A conversão de biomassa vegetal em produtos químicos e energia é essencial a fim de sustentar o nosso modo de vida atual. O bagaço de cana-de-açúcar, matériaprima disponível em abundância no Brasil, poderá tanto ajudar a suprir a crescente demanda pelo etanol combustível como ser empregado para obtenção de produtos de valor agregado, tais como xilitol, além de trazer vantagens econômicas para o setor sucroalcooleiro. O xilitol, um poliol com poder adoçante semelhante ao da sacarose e com propriedades peculiares, como metabolismo independente de insulina, anticariogenicidade e aplicações na área clínica, no tratamento de osteoporose e de doenças respiratórias, é obtido em escala comercial por catálise química de materiais lignocelulósicos. A produção biotecnológica de xilitol como alternativa ao processo químico vem sendo pesquisada e os resultados revelam que a presença de compostos tóxicos nos hidrolisados hemicelulósicos resultantes do processo de hidrólise ácida contribui para sua baixa fermentabilidade. Isto se deve à inibição do metabolismo microbiano causada principalmente por compostos tais como ácidos orgânicos, fenólicos e íons metálicos. No presente trabalho foi avaliado o efeito de diferentes fontes de carbono (xilose, glicose e mistura de xilose e glicose) empregadas no preparo do inóculo de Candida guilliermondii FTI 20037 sobre a bioconversão de xilose em xilitol a partir de fermentações em frascos Erlenmeyer de hidrolisados hemicelulósicos submetidos a procedimentos de destoxificação. A condição de favorecimento deste bioprocesso foi empregada para a avaliação da ampliação de escala em fermentadores de 2,4L para 16L, utilizando como critério de ampliação o KLa (igual a 15h-1). De acordo com os resultados, os máximos valores dos parâmetros fermentativos como fator de conversão de xilose em xilitol e produtividade em xilitol foram alcançados com a utilização de inóculo obtido em xilose durante fermentação do hidrolisado destoxificado por resinas (YP/S = 0,81 g g-1 e QP = 0,60 g L-1 h-1, respectivamente), embora o emprego de carvão ativado tenha gerado valores de rendimento próximos para as diferentes fontes de carbono (YP/S variando de 0,78 a 0,80 g g-1). Considerando o valor de fator de conversão e que o procedimento de destoxificação com carvão ativado é o de menor custo e de mais fácil manipulação em comparação ao processo com resinas, os experimentos de ampliação de escala da produção de xilitol por C. guilliermondii foram realizados nesta condição de destoxificação e empregando-se xilose como fonte de carbono para o inóculo. Nesta etapa ficou evidente a viabilidade de ampliação de escala de produção de xilitol de fermentador de 2,4L para 16L, já que os valores dos parâmetros fermentativos avaliados foram semelhantes entre os fermentadores (valores médios: YP/S ≈ 0,68 g g-1 e QP ≈ 0,28 g L-1 h-1). No entanto, tais valores foram inferiores aos obtidos em frascos Erlenmeyer, possivelmente devido às condições de disponibilidade de oxigênio diferirem nos fermentadores de bancada, uma vez que o oxigênio é o parâmetro mais crítico neste bioprocesso. / The conversion of vegetable biomass into chemicals and energy is essential to sustain our current style of life. Sugarcane bagasse, a raw material abundantly available in Brazil, greatly contributes to the supply of the evergrowing demand for ethanol. Furthermore, biomass can be employed for obtaining value-added products, such as xylitol, as well as bring economical advantages for the sugar-ethanol sector. Xylitol, a polyol with sweetener power similar to that of saccharose and peculiar properties such as insulin-independent metabolism, anticariogenic power, and applications in the clinical area, in the treatment of osteoporosis and respiratory diseases, is obtained on a commercial scale by chemical catalysis of lignocellulosic materials. The biotechnological production of xylitol as an alternative to the chemical process has been researched and the results reveal that the presence of toxic compounds in hemicelllosics hydrolysates resulting from acid hydrolysis process contributes to its low fermentability. Such toxicity could be due to the inhibition of microbial metabolism promoted mainly by compounds such as organic acids, phenols and metallic ions. In the