Orientadores: Clarice Weis Arns, Luciana Konecny Kohn / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-21T23:34:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bianchi_BiancaReal_M.pdf: 1619930 bytes, checksum: 92df5dc0e4cba5e4314f506e39ff0be1 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: O vírus herpes simples do tipo 1 (HSV-1), agente etiológico do herpes labial em humanos, é facilmente transmitido e têm o grande problema de causar infecções latentes, sendo que uma vez infectado, o indivíduo passa a ser o portador do vírus por toda a vida. O medicamento mais apropriado contra este tipo de vírus deve ter ação inibitória em qualquer estágio de sua replicação, além de baixa toxicidade, para que as células do hospedeiro não sejam afetadas. Os organismos marinhos representam uma vasta biodiversidade que inclui cerca de 80% de todas as espécies do planeta, o que nos leva a uma grande quantidade de informações que ainda poderão ser descobertas, inclusive acerca de compostos com atividade antiherpética, já que atualmente temos poucos medicamentos disponíveis e nem sempre de total eficácia. Para o estudo com HSV-1 foi escolhida a cepa KOS, por ser resistente ao medicamento considerado mais eficaz para o herpes humano, o aciclovir. Foi utilizada a linhagem celular VERO para o estudo da atividade antiviral de extratos de organismos marinhos. Inicialmente foi realizada uma triagem com 129 extratos. Utilizou-se a concentração de 50?g/ml para todos os extratos, considerando ativos aqueles que apresentaram 97% de inibição do crescimento viral. Dentro dos grupos analisados foram identificados 6 extratos brutos de fungos e 7 extratos brutos de esponjas marinhas como possíveis antivirais. O cálculo do Índice de Seletividade foi realizado para as amostras de fungos Demateaceous (grupo) e Trichoderma sp., apresentando os valores 0,03 e 0,3, com atividade nas fases de adsorção e inativação viral, respectivamente e, para as amostras de esponjas, Monanchora arbuscula e Hemimycale sp., ambas apresentando o valor 0,1, com atividade também nas fases de adsorção e inativação viral, respectivamente / Abstract: Herpes simplex virus type 1 (HSV-1), the etiologic agent of herpes labialis in humans, is transmitted easily and have great problem to cause latent infections, and once infected, the individual becomes the carrier of the virus by life. The most suitable medicament against such virus should have inhibitory action at any stage of its replication as well as low toxicity to the host cells is not impaired. Marine organisms represent a wide biodiversity that includes about 80% of all species on the planet, which leads to a large amount of information that can still be found, including about compounds that may help a possible treatment of symptoms caused by this virus, since currently available medicines have few and not always fully effective. For the study of HSV-1, the KOS strain was chosen because it is resistant to the drug considered most effective for the human herpes, the acyclovir. Was used the cell lines VERO (African Green Monkey - ATCC CCL 81) for the study the antiviral activity of extracts of marine organisms. Initially was realized a screening with 129. We used the concentration of 50?g/ml for all the extracts, whereas those with active 97% inhibition of viral growth. Within the groups analyzed were identified 6 extracts of fungus and 7 crude extracts of marine sponges as possible antiviral. The calculation of the Selectivity Index was conducted for samples of fungi Demateaceous (group) and Trichoderma sp., presenting the values 0.03 and 0.3 with activity phases of adsorption and viral inactivation, respectively, and for samples of sponges, Monanchora arbuscula and Hemimycale sp. both presenting the value 0.1, with activity also in the phases of adsorption and viral inactivation, respectively / Mestrado / Clinica Medica / Mestra em Ciências

Submitted by Biblioteca da Faculdade de Farmácia (bff@ndc.uff.br) on 2017-03-28T16:51:43Z No. of bitstreams: 1 Oliveira, Rafael Portugal Rizzo Franco de [Dissertação, 2014].pdf: 2189274 bytes, checksum: ea08452f36c971680598c7fa0742290c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-28T16:51:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira, Rafael Portugal Rizzo Franco de [Dissertação, 2014].pdf: 2189274 bytes, checksum: ea08452f36c971680598c7fa0742290c (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A busca por medicamentos mais seguros e com menores efeitos adversos levou o homem a desenvolver novas tecnologias de formulação. Neste contexto, a nanotecnologia tem contribuído para o surgimento de medicamentos cada vez mais específico para a doença a qual está destinado a tratar. O vírus Herpes simplex (HSV) é um patógeno muito conhecido pelo homem e estima-se que grande parte da população já esteja contaminada de maneira assintomática. Nas infecções bacterianas têm se tornado cada vez mais comum o surgimento de cepas resistentes aos antibióticos, por isso a descoberta de novos ativos antimicrobianos se torna cada dia mais essencial. Os flavonoides são metabolitos especiais que garantem às plantas resistência a microrganismos, tornando-se por isso, bastante