que des changements biochimiques majeurs se produisent dans la partie non-stéatosique du tissu malgré son aspect normal sur le plan histologique, ce qui suggère que l’organe dans son ensemble reflète le degré de la stéatose.La deuxième partie de la thèse est focalisée la carcinogenèse hépatique. Il s’agit d’un processus en plusieurs étapes qui se caractérise dans la plupart des foies cirrhotiques par la progression de nodules hyperplasiques de régénération vers des lésions précancéreuses telles que les nodules dysplasiques de bas grade puis de haut grade et enfin le CHC. Le diagnostic différentiel entre nodules dysplasiques en particulier de haut garde et CHC reste extrêmement difficile. Nous avons abordé le potentiel de la microspectroscopie IR pour le diagnostic des nodules cirrhotiques. Nous avons observé de profondes modifications de la composition biochimique du foie pathologique. En effet, des changements importants ont été détectés dans la composition des lipides, des protéines et des sucres mettant en évidence la reprogrammation métabolique dans la carcinogenèse. Les principaux changements ont été observés dans le domaine de fréquence 950-1480 cm-1 dans lequel plusieurs bandes permettaient la discrimination des nodules cirrhotiques, dysplasiques et tumoraux. Enfin, nous avons montré que le diagnostic peut être réalisé à l’aide d’un microscope de laboratoire qui peut être facilement mis en œuvre en milieu hospitalier. / Hepatocellular carcinoma (HCC) is the sixth most common neoplasm and the second most common cause of death in the world. Hepatocarcinogenesis is a multistep process characterized in patients with chronic liver diseases by a spectrum of hepatic nodules that mark the progression from regenerative nodules to dysplastic lesions followed by HCC. Liver transplantation remains the curative therapeutic option able to treat both the HCC and the underlying liver disease. The issue is that there is no objective and quantifiable marker for quality control of liver graft. Specific biomarkers of early stages of HCC are also an unmet need.In this study, we have evaluated the potential of infrared (IR) microspectroscopy for the diagnosis of steatosis, one of the most important factors affecting the liver allograft function. Vibrational microspectroscopy, such as Fourier transform infrared microspectroscopy (FTIR), allows detecting spectral characteristics associated with different molecular components present in the biological sample, both qualitatively and quantitatively. Our first working hypothesis was that the progression of liver steatosis corresponds not only to the accumulation of lipids but also to dramatic changes in the qualitative composition of tissue. Indeed, a lower grade of steatosis showed a decrease in glycogen content and concomitant increase in lipids in comparison with normal liver. Intermediate steatosis exhibited an increase in glycogen and major changes in lipids, with a significant contribution of esterified fatty acids with elongated carbon chains and unsaturated lipids, and these features were more pronounced in a high grade of steatosis. Furthermore, we have shown, that FTIR approach allows a systemic discrimination of morphological features, leading to a separate investigation of steatotic vesicles and the non-steatotic counterpart of the tissue. This highlighted the fact that dramatic biochemical changes occur in the non-steatotic part of the tissue also despite its normal histological aspect, suggesting that the whole tissue reflects the grade of steatosis. The second part of the thesis focused on hepatocarcinogenesis; a multistep process that is characterized in most cirrhotic livers by the progression from hyperplastic regenerative nodules to low grade dysplastic nodules (LGDN), high grade dysplastic nodules (HGDN) and finally small HCC which corresponds either to vaguely nodular well differentiated HCC so called early HCC or to distinctly nodular moderately differentiated hepatocellular carcinomas. Since the differential diagnosis between precancerous dysplastic nodules and early HCC remains extremely difficult, we addressed the potential of FTIR microspectroscopy for grading cirrhotic nodules. The study was focused on 39 surgical specimens including normal livers as controls, dysplastic nodules, early HCC and the progressed HCC. Profound alterations of the biochemical composition of the pathological liver were demonstrated by FTIR microspectroscopy. Indeed, dramatic changes were observed in lipids, proteins and sugars highlighting the metabolic reprogramming in carcinogenesis. The major changes were observed in the frequency domain 950-1480 cm-1 in which several bands allowed significant discrimination of cirrhotic nodules, dysplastic lesions and HCC. Finally, a significant discrimination between benign, dysplastic nodules and early HCC remained possible using a FTIR microscope equipped with a laboratory-based infrared source that can be easily implemented in hospital environment. In conclusion, our study positions FTIR microspectroscopy as a versatile and powerful approach for investigating liver diseases, such as steatosis, dysplastic lesions and cancer. Further studies on larger series of patients as well as on biopsies will allow confirming the clinical reliability of such spectral signatures. Therefore, we anticipate that FTIR microspectroscopy will open new avenue in clinical diagnosis.