present work, the effect of different carbon sources (xylose, glucose and a mixture of xylose and glucose) used in the inoculum preparation of Candida guilliermondii FTI 20037 for the xylose-to-xylitol bioconversion by fermentation of hemicellulosics hydrolysates submitted to detoxification procedures in Erlenmeyer flasks was evaluated. The best condition for this bioprocess was employed to evaluate the scale up from the 2.4L to 16L fermentors, using KLa (equal to 15h-1) as scale-up criteria. According to the results the highest values of fermentative parameters such as xylitol yield and productivity were achieved with the use of inoculum cultivated on xylose during the fermentation of hydrolysate detoxified with resins (YP/S = 0.81 g g-1 and QP = 0.60 g L-1 h-1, respectively), although with the use of charcoal the yield value was similar (YP/S ranging for 0.78 to 0.80 g g-1), regardless of the carbon source employed. Considering the value of xylitol yield and that detoxification with activated charcoal is less expensive and more easily manipulated when compared to detoxification procedure with resins, the experiments for scale up xylitol production by C. guilliermondii were performed in such detoxification condition with xylose as the carbon source for the inoculum. At this stage it was evident the scale up xylitol production from a fermenter of 2.4L to 16L was feasible, since the values of fermentative parameters evaluated were similar to those of the fermentors (medium values YP/S ≈ 0.68 g g-1 e QP ≈ 0.28 g L-1 h-1). However, these values were lower than those obtained in Erlenmeyer flasks, maybe due to conditions of oxygen availability for they differ from those in fermentors, since oxygen is the most critical parameter in this bioprocess.

Global climate change and volatility of petroleum price have driven the necessity to reduce fossil fuel utilization and replace it by renewable energy. Bioethanol production in the United States and Brazil from cornstarch and sugarcane, respectively, is already established. However, the bioethanol industry appears unsustainable in view of the potential stress that its production places on food commodities. In contrast, second-generation biofuels produced from cheap and abundant lignocellulosic biomass, has been viewed as one plausible solution to this \"food versus fuel\" problem. Sugarcane bagasse is an abundant source of lignocellulosic biomass in Brazil and is generally recognized as a very promising feedstock for lignocellulosic ethanol production. Nevertheless, inhibitors such as furfural, 5-hydroxymethyl furfural (HMF) and carboxylic acids are formed during an acid thermochemical pretreatment of lignocellulosic biomass, which has a negative effect on the fermentative microorganisms - Saccharomyces cerevisiae. Second-generation (2G) ethanol in Brazil has the possibility to use a novel substrate, prepared as a blend of sugarcane bagasse hydrolysate and cane molasses. Molasses supplements the nutritional deficiencies of bagasse hydrolysate, contributing with minerals, amino acids and vitamins. However, molasses also contains additional inhibitors, such as HMF, sulfite, and toxic concentration of some minerals (K, Ca), which affect S. cerevisiae fermentation performance. The goal of this work was to generate tolerant derivatives of S. cerevisiae industrial strains that are able to cope with inhibitors present in bagasse hydrolysate and molasses, by means of sexual hybridization and adaptive evolution, which can be used for 2G-ethanol production. The industrial strains PE-2, CAT-1 and SA-1 were sporulated, and haploids were irradiated by ultraviolet (UV) light in order to increase genetic and phenotypic diversity. After direct mating and screening in molasses and hydrolysate media, 234 hybrid strains were selected for further study. In parallel, mass matings (intra and interlines) of PE-2, CAT-1 and SA-1 from non-irradiated haploids were performed and the generated strains were subjected to adaptive evolution for about 100 generations. The 120 strains derived from mass mating and adaptive evolution were then screened for growth in molasses-hydrolysate media. Six isolates showed good fermentation properties compared to the reference strains, showing that hybridization and adaptive