promissores no desenvolvimento de novos agentes antivirais e antibacterianos. O presente estudo tem como objetivo elaborar uma nanoemulsão a base do extrato rico em flavonóides extraídos das folhas de Ocotea notata e avaliar suas atividades biológicas. O extrato de O. notata foi obtido por maceração e a análise de sua atividade antiviral demonstrou que esses possuíam percentual de inibição superior a 99% frente ao HSV tipos 1 e 2. Além disto, foi demonstrada a atividade antibacteriana desse extrato frente a quatro cepas bacterianas: S. aureus (MIC = 0,31 mg/mL), E. coli (MIC = 5,0 mg/mL), P. aeruginosa (MIC = 2,5 mg/mL) e Salmonella (MIC = 2,5 mg/mL).Uma nanoemulsão estável constituída de Miristato de isopropila, Transcutol®, Tween® 80, água e 1% (p/p) dos flavonoides de O. notata foi desenvolvida e avaliada quanto às atividades descritas. Como esperado, a nanoemulsão não apresentou atividade, uma vez que a concentração do ativo incorporada à formulação foi muito pequena (1%) não sendo possível observar as atividades biológicas nos modelos testados. Faz-se necessário, portanto, mais estudos para o desenvolvimento de um produto contendo o extrato de O. notata a fim de otimizar sua eficácia / The search for safer and minor adverse effects has led man to develop new technologies formulation that increases patient comfort. In this context, nanotechnology has contributed to the emergence of more specific drugs for the disease which is intended to treat. Herpes simplex virus (HSV) is a pathogen well known by man and it is estimated that a great part of the population is already infected asymptomatically. In bacterial infections has become the emergence of antibiotic-resistant strains, so the discovery of new antimicrobial active is becoming most essential. Flavonoids are special plant metabolites which guarantee resistance to microorganisms, making it therefore very promising in the development of new antiviral and antibacterial agents. This study aims to develop a nanoemulsion base of flavonoids extracted from leaves of Ocotea notata and evaluate their biological activities. Flavonoids of O. notata were extracted by maceration and analysis of its antiviral activity demonstrated that these had higher inhibition percentage at 99% compared to HSV types 1 and 2. Furthermore, we demonstrated the antiviral activity extract against four bacterial strains: S. aureus (MIC = 0.31 mg / ml), E. coli (MIC = 5.0 mg / ml), P. aeruginosa (MIC = 2.5 mg / ml) and Salmonella (MIC = 2.5 mg / ml). A stable nanoemulsion consisting of isopropyl myristate, Transcutol®, Tween® 80, and 1% (w/w) of the flavonoids of O. notata was developed and evaluated with respect to the described activities. As expected, the nanoemulsion showed no biological activity, once the concentrations of the active incorporated in the formulation was very small (1%) in the tested models.. It is necessary, therefore, further studies to the development of a product containing extract of O. notata in order to optimize its effectiveness

A infecção primária com o herpesvirus humano tipo 6 (HHV-6) pode resultar no exantema súbito, encefalite e recorrentes complicações. Pesquisas demonstram que crianças obtêm os anticorpos contra o HHV-6 antes dos dois anos de idade. Após a infecção primária, o DNA do HHV-6 permanece latente em linfócitos, saliva ou líquor. A rota de transmissão permanece controversa. A liberação do HHV-6 em saliva parece ser a maior rota de transmissão. A transmissão intra-uterina, integrada no cromossomo é outra sugestão de transmissão. Foram colhidas 172 amostras, 86 de secreção cervical (mãe) e 86 de aspirado de nasofaringe (filho). Utilizamos a técnica de nested PCR para detecção do DNA viral do HHV-6. Das amostras positivas, 64% foram detectadas na secreção cervical. A positividade mãe-recém nascido foi de 14%. Das amostras de nasofaringe positivas, 25% não tiveram pareamento de positividade com as secreções cervicais de suas mães. Com estes resultados sugerimos que está existindo uma passagem viral do HHV-6, da mãe para o seu recém-nascido antes do nascimento. / The primary infection with the human herpesvirus type 6 (HHV-6) can result in sudden exanthema, encephalitis and recurrent complications. Research data show that children obtain antibodies against the HHV-6 before two years old. After the primary infection, the HHV-6 DNA remains latent in lymphocytes, saliva, or spinal fluid. The transmission route remains controverse. The HHV-6 elimination of saliva seems to be the major transmission route. Intrauterine transmission, integrated in the chromosomes, is another suggested route of transmission. A total of 172 samples was collected, including 86 cervical secretion samples (mother) and 86 nasopharyngeal aspirates (newborn). We used the nested PCR technique for HHV-6 DNA detection. Among the positive samples, 64% were detected in cervical secretion. The co-positivity between mother and newborn was 14%. Among the positive nasopharyngeal samples, 25% did not present co-positivity with the cervical secretion samples of the respective mothers. Based on our results, we suggest the existence of HHV-6 transference from the mother to the fetus before birth.