La voie de signalisation WNT/β-caténine est impliquée dans de nombreuses processi cellulaires, du développement à la physiologie. Dans le foie adulte, elle est nécessaire pour établir et maintenir la zonation métabolique, condition préalable pour la fonctionnalité de l’organe, mais elle est aussi cause d’un pourcentage non négligeable (11-32%) de carcinomes hépatocellulaires (CHC), qui surviennent après mutation activatrice du gène codant la β-caténine. Mes travaux se sont inscrits dans la continuité de travaux de l’équipe auxquels j’ai participé , et ont eu pour principaux objectifs : (1) d’explorer le rôle du facteur de transcription Hnf4α dans la physiologie et les cancers du foie, en lien avec la signalisation β-caténine ; (2) de déterminer si une imagerie tumorale par tomographie par émission de positrons (TEP) spécifique de la captation de choline pouvait prédire les CHC mutés pour la β-caténine et si le métabolisme de la choline pouvait présenter une piste thérapeutique des cancers du foie.Pour ces deux projets, j’ai eu accès à des cohortes de patients atteints de cancers du foie, mais j’ai également pu bénéficier du modèle gain-de-fonction de la β-caténine développé au laboratoire, qui consiste en une perte du suppresseur de tumeur Apc, frein majeur de la voie β-caténine conduisant à des cancers du foie. Grâce à un modèle d’invalidation hepato-spécifique et conditionnelle du gène Hnf4α, j’ai pu prouver que la perte de Hnf4α mène à une augmentation de la prolifération, du stockage des lipides dans le foie et à une désorganisation de l’architecture zonale hépatique, en particulier celle de la triade portale. J’ai aussi démontré que dans un contexte de carcinome murin invalidé par Apc, le rôle suppresseur de tumeur d’Hnf4α était mineur.Une approche métabolomique avait montré qu’un signal β-caténine perturbait le métabolisme des phospholipides dérivant de la choline. Grâce à une étude parallèle réalisée chez des patients porteurs de CHC d’une part, et dans nos modèles murins d’autre part, nous avons pu mettre en évidence par TEP une fixation accrue de la F-choline dans les tumeurs activées β-caténine. Ce phénotype est spécifique d’une signalisation β-caténine active puisque cette captation accrue n’était pas présente chez les patients porteurs de carcinome hépatocellulaire non mutés ou chez les souris présentant une cancérogenèse indépendante de la β-caténine (modèle DEN). J’ai ensuite étudié le devenir intracellulaire de la choline. En utilisant de la choline radiomarquée j’ai montré in vitro qu’un signal β-caténine aberrant accroit l’incorporation de choline dans les phospholipides, et accroit également son rôle de donneur de groupements méthyles, participant à la méthylation de l’ADN. Cela pourrait expliquer pourquoi l’ADN est hyperméthylé chez les souris avec la perte d’Apc, puisque l’administration d’un régime sans choline et methionine à ces souris réverse le phénotype d’hyperméthylation. L’ensemble de ces résultats suggère que la choline pourrait jouer un rôle important dans la cancérogenèse liée à la β-caténine. Nous proposons que des TEP F-choline pourraient être utilisés pour diagnostiquer les CHC mutés β-caténine, et à terme des thérapies ciblées sur ce métabolisme pourraient être envisagées. / WNT/β-catenin is a pillar during development and in adult physiology. In particular in the adult liver it is a double-edged sword: it is necessary to establish the metabolic zonation, requirement for having a functional organ, but it is also involved in the onset of 11-32% of hepatocellular carcinoma (HCC). My thesis work has been based on the team previous results and it is focused on two main subjects: (1) the first aim was to decipher the role of Hnf4α both in physiology and in HCC development and its relationship with WNT/β-catenin signalling and (2) the second part explores the possible use of Fluoro-choline (FCh) positron emission tomography (PET) in the diagnosis of β-catenin-activated liver tumours.In this study I used cohorts of patients having HCC, but also inducible and hepatospecific knock-out mice for adenomatous polyposis coli (APC) gene (thereafter called ApcKO mice). Apc is the most important negative regulator of β-catenin, and it hepatic loss leads to aberrant activation of β-catenin, disrupting liver zonation and initiating long-term liver cancers. I generated also inducible hepatospecific Hnf4α knock-out mice and I demonstrated an increased proliferation, lipids accumulation and disorganization in the portal triad architecture, together with a mild distruption of liver zonation. Then, looking at cancer onset, I demonstrated that Hnf4α loss is not able per se to initiate