evolution of Brazilian industrial yeast strains was a good strategy to develop new tolerant strains for 2G-ethanol production. To better utilize all the sugars present in bagasse hydrolysate, a cassette containing the three genes responsible for xylose fermentation (xylose reductase, xylitol dehydrogenase and xylulose kinase) was integrated into the genome of a haploid derivative (272-1a) of one of the six selected hybrids (272), which had the highest tolerance to Miscanthus x giganteus hydrolysate. Fermentation studies demonstrated that this engineered strain was able to metabolize xylose into ethanol. Finally, the haploid 272-1a was analyzed by quantitative trait loci (QTL) mapping to identify the genetic basis of hydrolysate tolerance. Although the causative gene(s) were not identified in this work, a number of QTL peaks were identified that will serve as the starting point for future fine-mapping studies. / Mudança climática global e a volatilidade do preço do petróleo tem impulsionado a necessidade de redução e substituição de combustíveis fósseis por energias renováveis. A produção de bioetanol nos Estados Unidos e no Brasil a partir de milho e cana-de-açúcar, respectivamente, está estabelecida. Todavia, a produção de bioetanol mostra-se insustentável, pelo fato da utilização de produtos alimentares para tal produção. Em contrapartida, biocombustíveis produzidos a partir de resíduos lignocelulósicos têm sido vistos como uma solução plausível para o problema \"alimento versus combustível\". No Brasil, o bagaço de cana é uma fonte disponível de biomassa lignocelulósica. No entanto, inibidores como furfural, 5-hidroximetil-furfural (HMF) e ácidos carboxílicos formados durante o prétratamento ácido da biomassa lignocelulósica, têm efeito negativo sobre os microorganismos fermentadores - Saccharomyces cerevisiae. No Brasil, o etanol de segunda-geração (2G) tem possibilidade de utilizar um novo substrato, preparado a partir da mistura de melaço e hidrolisado de bagaço. O melaço será um adjuvante para suprir a deficiência nutricional do hidrolisado, contribuindo com minerais, aminoácidos e vitaminas. Por outro lado, o melaço apresenta alguns inibidores, como HMF, sulfito, e concentração tóxica de alguns minerais, como potássio (K) e cálcio (Ca), que afetam o crescimento e desempenho fermentativo de S. cerevisiae. O objetivo deste trabalho foi gerar descendentes tolerantes de linhagens industriais de S. cerevisiae, capazes de lidar com inibidores presentes no melaço e no hidrolisado de bagaço, por meio de hibridação e evolução adaptativa, para produção do etanol 2G. As linhagens industriais PE-2, CAT-1 e SA-1 foram esporuladas, seus haplóides foram irradiados por luz ultravioleta (UV), objetivando o aumento da diversidade genética e fenotípica das linhagens. Após cruzamento direcionado, 234 híbridos foram selecionados pelo crescimento (DO570nm) em meios de melaço e hidrolisado. Em paralelo, cruzamentos massais (intra e interlinhagens) de haplóides não-irradiados de PE-2, CAT-1 e SA-1 foram realizados e submetidos a evolução adaptativa por cerca de 100 gerações. As 120 estirpes de cruzamentos massais seguidos de evolução adaptativa foram selecionadas pelo crescimento em meios de melaço e hidrolisado. Seis isolados apresentaram boas características fermentativas em comparação às cepas referências, mostrando que hibridação e evolução adaptativa de linhagens de leveduras industriais brasileiras são boas estratégias para desenvolver novas linhagens para produção do etanol-2G. Para uma melhor utilização dos açúcares do hidrolisado, a cassete contendo os três genes responsáveis pela fermentação de xilose (xilose redutase, xilitol desidrogenase e xiluloquinase) foi integrada no genoma do haplóide segregante (272-1a) de uma das seis estirpes selecionadas (272), que apresentou a maior tolerância em hidrolisado de Miscanthus x giganteus. Estudos de fermentação mostraram que a estirpe foi capaz de metabolizar a xilose em etanol. Por fim, o haploide 272-1a foi analisado por quantitative trait loci (QTL) afim de identificar a base genética da tolerância ao hidrolisado. Apesar, do(s) gene(s) causativos não terem sido identificados nesse trabalho, os picos do mapa de QTL identificados servirão como ponto de partida para futuro mapeamento.