Determina la asociación de la presencia de anticuerpos neutralizantes contra el virus Herpes Equino tipo 1 (VHE-1) / virus Herpes Equino tipo 4 y problemas reproductivos en yeguas de tres criaderos de caballo peruano de paso del distrito de Cieneguilla. Se colectaron muestras de suero (n=60) de todas las yeguas mayores a 3 años de edad, para la detección de anticuerpos neutralizantes contra VHE-1/VHE-4 mediante la prueba de neutralización viral. Realiza el análisis de registro de los tres criaderos para identificar a las yeguas con presencia y ausencia de problemas reproductivos en sus últimos dos años (2013-2015). El 76.67% (46/60) de las muestras tuvieron anticuerpos contra VHE-1/VHE-4. Los resultados muestran que el 57% (34/60) de las yeguas presentaron problemas reproductivos. El porcentaje de seropositividad en el criadero A fue del 100% (11/11), en el criadero B fue de 66.67% (16/24) y en el criadero C fue de 76% (19/25). Los títulos de anticuerpos neutralizantes tuvieron un rango entre 1:2 a ≥1:256, siendo los títulos de 1:2 a 1:8 presentes en el 28.3% de las muestras, de 1:16 a 1:64 en 43.5% y 1:128 a ≥1:256 en 28.3% de las muestras. La prueba Chi-cuadrado no muestra resultados significativos (p>0.05) para determinar la asociación entre la presencia de anticuerpos neutralizantes contra VHE-1/VHE-4 y los problemas reproductivos en yeguas. / Tesis

AIMS OF THE STUDY: 1. To perform a retrospective, epidemiological analysis of cases of reactive lymphadenopathy and atypical reactive lymphoid hyperplasia (ARLH) received in the Department of Anatomical Pathology, UCT and GSH, over a 5 year period, in order to determine the number of cases of ARLH, and the frequency of the various subtypes of reactive lymphoid. hyperplasia, so as to provide base-line information for further studies. 2. To set up IN SITU HYBRIDIZATION (ISH) for detection of Epstein-Barr virus (EBV)-encoded RNA's (EBERs) in latently infected cells in selected cases, to determine if virus is present in ARLH. 3. To perform immunohistochemical analysis for the detection of EBY-derived latent membrane protein (LMP) in those cases subjected to ISH.