liver cancer, and has no tumour suppressor role in β-catenin activated tumours onset and progression.We performed a metabolic analysis of ApcKO livers, showing that β-catenin is able to deregulate lipids metabolism, in particular that of phospholipids derived from choline. In collaboration with clinicians, I studied human patients who underwent FCh/PET, showing that β-catenin-mutated tumours had an increased uptaken of F-Choline whereas non-mutated β-catenin human HCC had not. Similar results were obtained with mice, either ApcKO β-catenin-activated HCC or β-catenin-independent mice HCC, obtained through a N-diethylinitrosamine (DEN) injection.Choline in cells splits in two main pathways: it is both a methyl-group donor and a precursor for phospholipids production. I tested this through radiolabeled fluxes in in vitro experiments. In β-catenin activated hepatocytes and tumours there are more phospholipids and more methyl groups in DNA derived from choline than in control mice. Moreover in ApcKO DNA is hypermethylated, and it is dependent on choline supply from diet.All these results together show the importance for β-catenin activated tumours to have a supply in choline, and so open a way not only in PET exploitation for having a precise diagnosis, but also in deciphering the importance of choline pathway, to possibly develop a targeted therapy.

Le CHC est souvent diagnostiqué à un stade avancé, stade où les options thérapeutiques sont limitées et le plus souvent palliatives. A l’inverse, les patients diagnostiqués à un stade précoce sont candidats à des traitements curatifs tels que la résection chirurgicale, la radiofréquence et la transplantation hépatique. Le dépistage par échographie des cirrhotiques (surveillance tous les 6 mois) est recommandé par la grande majorité d’experts et les sociétés savantes afin de détecter et traiter le CHC à un stade précoce. Cependant, l’impact du dépistage sur la survie des patients reste controversé en raison des insuffisances méthodologiques des études l’ayant évalué. Parmi les incertitudes méthodologiques, le biais d’avance au diagnostic, qui correspond à un allongement du temps de suivi du à un dépistage plus précoce, n’a le plus souvent pas été pris en compte dans les études ayant évalué l’impact du dépistage. L’approche par modélisation est une option attractive pour l’évaluation du dépistage car la réalisation d’un essai randomisé contrôlé comparant les malades dépistés et non dépistés est irréalisable pour des raisons d’ordre éthique. Dans ce travail, nous avons développé un modèle de la progression du CHC de la date de diagnostic jusqu’au décès. Ce modèle prend en compte l’âge des patients, la connaissance du statut VHC et les principaux facteurs pronostiques du CHC sur cirrhose virale C compensée et décompensée. Il a été alimenté par plusieurs types de données pour fixer les probabilités de transitions dans le modèle, et valider les sorties du modèle. Dans un premier temps, afin d’éviter une surestimation du bénéfice du dépistage, il a été indispensable de calculer le biais d’avance au diagnostic et de l’intégrer dans le calcul de la survie des patients dépistés. Dans un deuxième temps le modèle a évalué l’impact du dépistage du CHC chez les patients ayant une cirrhose virale C compensée et connaissant leur statut VHC. Dans un contexte de cirrhose compensée avec un statut VHC-connu, notre étude montre que le dépistage du CHC réalisé dans la pratique courante (taux d’accès au dépistage = 57%, une efficacité du dépistage correspondant à 42% des patients diagnostiqués à un stade précoce) améliore la survie des patients, avec une augmentation de l’espérance de vie (EV) de 11 mois et une diminution de risque de décès à 5 ans de 6% par rapport à l’absence du dépistage (taux d’accès au dépistage = 0%, 19% des patients non dépistés pour le CHC sont diagnostiqués à un stade précoce). Elle souligne l’importance des deux variables, taux d’accès au dépistage et efficacité du dépistage, sur la survie des patients. Par rapport au dépistage réalisé dans la pratique courante : a) un scénario d’augmentation du taux d’accès au dépistage de 57% à 97% augmente l’EV de 7 mois et diminue le risque de décès à 5 ans de 5% ; b) un scénario d’augmentation de l’efficacité du dépistage de 42% à 87% (dépistage optimal) augmente l’EV de 14 mois et diminue le risque de décès à 5 ans de 9% ; c) un scénario combinant une augmentation de l’efficacité du dépistage à 87% et une augmentation du taux d’accès au dépistage à 97% augmente l’EV de 31 mois et diminue le risque de décès à 5 ans de 20%. Cette étude souligne la nécessité d’une application stricte des modalités de dépistage du