A busca por soluções sustentáveis, levando a um processo energético mais eficiente induziu a novas tecnologias e esforços estão sendo realizados para viabilizar o etanol de segunda geração, com o aproveitamento da biomassa celulolítica como substrato para a fermentação alcoólica. Contudo, durante a hidrólise do bagaço, muitos compostos tóxicos à levedura são formados como o furfural, hidroximetilfurfural, ácido acético, e compostos fenólicos com efeitos depressivos sobre a fermentação. A adição de melaço no hidrolisado de bagaço poderia permitir uma fermentação com maior teor alcoólico, contribuindo para um balanço energético favorável da destilação, além de propiciar nutrientes minerais e orgânicos para a levedura. Tais nutrientes poderiam permitir um processo fermentativo com reciclo de células de leveduras aproveitando assim uma estrutura e conhecimentos já existentes na destilaria de etanol de primeira geração. O reciclo de células permitiria fermentações rápidas, porém impõe repetidas condições estressantes, o que torna um grande desafio a obtenção de linhagens com o perfil de tolerância desejado. Assim este trabalho se propôs a selecionar linhagens de Saccharomyces cerevisiae com múltiplas tolerâncias em relação aos inibidores tanto presentes no hidrolisado como no melaço. Para tal, foram impostas condições estressantes sobre culturas da linhagem SA-1 e de leveduras isoladas de destilarias brasileiras durante cerca de 62 gerações, forçando uma evolução adaptativa ou mesmo um enriquecimento/seleção de indivíduos mais tolerantes. Paralelamente a biodiversidade de linhagens isoladas de destilarias foi avaliada quanto aos atributos de tolerância aos compostos tóxicos presentes no hidrolisado do bagaço. As linhagens com maiores desempenhos foram avaliadas em fermentações com reuso de células empregando-se substrato constituído de hidrolisado e melaço, sendo que 4 linhagens se mostraram superiores às linhagens referenciais. Destas, dois isolados (242 e 408) foram esporulados e os conjuntos dos haploides foram empregados em cruzamentos massais. Simultaneamente, 273 haploides isolados das linhagens 242 e 408 foram avaliados quanto ao crescimento (DO600nm) em substrato constituído por hidrolisado e melaço, sendo que 32 foram selecionados. Após a tipificação segundo o \"mating type\" os mesmos foram utilizados em cruzamentos direcionados mediante micromanipulação, resultando em 35 cruzamentos. Cinco híbridos de cada cruzamento direcionado foram resgatados (155 isolados), que juntamente com 80 isolados oriundos do cruzamento massal, foram novamente avaliados quanto ao crescimento (DO600nm) e a seguir em fermentações com reciclo de células. Cinco linhagens se destacaram como superiores aos parentais, demonstrando que mediante o protocolo empregado foi possível incrementar o perfil de tolerância de Saccharomyces cerevisiae para suportar os estresses impostos por um substrato para produção do etanol de segunda geração. / The search for sustainable solutions to improve process efficiency has promoted the development of new technologies, and the use of cellulolytic biomass as the substrate for fermentation has emerged as a promising second-generation ethanol production strategy. However, the hydrolysis of this material results in the formation of toxic compounds to yeast such as furfural, hydroxymethylfurfural, acetic acid and phenolic compounds, with deleterious effects on fermentation. Addition of molasses in the bagasse hydrolysate could allow fermentation with higher alcohol content contributing to a favorable energy balance in the distillation, as well as providing minerals and organic nutrients for the yeast. These nutrients could allow a fermentative process with yeast cell recycle, utilizing the structure and knowledge already existing in first generation process. The cell recycle enables a rapid fermentation, but imposes repeated stress conditions, making it challenging to obtain strains with the desired tolerance profile. The purpose of this study was to select Saccharomyces cerevisiae strains with multiple tolerances to inhibitors present in the hydrolysate and molasses. Stressful conditions were imposed on cultures of SA-1 strain and indigenous strains from Brazilian distilleries for around 62 generations, forcing an adaptive evolution or