Equine herpesvirus type 1 (EHV-1) is a common pathogen of horses that typically causes upper respiratory disease, however is also associated with late-term abortion, neonatal foal death and neurologic disease. Once a horse is infected, the virus concentrates to local lymphoid tissue, where it becomes latent. The virus can recrudesce during times of stress, which can lead to the initiation of devastating outbreaks. Some variants of EHV-1 have been associated with more severe disease outcomes. Appropriate outbreak management focuses on minimizing the movement of potentially exposed horses. This approach lacks a strategy for prevention at the level of latency largely due to a knowledge paucity in regards to carriage rate of latent EHV-1. Biosecurity decisions are also dependent on awaiting currently-available diagnostic testing that often take several days for results. Thus, our work has been focused on understanding the carriage rate of the latent virus in different geographic regions as well as improving diagnostic efficiency, both of which are essential for improving the management of EHV-1 disease. Loop mediated isothermal amplification (LAMP) is a method that amplifies nucleic acid rapidly at a constant temperature and is minimally affected by inhibitors that are often found in clinical samples. This procedure can be followed by multiple detection methods. A new, efficient sequencing method, called nanopore sequencing, has been developed in a handheld device, called MinION, that provides thorough output in a timely manner. When combined with LAMP, it has been referred to as LAMPore. The first objective of our work was to estimate the prevalence of latent EHV-1 and compare the frequency of each variant in the submandibular lymph nodes from horses in Virginia. Our second objective was to perform direct DNA sequencing of EHV-1 using the mobile MinION sequencer in combination with LAMP viral enrichment. Our findings demonstrated a low apparent prevalence of latent EHV-1 DNA in submandibular lymph nodes in this population of horses in Virginia as well as successful detection and identification of EHV-1 in equine nasal swab samples using LAMPore sequencing. / Doctor of Philosophy / Horses can develop disease from a virus called equine herpesvirus type 1 (EHV-1). Symptoms can vary from mild respiratory signs to the inability to rise leading to death or euthanasia. Horses transmit this virus to other nearby horses; however, the virus also becomes dormant once a horse is infected, meaning the virus is not infectious but is present within the animal. When the horse undergoes stress, such as during travel or competition, the virus can become active again, leading to the spread to other horses. This results in outbreaks, many of which are devastating to the equine industry. In order to minimize the risks of this virus spreading and causing disease, management is currently focused on minimizing the movement of horses that may have been exposed to the virus. There is little information regarding the number of horses that harbor the dormant virus and the current methods to detect the infectious virus can take multiple days for results. These limit decision-making during the management of an outbreak. Our work seeks to determine the number of horses in a region that harbor EHV-1 and also to test a new, efficient diagnostic method to identify the virus in samples from horses. Our findings showed a low number of horses in Virginia harbor dormant EHV-1 in the lymph nodes under their mandible, a common site of dormancy. Further, we found that our new method of detection was effective in identifying the virus in samples from nasal secretions from horse.

O presente estudo foi conduzido com o objetivo de determinar se a sensibilidade do teste de Soroneutralização (SN) seria afetada quando utilizados distintos subtipos de herpesvírus bovino tipos 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5). Dessa forma, soros de bovinos, coletados randomicamente (n= 287) foram testados por SN frente a três amostras de BoHV-1 (BoHV-1.1: EVI123/98 e Los Angeles (LA); BoHV-1.2a: SV265/96) e três amostras de BoHV-5 (BoHV-5a: EVI88/95; BoHV-5b: A663 e BoHV-5c: ISO 97/95), utilizando um período de incubação soro-vírus de 24 horas. A sensibilidade da SN variou significativamente dependendo da amostra viral utilizada. Esta variação foi de 77% (80/104 soros positivos) até 91% (95/104) com as amostras ISO 97/95 e LA, respectivamente, quando cada vírus foi considerado individualmente. A sensibilidade máxima (104/104) foi obtida quando os resultados positivos de uma combinação particular de quatro vírus (LA + EVI123 + SV265 + A663), algumas combinações de cinco vírus, ou ainda, todos os seis vírus foram adicionados. Estes resultados evidenciaram que quando a SN é realizada frente a uma única amostra viral, a sensibilidade pode variar significativamente, podendo comprometer programas de controle e erradicação das infecções por estes agentes. Além disso, a realização de SN frente a