CHC, afin d’optimiser son efficacité à diagnostiquer le CHC au stade précoce. Ce travail suggère que les experts devraient cibler leurs recommandations sur l’efficacité du dépistage. De telles recommandations pourraient conduire à discuter de l’expérience et de la qualification des opérateurs et de la qualité du parc des échographes utilisés pour homogénéiser la qualité du dépistage. Finalement, nous avons observé dans un travail préliminaire que le choix optimal de la méthode de correction pour le calcul du biais d’avance au diagnostic devrait prendre en compte la progression tumorale d’un stade asymptomatique vers un stade symptomatique qui diffère d’un cancer à l’autre. / HCC is often diagnosed at an advanced stage, the stage where therapeutic options are limited and mostly palliative. In contrast, the patients who are diagnosed at an earlier stage are candidates for curative treatments such as surgical resection, radiofrequency and liver transplantation. The screening of cirrhotic patients by ultrasound (every 6 months) is recommended by a large majority of experts and specialized societies to detect and treat HCC at an early stage. However, the impact of screening on patients’ survival remains controversial due to its evaluation by the methodological shortcomings of studies. Among the methodological uncertainties, the lead-time bias which corresponds to an extension of the follow-up time which is due to an earlier screening has not often been taken into account in studies that evaluated the impact of screening. The modeling approach is an attractive option for the evaluation of screening because the performance of a randomized controlled trial comparing the screened and the unscreened patients is impossible for ethical reasons. In this work, we developed a model of HCC progression from the date of diagnosis until death. This model takes into account the patient\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\'s age, the awareness of HCV-status and the main prognostic factors for HCC in compensated and decompensated cirrhosis due to HCV. The model was supplied by several types of data to set the probabilities of transitions in it and validate its output. In the first step, in order to avoid an overestimation of the benefit of screening, it was necessary to calculate the lead-time bias and to include it in the calculation of the survival of screened patients. In a second step, the model evaluated the impact of screening for HCC in patients with compensated HCV-related cirrhosis and aware of their HCV-status. In the context of compensated cirrhosis with known HCV-status, our study showed that HCC screening performed in currently existing practices (rate of access to screening = 57%; effectiveness of screening corresponding to 42% of patients diagnosed at an early stage) improves the survival of patients with HCC, with an increase in life expectancy (LE) of 11 months and reduced HCC mortality at 5 years by 6% compared to the absence of screening (rate of access to screening = 0%; 19% of patients who had not been screened for HCC are diagnosed at an early stage). It showed the importance of the two variables, the rates of access to HCC screening and the effectiveness of screening on the survival of patients. Regarding the screening performed in currently existing practices: a) a scenario of increase of the rate of access to HCC screening from 57% to 97% which increases the LE by 7 months and reduces HCC mortality at 5 years by 5%; b) a scenario of increase of the effectiveness of HCC screening from 42% to 87% corresponding to that observed in the randomized trial CHC-2000 (optimal screening) which increases the LE by 14 months and reduces mortality at 5 years by 9%; c) a scenario combining an increase of the effectiveness of HCC screening from 42% to 87% and an increase of the rate of access to HCC screening from 57% to 97% which increases the LE by 31 months and reduces mortality at 5 years by 20%. This study emphasizes the need for strict application of rules of HCC screening in order to optimize its effectiveness to diagnose HCC at an early stage. This work suggests that experts should focus their recommendations on the effectiveness of screening. Such recommendations could lead to discuss the experience and qualification of operators and the quality of the park ultrasound used to standardize homogenize the quality of screening. Finally, we observed in a preliminary work that the optimal choice of the correction method for calculating the lead time bias should take into account the tumor progression from an asymptomatic stage to a symptomatic stage, which differs from a cancer to another.

