Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karolinska institutet, 2010.

Thesis (Ph. D.)--University of Nevada, Reno, 1998. / Includes bibliographical references. Online version available on the World Wide Web.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karolinska institutet, 2010.

Thesis (Ph. D.)--Cornell University, May, 2009. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 128-147).

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karolinska institutet, 2009.

Thesis (Ph.D.)--University of Florida, 2005. / Typescript. Title from title page of source document. Document formatted into pages; contains 95 pages. Includes Vita. Includes bibliographical references.

Thesis (Ph.D. in Pharmaceutical Sciences) -- University of Colorado, 2006. / Typescript. Includes bibliographical references (leaves 191-216). Free to UCDHSC affiliates. Online version available via ProQuest Digital Dissertations;

- / -

Στη γονιδιακή θεραπεία, οι κλινικές μελέτες μέχρι τώρα χρησιμοποιούν ιϊκούς φορείς για την μεταφορά του διαγονιδίου στα κύτταρα στόχους. Το DNA των ιϊκών φορέων ενσωματώνεται στο γενετικό υλικό των κυττάρων, και αυτό εμπεριέχει τον μεγάλο κίνδυνο της παρεμβολής στο ενδογενές πρόγραμμα γονιδιακής έκφρασης (μεταλλαξιγένεση λόγω ένθεσης). Μια λύση σε αυτή την ανεπιθύμητη κατάσταση είναι η χρήση επισωματικών φορέων και ιδιαίτερα όσων φέρουν χρωμοσωμικά στοιχεία. Παλαιότερα είχε αναφερθεί ότι ο πρότυπος επισωματικός φορέας pEPI που βασίζεται στο Scaffold /Matrix Attachment Region (S/MAR), παραμένει ως σταθερό επίσωμα για πολλές γενεές σε κυτταρικές σειρές ανθρώπου και ποντικού, αλλά δεν παραμένει για πολλές γενεές σε ανθρώπινα CD34+ κύτταρα. Για να ενισχυθεί η ικανότητα του φορέα να υποστηρίξει την γονιδιακή μεταφορά και συγκράτηση του σε πρωτογενή αρχέγονα/προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα, πρώτον ενισχύθηκε η μεταγραφή του S/MAR χρησιμοποιώντας τους ισχυρούς υποκινητές EF1/HTLV ή SFFV για το διαγονιδίο της eGFP και δεύτερον προστέθηκε μια αλληλουχία έναρξης της αντιγραφής (IR) από το γενετικό τόπο των β σφαιρινικών γονιδίων. Στην εργασία αυτή έγινε μεταφορά των νέων αυτών φορέων με την μέθοδο της πυρινικής ηλεκτροδιάτρησης σε κύτταρα CD34+ που απομονώθηκαν από κινητοποιημένο περιφερικό αίμα δοτών μυελού των οστών τα οποία διαμόλυναν επιτυχώς. Στην συνέχεια τα διαμολυσμένα κύτταρα CD34+ επιλέχθηκαν με FACS και καλλιεργήθηκαν σε θρεπτικό υλικό μεθυλοκυτταρίνης. Μετά την πάροδο 14 ημερών, ανιχνεύτηκε, με μικροσκοπία φθορισμού, έκφραση της eGFP στις τελικά διαφοροποιημένες αιμοποιητικές αποικίες που προέκυψαν. / Gene therapy clinical trials are currently based on integrating viral vectors; this approach presents the major risk of insertional mutagenesis. A solution to this side effect could be the use of episomal vectors and particularly the ones carrying chromosomal elements.We previously reported that the prototype episomal vector pEPI, based on a Scaffold /Matrix Attachment Region (S/MAR), functions as a stable episome for many generations in human and murine hematopoietic cell lines, but mediates very low long term retention in human CD34+ cells. To enhance the vector’s potential for gene transfer into primary hematopoietic stem/progenitor cells, (a) was enforced transcription through the S/MAR by using the strong hybrid EF1/HTLV or SFFV promoters to drive expression of the upstream transgene (eGFP) and (b) was included the replication initiation region (IR) from the β-globin gene locus. In this thesis the new vectors where delivered by nucleofection in CD34+ cells isolated from mobilized peripheral blood of healthy donors; th cells were efficiently transfected. Moreover the the transfected CD34+ cells were separated with FACS and cultured in methylocyttarine containing medium. After 14 days, eGFP expression was readily detected by fluorescence microscopy in the differentiated hematopoietic colonies.