diferentes isolados virais mostrou aumentar significativamente a sensibilidade do teste. Com isso, a caracterização de novos isolados de campo pode favorecer futuras avaliações de diferentes subtipos de BoHV-1 e BoHV-5 e contribuir com a escolha de amostra e/ou combinação de amostras mais sensíveis. Deste modo, buscou-se caracterizar isolados de campo de BoHV-1 e BoHV-5 com base na análise molecular da região carboxi-terminal do gene que codifica a glicoproteína C (gC) e na análise com enzima de restrição (REA) do genoma viral. Para tanto, a multiplicação de 24 isolados da América do Sul foi realizada em células CRIB para posterior extração do DNA viral, PCR e sequenciamento. As seqüências foram alinhadas utilizando o programa ClustalX2 para uma inferência filogenética pelo método de Neighbor-Joining (Mega 4.0), Kimura 2-parâmetros. O alinhamento das seqüências de nucleotídeos revelou níveis de identidade variando de 70 a 99,6% entre os isolados de BoHV-1; de 66,9 a 100% entre os isolados de BoHV-5 e de 62,9 a 92,8% entre os isolados BoHV-1 e BoHV-5. A árvore filogenética mostrou o agrupamento dos vírus de acordo com o tipo (BoHV-1 e BoHV-5) e subtipo de BoHV-1 (BoHV-1.1 e BoHV-1.2). No entanto, essa técnica não permitiu a diferenciação dos isolados em diferentes subtipos de BoHV-5. Do mesmo modo, a análise por restrição enzimática não proporcionou uma clara diferenciação dos isolados em subtipos devido à presença de variações nos padrões de restrição. Somente um isolado (ISO 94/232) pode ser diferenciado como subtipo 5a. Todavia, este estudo mostrou que a análise filogenética utilizada representa uma potencial ferramenta para a diferenciação e classificação dos vírus em BoHV-1.1, BoHV-1.2 e BoHV-5. No entanto, ambas as técnicas podem ser empregadas, de maneira complementar, quando maiores informações sobre estes vírus forem requeridas. Além disso, com o presente estudo, foi possível expandir o número de amostras caracterizadas, fornecendo subsídios para estudos futuros. / This study was carried out to determine whether the sensitivity of serum neutralization (SN) tests would be affected by the use of distinct subtypes of bovine herpesvirus 1 (BoHV- 1) and 5 (BoHV-5) as test challenge viruses. Bovine sera collected from a randomized sample (n = 287) were tested in a 24 hour incubation SN against three type 1 viruses (BoHV-1.1 strains „„Los Angeles‟‟ (LA) and „„EVI 123‟‟; BoHV-1.2a strain „„SV 265‟‟) and three type 5 viruses (BoHV-5a strain „„EVI 88‟‟; BoHV-5b strain „„A 663‟‟ and BoHV-5c „„ISO 97‟‟). SN sensitivity varied greatly depending on the challenge virus used in the test, particularly when results against each virus were considered individually, where it ranged from 77% (detecting 80 out of 104 antibody-positive sera) to 91% (95/104) with ISO 97/95 and LA strain, respectively. Maximum sensitivity (104/104) was achieved when positive results to a particular combination of four of the challenge viruses (LA + EVI 123 + SV 265 + A 663) or some combinations of five viruses (or all six viruses) were added cumulatively. These results clearly shown that when SN is performed with single test challenge viruses, sensitivity could vary significantly that might compromise control or eradication efforts. Performing SN against a number of different viruses demonstrated to improve significantly the test‟s sensitivity. Thus, news field isolates characterization could aid future evaluations of different BoHV-1 and BoHV-5 subtypes and also provide the better strain and/or strains combination choice. In such case, this study aimed to characterize field isolates of BoHV-1 and BoHV-5 by molecular analyses of glycoprotein C (gC) carboxy-terminal region and viral genome restriction enzymatic analysis (REA). The 24 isolates from South America were propagated in CRIB cells for viral DNA extraction, PCR and sequencing. The sequences were aligned in ClustalX2 to perform a distance–based phylogenetic analysis by Neighbor-Joining method in MEGA 4.0 software under de Kimura 2-parameter. The nucleotide sequence alignments revealed levels of genomic similarity ranging from 70% to 99.6% between BoHV-1 isolates; from 67% to 100% among BoHV-5 isolates and from 63% to 93% between BoHV-1 and BoHV-5 isolates. The phylogenetic tree clustered the viruses according to types (BoHV-1 and BoHV-5) and BoHV-1 subtypes (BoHV-1.1, -1.2). However, this method did not allow clearly differentiated in BoHV-5 subtypes. Likewise, REA did not clear showed differentiation in subtypes due presence variation in restriction pattern. Only one isolate (ISO 94/232) could be differentiated in subtype 5a. The results suggest that the phylogenetic analysis performed could be an important tool for differentiation and classification of such viruses in BoHV-1.1, BoHV-1.2, BoHV-5. However, when adiccional informations were resquested both techniques should be performed. Furthermore, with this work it was possible to expand the number of samples characterized to support future investigation of these viruses.