Dans les régions de fortes endémicités, 70-80% des carcinomes hépatocellulaires sont induits par le VHB. Bien qu’un vaccin prophylactique très efficace existe, il n’est d’aucune utilité pour les 250 millions de personnes chroniquement infectées. Les traitements actuels pour contrôler l'infection chronique par le VHB montrent des limites et le besoin de nouvelles thérapies se fait ressentir. La Polo-like kinase-1 (PLK1), qui joue un rôle essentiel dans la mitose et est surexprimée dans de nombreux cancers, représente une cible prometteuse. Outre son rôle lors de la division cellulaire, PLK1 est impliquée dans la régulation de l'expression des gènes en interphase. Il a été montré que la protéine X du VHB (HBx) active PLK1 dans des modèles de cellules murines. Cependant, il restait à déterminer si PLK1 jouait un rôle au niveau de la réplication du VHB dans des hépatocytes quiescents. Des études récentes ont mis en évidence un lien positif entre l'activation de PLK1 et la réplication du VHB. Le but de ce projet de thèse a été d'étudier le(s) mécanisme(s) par le(s)quel(s) PLK1 jouait un rôle positif sur la réplication virale, avec pour objectif futur d'explorer l’inhibition de PLK1 comme cible antivirale. L'interaction entre PLK1 et la réplication du VHB a d'abord été décrite à l'aide du modèle HepAD38. Dans ce contexte, l'ADN viral est intégré dans le génome hôte, sous le contrôle d'un système d'expression Tet-off. La transcription de l'ARN prégénomique (pgRNA), à la base de la réplication virale, est initiée par la suppression de tétracycline. Dans ce contexte, l'augmentation de l'expression de PLK1 est corrélée avec la régulation négative de deux protéines; SUZ12 et ZNF198, faisant partie de complexes de remodelage de la chromatine. L'inhibition de PLK1 bloque la réplication du VHB, en agissant au niveau de la transcription virale. D'autre part, dans les modèles de réplication du VHB qui miment au mieux une infection, comprenant les hépatocytes primaires humains (PHH) et les cellules non transformées/différenciées HepaRG (dHepaRG), où le VHB se réplique dans des cellules quiescentes, nous avons mis en évidence que: 1) L'inhibition pharmacologique de PLK1 bloque la réplication virale, semblablement en perturbant l’encapsidation du pgRNA via une interaction avec la protéine core du VHB (HBc). 2) Un knocking-down de PLK1 en utilisant des ARN interférents délivrés par nanoparticules lipidiques résulte en une forte baisse de la production de pgRNA et dans la sécrétion des antigènes HBeAg/HBsAg, sans impact sur la viabilité cellulaire. Ce projet a donc permis la preuve de concept que PLK1 pouvait être une cible thérapeutique afin de controler la réplication du VHB. De plus, grâce à la technologie de délivrance par nanoparticules lipidiques d’ARN interférents, nous avons pu cibler spécifiquement les hépatocytes, augmentant de ce fait la spécificité et l’efficacité de nos traitements. Un travail sur la compréhension précise des méchanismes cellulaires impliqués permettra de mieux cerner cette interaction hôte/virus afin de poursuivre le développement de stratégies antivirales innovantes portant sur l’inhibition de PLK1. De manière significative, l'inhibition de PLK1 est non toxique pour les cellules quiescentes par rapport à des cellules cancéreuses à fort taux réplicatif, ce qui fait de PLK1 une cible thérapeutique attrayante. Des inhibiteurs spécifiques sont déjà en essais cliniques pour certains cancers (e.g., Volasertib pour le traitement de la leucémie myéloïde aiguë) et pourraient servir de thérapie bimodale dans le cadre de patients infectés par le VHB, en inhibant la réplication virale, ainsi qu’en prévenant l'émergence de cellules néoplasiques. L'inhibition de la PLK1 est une approche antivirale innovante, qui, en combinaison avec les thérapies actuelles de type IFN-α ou analogues nucléotidiques offre de grandes promesses pour endiguer l'infection chronique par le VHB mais également prévenir les événements carcinogéniques / In highly HBV endemic regions, 70-80% of hepatocellular carcinoma cases are attributable to this virus. Despite the existence of an HBV vaccine, the World Health Organization estimates 240 million individuals are chronically infected with HBV worldwide. Current antiviral treatments to control chronic HBV infections, and consequently reduce the incidence of liver cancer, are ineffective. New and effective therapies are needed not only for fighting the virus but also to