Υποθέσαμε ότι το χρόνιο ιστικό στρες που προκαλείται από τις αλλοαντιδράσεις μετά από αλλογενή Μεταμόσχευση Αιμοποιητικών Κυττάρων (άλλο-ΜΑΚ) μπορεί να επάγει την εμφάνιση γονιδιωματικής αστάθειας (GI) στους επιθηλιακούς ιστούς. Για αυτό, 176 στοματικά επιχρίσματα από 71 ασθενείς μετά από άλλο-ΜΑΚ αναλύθηκαν για την ανίχνευση αστάθειας μικροδορυφορικών αλληλουχιών (microsatellite instability-MSI). Tα αποτελέσματα συσχετίσθηκαν με κλινικές παραμέτρους. Σε ένα in vitro σύστημα ανίχνευσης μεταλλάξεων ελέγξαμε την υπόθεση ότι οι αλλοαντιδράσεις μπορεί να επάγουν τη GI στην κυτταρική σειρά HaCaT. Ανιχνεύθηκε MSI στο 52% των αλλομεταμοσχευμένων ασθενών ενώ δεν ανιχνεύθηκε MSI σε ασθενείς μετά από αυτόλογη ΜΑΚ και υγιείς εθελοντές. Βρέθηκε σημαντική συσχέτιση της εμφάνισης MSI με την ηλικία του ασθενούς και του δότη, τη μεταμόσχευση από γυναίκα σε άνδρα και τον αριθμό CD34+ κυττάρων στο μόσχευμα. Οι ασθενείς με ιστορικό σοβαρού βαθμού αντίδρασης μοσχεύματος εναντίον ξενιστή είχαν μεγαλύτερο σχετικό κίνδυνο για εμφάνιση MSI. Δευτεροπαθής κακοήθεια διαγνώσθηκε σε 5 από τους MSI+ ενώ μόνο σε ένα από τους MSI- ασθενείς. Στο in-vitro σύστημα ανίχνευσης GI παρατηρήθηκε σημαντική επαγωγή μεταλλάξεων και βλάβης του DNA μετά από επώαση των HaCaT κυττάρων με Μεικτή Λεμφοκυτταρική Καλλιέργεια (MLC) ενώ η επίδραση με κυτταροκίνες, υπερκείμενο MLC ή ενεργοποιημένα με PHA περιφερικά μονοπύρηνα κύτταρα δεν προκάλεσε την επαγωγή GI. Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν τη συμμετοχή των ενεργών ριζών οξυγόνου στον υποκείμενο μηχανισμό. Οι in vivo και in vitro μελέτες μας επιβεβαιώνουν ότι παράγοντες που ενέχονται στο αλλοαντιδραστικό μικροπεριβάλλον μετά από άλλο-ΜΑΚ μπορεί να προκαλέσουν GI στο επιθήλιο. Η κατανόηση του υποκείμενου μηχανισμού μπορεί να αναδείξει νέους βιοδείκτες και θεραπευτικούς στόχους. / We hypothesized that chronic tissue stress due to interaction of alloreactive donor cells with host epithelium after allogeneic hematopoietic cell transplantation (allo-HCT) may cause genomic alterations. We therefore analysed 176 buccal samples obtained from 71 unselected allo-transplanted patients for microsatellite instability (MSI). MSI was observed in 52% of allo-transplanted patients but never in 31 healthy or auto-transplanted controls. The patient age, the donor age, a female-to-male transplantation and a low number of CD34+ cells in the graft were significantly correlated with genomic instability. There was a trend for increasing risk of MSI for patients who experienced severe graft-versus-host-disease. Secondary malignancy was diagnosed in 5 (14%) of the MSI+ and only in 1 (3%) MSI- patient. In an in-vitro model of mutation analysis we found significant induction of frameshift mutations and DNA strand breaks in HaCaT keratinocytes co-cultured with Mixed Lymphocyte Cultures (MLC) but not after their exposure to IFN-γ, TNF-α, TGF-β, MLC-supernatant, peripheral blood mononuclear cells (PBMC) or phytohemagglutinin stimulated PBMC. A ROS mediated mechanism is implicated. Our in-vivo and in-vitro data show that alloreactions after allo-HCT may induce genomic alterations in epithelium. Progress in understanding DNA damage and repair after allo-HCT can potentially provide molecular biomarkers and therapeutic targets.