O presente estudo foi conduzido com o objetivo de determinar se a sensibilidade do teste de Soroneutralização (SN) seria afetada quando utilizados distintos subtipos de herpesvírus bovino tipos 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5). Dessa forma, soros de bovinos, coletados randomicamente (n= 287) foram testados por SN frente a três amostras de BoHV-1 (BoHV-1.1: EVI123/98 e Los Angeles (LA); BoHV-1.2a: SV265/96) e três amostras de BoHV-5 (BoHV-5a: EVI88/95; BoHV-5b: A663 e BoHV-5c: ISO 97/95), utilizando um período de incubação soro-vírus de 24 horas. A sensibilidade da SN variou significativamente dependendo da amostra viral utilizada. Esta variação foi de 77% (80/104 soros positivos) até 91% (95/104) com as amostras ISO 97/95 e LA, respectivamente, quando cada vírus foi considerado individualmente. A sensibilidade máxima (104/104) foi obtida quando os resultados positivos de uma combinação particular de quatro vírus (LA + EVI123 + SV265 + A663), algumas combinações de cinco vírus, ou ainda, todos os seis vírus foram adicionados. Estes resultados evidenciaram que quando a SN é realizada frente a uma única amostra viral, a sensibilidade pode variar significativamente, podendo comprometer programas de controle e erradicação das infecções por estes agentes. Além disso, a realização de SN frente a diferentes isolados virais mostrou aumentar significativamente a sensibilidade do teste. Com isso, a caracterização de novos isolados de campo pode favorecer futuras avaliações de diferentes subtipos de BoHV-1 e BoHV-5 e contribuir com a escolha de amostra e/ou combinação de amostras mais sensíveis. Deste modo, buscou-se caracterizar isolados de campo de BoHV-1 e BoHV-5 com base na análise molecular da região carboxi-terminal do gene que codifica a glicoproteína C (gC) e na análise com enzima de restrição (REA) do genoma viral. Para tanto, a multiplicação de 24 isolados da América do Sul foi realizada em células CRIB para posterior extração do DNA viral, PCR e sequenciamento. As seqüências foram alinhadas utilizando o programa ClustalX2 para uma inferência filogenética pelo método de Neighbor-Joining (Mega 4.0), Kimura 2-parâmetros. O alinhamento das seqüências de nucleotídeos revelou níveis de identidade variando de 70 a 99,6% entre os isolados de BoHV-1; de 66,9 a 100% entre os isolados de BoHV-5 e de 62,9 a 92,8% entre os isolados BoHV-1 e BoHV-5. A árvore filogenética mostrou o agrupamento dos vírus de acordo com o tipo (BoHV-1 e BoHV-5) e subtipo de BoHV-1 (BoHV-1.1 e BoHV-1.2). No entanto, essa técnica não permitiu a diferenciação dos isolados em diferentes subtipos de BoHV-5. Do mesmo modo, a análise por restrição enzimática não proporcionou uma clara diferenciação dos isolados em subtipos devido à presença de variações nos padrões de restrição. Somente um isolado (ISO 94/232) pode ser diferenciado como subtipo 5a. Todavia, este estudo mostrou que a análise filogenética utilizada representa uma potencial ferramenta para a diferenciação e classificação dos vírus em BoHV-1.1, BoHV-1.2 e BoHV-5. No entanto, ambas as técnicas podem ser empregadas, de maneira complementar, quando maiores informações sobre estes vírus forem requeridas. Além disso, com o presente estudo, foi possível expandir o número de amostras caracterizadas, fornecendo subsídios para estudos futuros. / This study was carried out to determine whether the sensitivity of serum neutralization (SN) tests would be affected by the use of distinct subtypes of bovine herpesvirus 1 (BoHV- 1) and 5 (BoHV-5) as test challenge viruses. Bovine sera collected from a randomized sample (n = 287) were tested in a 24 hour incubation SN against three type 1 viruses (BoHV-1.1 strains „„Los Angeles‟‟ (LA) and „„EVI 123‟‟; BoHV-1.2a strain „„SV 265‟‟) and three type 5 viruses (BoHV-5a strain „„EVI 88‟‟; BoHV-5b strain „„A 663‟‟ and BoHV-5c „„ISO 97‟‟). SN sensitivity varied greatly depending on the challenge virus used in the test, particularly when results against each virus were considered individually, where it ranged from 77% (detecting 80 out of 104 antibody-positive sera) to 91% (95/104) with ISO 97/95 and LA strain, respectively. Maximum sensitivity (104/104) was achieved when positive results to a particular combination of