prevent HCC emergence or progression. The polo-like-kinase 1 (PLK1), which plays pivotal roles in mitosis and is over-expressed in many human cancers, represents a promising druggable target in oncology. Beside its role during cell division, PLK1 is also thought to be involved in gene expression regulation during interphase. It was shown that the X protein (HBx) could activate PLK1 in murine cell transformation models. Yet it remained to be determined whether PLK1 could also play a role for HBV replication in non-dividing hepatocytes. Our, and collaborators, recent studies have identified a positive link between PLK1 activation and HBV replication. The goal of this thesis project was to investigate the mechanism(s) by which PLK1 exerts a positive effect on HBV replication, with the future goal of exploring PLK1 as an antiviral target. The interplay between PLK1 and HBV replication was firstly described using the HepAD38 cellular model of HBV replication. In this context, the HBV DNA is stably integrated into the host genome, under control of a Tet-off expression system. Transcription of HBV pregenomic RNA (pgRNA), the template of viral replication, is initiated by tetracycline removal. It has been shown that in HBV-replicating HepAD38 cells, increased PLK1 expression correlates with down-regulation of two proteins that are components of chromatin modifying complexes; SUZ12 protein of the PRC2 complex, and ZNF198 of the LSD1-CoREST-HDAC1 complex. PLK1 inhibition was described to inhibit HBV replication by reducing viral transcription. How PLK1 regulates HBV transcription remains unknown. On the other hand, in HBV replication models that resemble physiologic HBV infection, comprised of Primary Human Hepatocytes (PHH) and non-transformed/differentiated HepaRG cells (dHepaRG), where HBV replicates in non-transformed and non-dividing cells, thus enabling the study of the inter-phasic role of PLK1, irrespective of its well-established cell division implication, we have demonstrated that: 1) A pharmacological inhibition of PLK1 suppressed HBV replication by a different mechanism, likely targeting the packaging of pgRNA by the HBV core antigen (HBc). 2) Knocking-down PLK1 using siRNA delivered by lipid nanoparticles (LNP siPLK1) results in a strong drop of HBV DNAs, RNAs and HBe/HBsAg secretion without affecting the cell viability. This thesis project brought the proof of concept that PLK1 could be a drug target in HBV infection. Furthermore, the use of LNP allowed us to improve the delivery of siPLK1 to hepatocytes. Significantly, PLK1 inhibition is not toxic to quiescent cells in comparison to fast growing cancer cells, rendering PLK1 an attractive therapy target. High level of viremia in chronic HBV patients is a risk factor for progression to liver cancer. PLK1 specific inhibitors are already in clinical trials for other types of cancer (e.g., acute myeloid leukaemia) and could serve as bimodal therapy in HBV infected patients, by inhibiting virus replication as well as preventing emergence and spreading of neoplastic cells. This project was part of a full-working group of experts and thus, has beneficiated of a strong support. The proximity of the oncology-specialized hospital, the Centre Léon Bérard provided us with fresh hepatic biopsy [etc...]

Un applicateur ultrasonore interstitiel IRM compatible a été développé pour le traitement percutané du CHC sous contrôle de l'imagerie. Deux grands axes expérimentaux ont été abordés : 1) au cours d'une première expérimentation réalisée in vivo sur le foie de porc, des macro lésions correspondant à la fusion de lésions élémentaires par rotation du transducteur sur 360° ont pu être réalisées par voie percutanée sous contrôle échographique. Les macro lésions obtenues possédaient une taille voisine de celles obtenues en pratique clinique par la RF. De plus, les lésions élémentaires se montraient relativement indifférentes à l'effet de vol de chaleur ; 2) au cours d'une seconde expérimentation réalisée in vitro puis in vivo sur le foie de porc, un contrôle actif par IRM de température a pu être obtenu pour la création de lésions ultrasonores de taille et aspect similaires quelle que soit la direction du faisceau ultrasonore. Ce contrôle de température est apparu d'autant plus important que les puissances appliquées et du temps d'application pour l'obtention de lésions de taille similaire étaient extrêmement variables selon la direction du faisceau ultrasonore.