even an enrichment / selection of more tolerant individuals. In parallel, the biodiversity of the strains from Brazilian distilleries were evaluated with respect to their tolerance to the toxic compounds present in bagasse hydrolysate. The strains that showed higher performance were assessed in fermentations with cell reuse employing substrate composed by hydrolyzate and molasses. Four of the analyzed strains exhibited better performance than the reference strain. Of these, two isolates (242 and 408) were sporulated and the haploids were subjected to mass mating. Simultaneously, 273 haploids rescued from the strains 242 and 408 were evaluated for growth (OD 600 nm) in the substrate consisting of hydrolysate and molasses, and among them 32 were selected. After the characterization according to the \"mating type\", the haploids were utilized in direct mating induced by micromanipulation, totaling 35 crossings. Five hybrids from each direct mating were rescued (totaling 155 isolates), which together with 80 isolated from the mass mating, were evaluated for growth (OD 600 nm) and then in fermentation with cell recycle. 5 strains have excelled as superiors to the reference strain showing that by the protocol employed was possible to increase profile of tolerance of Saccharomyces cerevisiae to resist pressures imposed by a substrate for second-generation ethanol production.

O xilitol vem se destacando nas áreas alimentícia, odontológica, farmacêutica e médica, além de apresentar significativo potencial de aplicação em outros segmentos industriais (têxteis e químicos). Os benefícios do xilitol abriram as portas para novas áreas de venda além de crescimento no setor de póliols e adoçantes no mercado mundial. O presente trabalho teve como objetivo contribuir para o desenvolvimento de uma tecnologia tecnicamente e economicamente viável para a obtenção de xilitol a partir do hidrolisado hemicelulósico do bagaço de cana-de-açúcar, utilizando biorreator de leito fluidizado com células da levedura Candida guilliermondii FTI 20037 imobilizadas em suporte natural de alginato de cálcio. Para avaliar a viabilidade técnica deste processo biotecnológico, foram realizados fermentações em bateladas simples conforme um planejamento fatorial 23 com três pontos centrais. Em seguida, foi avaliada a influência das variáveis, fluxo de fluidização, fator de concentração do hidrolisado e vazão do ar no fator de rendimento (Yp/s) e na produtividade volumétrica (Qp). Segundo os resultados obtidos, observou-se que apenas o aumento no fluxo de fluidização exerceu uma influência positiva no fator de rendimento e na produtividade do processo. Tal fato é devido a uma melhor transferência de oxigênio do meio para o interior do suporte de imobilização, resultando em maior consumo de xilose e produção de xilitol. O processo biotecnológico utilizado neste trabalho resultou em, uma concentração final de xilitol de 34 g/L a partir de uma concentração inicial de xilose de 49 g/L, um fator de rendimento (Yp/s) de 0,7 g/g (equivalente a 76 % de eficiência de bioconversão) e uma produtividade volumétrica (Qp) de 0,44 g/L.h, após 72h de fermentação. Foram realizados também fermentações em bateladas repetidas com reciclo das células imobilizado, nas condições de fermentação otimizadas e indicadas pela análise estatística realizada. Verificou-se que, o fator de rendimento (Yp/s) e a produtividade volumétrica (Qp) do processo apresentaram pequenas variações ao longo das 6 bateladas repetidas (B1-B6), com uma produção final média de 31,5 g/L de xilitol. Entretanto, a partir da batelada B7 observou-se, uma diminuição de 44 % na concentração final do xilitol produzido (17 g/L) e de 28% no número final de células viáveis imobilizadas (3,4 x1010 mL/cel.) em comparação com as bateladas B1-B6 (valor médio de 4,7x1010 mL/cel.), após 72 h de fermentação. Esta redução no crescimento das células imobilizadas pode ser explicada pela possível difusão e acúmulo de materiais insolúvel proveniente do hidrolisado, ao longo das 7 bateladas remetidas, para o interior do suporte de imobilização propiciando assim limitações na transferência de xilose no meio de fermentação para o interior das células encapsuladas. Com o objetivo de avaliar o custo de produção de xilitol, foi realizado um estudo técnico-econômico