four of the challenge viruses (LA + EVI 123 + SV 265 + A 663) or some combinations of five viruses (or all six viruses) were added cumulatively. These results clearly shown that when SN is performed with single test challenge viruses, sensitivity could vary significantly that might compromise control or eradication efforts. Performing SN against a number of different viruses demonstrated to improve significantly the test‟s sensitivity. Thus, news field isolates characterization could aid future evaluations of different BoHV-1 and BoHV-5 subtypes and also provide the better strain and/or strains combination choice. In such case, this study aimed to characterize field isolates of BoHV-1 and BoHV-5 by molecular analyses of glycoprotein C (gC) carboxy-terminal region and viral genome restriction enzymatic analysis (REA). The 24 isolates from South America were propagated in CRIB cells for viral DNA extraction, PCR and sequencing. The sequences were aligned in ClustalX2 to perform a distance–based phylogenetic analysis by Neighbor-Joining method in MEGA 4.0 software under de Kimura 2-parameter. The nucleotide sequence alignments revealed levels of genomic similarity ranging from 70% to 99.6% between BoHV-1 isolates; from 67% to 100% among BoHV-5 isolates and from 63% to 93% between BoHV-1 and BoHV-5 isolates. The phylogenetic tree clustered the viruses according to types (BoHV-1 and BoHV-5) and BoHV-1 subtypes (BoHV-1.1, -1.2). However, this method did not allow clearly differentiated in BoHV-5 subtypes. Likewise, REA did not clear showed differentiation in subtypes due presence variation in restriction pattern. Only one isolate (ISO 94/232) could be differentiated in subtype 5a. The results suggest that the phylogenetic analysis performed could be an important tool for differentiation and classification of such viruses in BoHV-1.1, BoHV-1.2, BoHV-5. However, when adiccional informations were resquested both techniques should be performed. Furthermore, with this work it was possible to expand the number of samples characterized to support future investigation of these viruses.

O presente estudo foi conduzido com o objetivo de determinar se a sensibilidade do teste de Soroneutralização (SN) seria afetada quando utilizados distintos subtipos de herpesvírus bovino tipos 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5). Dessa forma, soros de bovinos, coletados randomicamente (n= 287) foram testados por SN frente a três amostras de BoHV-1 (BoHV-1.1: EVI123/98 e Los Angeles (LA); BoHV-1.2a: SV265/96) e três amostras de BoHV-5 (BoHV-5a: EVI88/95; BoHV-5b: A663 e BoHV-5c: ISO 97/95), utilizando um período de incubação soro-vírus de 24 horas. A sensibilidade da SN variou significativamente dependendo da amostra viral utilizada. Esta variação foi de 77% (80/104 soros positivos) até 91% (95/104) com as amostras ISO 97/95 e LA, respectivamente, quando cada vírus foi considerado individualmente. A sensibilidade máxima (104/104) foi obtida quando os resultados positivos de uma combinação particular de quatro vírus (LA + EVI123 + SV265 + A663), algumas combinações de cinco vírus, ou ainda, todos os seis vírus foram adicionados. Estes resultados evidenciaram que quando a SN é realizada frente a uma única amostra viral, a sensibilidade pode variar significativamente, podendo comprometer programas de controle e erradicação das infecções por estes agentes. Além disso, a realização de SN frente a diferentes isolados virais mostrou aumentar significativamente a sensibilidade do teste. Com isso, a caracterização de novos isolados de campo pode favorecer futuras avaliações de diferentes subtipos de BoHV-1 e BoHV-5 e contribuir com a escolha de amostra e/ou combinação de amostras mais sensíveis. Deste modo, buscou-se caracterizar isolados de campo de BoHV-1 e BoHV-5 com base na análise molecular da região carboxi-terminal do gene que codifica a glicoproteína C (gC) e na análise com enzima de restrição (REA) do genoma viral. Para tanto, a multiplicação de 24 isolados da América do Sul foi realizada em células CRIB para posterior extração do DNA viral, PCR e sequenciamento. As seqüências foram alinhadas utilizando o programa ClustalX2 para uma inferência filogenética pelo método de Neighbor-Joining (Mega 4.0), Kimura 2-parâmetros. O alinhamento das seqüências de nucleotídeos revelou níveis de identidade variando de 70 a 99,6% entre os isolados de BoHV-1; de 66,9 a 100% entre os isolados de BoHV-5 e de 62,9 a 92,8% entre os isolados BoHV-1 e BoHV-5. A árvore filogenética mostrou o agrupamento dos vírus de acordo com o tipo (BoHV-1 e BoHV-5) e subtipo de BoHV-1 (BoHV-1.1 e BoHV-1.2). No entanto, essa técnica não permitiu a diferenciação dos isolados em diferentes subtipos de BoHV-5. Do mesmo modo, a análise por restrição enzimática não proporcionou uma clara diferenciação dos isolados em subtipos devido à presença de variações nos padrões de restrição. Somente um isolado (ISO 94/232) pode ser diferenciado como subtipo 5a. Todavia, este estudo mostrou que a análise filogenética utilizada representa uma potencial ferramenta para a diferenciação e classificação dos vírus em BoHV-1.1, BoHV-1.2 e BoHV-5. No entanto, ambas as técnicas podem ser empregadas, de maneira complementar, quando maiores informações sobre estes vírus forem requeridas. Além disso, com o presente estudo, foi possível expandir o número de amostras caracterizadas, fornecendo subsídios para estudos futuros. / This study was carried out to determine whether the sensitivity of serum neutralization (SN) tests would be affected by the use of distinct subtypes of bovine herpesvirus 1 (BoHV- 1) and 5 (BoHV-5) as test challenge viruses. Bovine sera collected from a randomized sample (n = 287) were tested in a 24 hour incubation SN against three type 1 viruses (BoHV-1.1 strains „„Los Angeles‟‟ (LA) and „„EVI 123‟‟; BoHV-1.2a strain „„SV 265‟‟) and three type 5 viruses (BoHV-5a strain „„EVI 88‟‟; BoHV-5b strain „„A 663‟‟ and BoHV-5c „„ISO 97‟‟). SN sensitivity varied greatly depending on the challenge virus used in the test, particularly when results against each virus were considered individually, where it ranged from 77% (detecting 80 out of 104 antibody-positive sera) to 91% (95/104) with ISO 97/95 and LA strain, respectively. Maximum sensitivity (104/104) was achieved when positive results to a particular combination of four of the challenge viruses (LA + EVI 123 + SV 265 + A 663) or some combinations of five viruses (or all six viruses) were added cumulatively. These results clearly shown that when SN is performed with single test challenge viruses, sensitivity could vary significantly that might compromise control or eradication efforts. Performing SN against a number of different viruses demonstrated to improve significantly the test‟s sensitivity. Thus, news field isolates characterization could aid future evaluations of different BoHV-1 and BoHV-5 subtypes and also provide the better strain and/or strains combination choice. In such case, this study aimed to characterize field isolates of BoHV-1 and BoHV-5 by molecular analyses of glycoprotein C (gC) carboxy-terminal region and viral genome restriction enzymatic analysis (REA). The 24 isolates from South America were propagated in CRIB cells for viral DNA extraction, PCR and sequencing. The sequences were aligned in ClustalX2 to perform a distance–based phylogenetic analysis by Neighbor-Joining method in MEGA 4.0 software under de Kimura 2-parameter. The nucleotide sequence alignments revealed levels of genomic similarity ranging from 70% to 99.6% between BoHV-1 isolates; from 67% to 100% among BoHV-5 isolates and from 63% to 93% between BoHV-1 and BoHV-5 isolates. The phylogenetic tree clustered the viruses according to types (BoHV-1 and BoHV-5) and BoHV-1 subtypes (BoHV-1.1, -1.2). However, this method did not allow clearly differentiated in BoHV-5 subtypes. Likewise, REA did not clear showed differentiation in subtypes due presence variation in restriction pattern. Only one isolate (ISO 94/232) could be differentiated in subtype 5a. The results suggest that the phylogenetic analysis performed could be an important tool for differentiation and classification of such viruses in BoHV-1.1, BoHV-1.2, BoHV-5. However, when adiccional informations were resquested both techniques should be performed. Furthermore, with this work it was possible to expand the number of samples characterized to support future investigation of these viruses.

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