para a produção de xarope de xilitol de 80% de pureza, utilizando hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana em uma planta piloto com capacidade de processar 1 tonelada de bagaço. Segundo os resultados obtidos deste estudo, observou-se que este processo biotecnológico para a produção de xilitol mostrou-se economicamente viável com um payback de 24 meses e uma TIR (Taxa interna de retorno) de 51,7%, sendo o preço estimado para a venda do xarope de xilitol no mercado de R$ 211,60. Visando reduzir o custo de venda deste xarope e aumentar a competitividade do xilitol em relação a outros póliols encontrados no mercado, foram sugeridas modificações em algumas etapas do processo realizado neste trabalho (aumento na eficiência da hidrólise para 80% e a utilização de resinas de troca iônica no tratamento do hidrolisado hemicelulósico). O processo modificado resultou em uma redução no preço de venda do xarope de xilitol, sendo este valor estimado a R$ 113,10, correspondendo a apenas 28 % do preço de venda do xilitol cristalizado no mercado interno (R$ 402,50). O processo biotecnológico para a produção de xilitol mostrou-se economicamente promissor para uma futura implantação em nível industrial. / Xylitol is being distinguished for its application in the industries of food, odontology and pharmacy; furthermore, it presents a potential use in other industrial segments (textiles and chemicals). The different benefits of xylitol will open doors for new selling areas which will lead to its growth in the international market of polyols and alternative sweeteners. The present work had as an objective the contribution in the development of a technically and economically viable technology for the production of xylitol starting from the hemicellulosic hydrolysate of sugarcane bagasse, using a fluidized bed bioreactor with yeast cells of Candida guilliermondii FTI 20037 immobilized in a natural support of calcium alginate. To evaluate the technical viability of this biotechnological process, they were realized simple batch fermentations according to a factorial design 23 with three central points. Furthermore, it was evaluated the influence of the variables, fluidization flux, hydrolysate concentration factor and air flux in the process yield (Yp/s) and volumetric productivity (Qp). According to the obtained results it was observed that, only an increase in the fluidizations flux exercised a positive influence in process yield and volumetric productivity. This fact is due to a better oxygen transfer to the inside of the immobilization support, resulting in a higher xylose consumption and xylitol production. The biotechnological process used in this work resulted in, a final concentration of xylitol of 34 g/L starting from an initial concentration of xylose of 49 g/L, a yield (Yp/s) of 0.7 g/g (corresponding to 76 % of bioconversion efficiency) and a volumetric productivity (Qp) of 0.44 g/L.h, after 72h of fermentation. Also they were realized repeated batch fermentations with the recycle of the immobilized cells, using the optimized fermentation conditions as indicated by the statistical analysis previously done. It was verified that, the yield (Yp/s) and the volumetric productivity (Qp) of the process have presented small variations throughout the 6 repeated batch fermentations (B1-B6), with an average final production of 31,5 g/L of xylitol. On the other hand, at the end of the batch fermentation B7 it was observed a decrease of 44% in the final concentration of the produced xylitol (17 g/L) and 28% in the final number of viable immobilized cells (3.4 x1010 mL/cells) in comparison with the batch fermentations B1-B6 (average value of 4.7x1010 mL/cells), after 72h of fermentation. This reduction in the growth rate of the immobilized cells can be explained by the possible diffusion and accumulation of insoluble substances originating from the hemicellulosic hydrolysate, during the 7 repeated batch fermentations, into the interior of the immobilization support resulting in limitations in xylose transference from the fermentation medium into the encapsulated cells. With the objective to evaluate the production cost of xylitol, it was realized a technicaleconomical study for the production of a xylitol syrup with 80% of purity, using hemicellulosic hydrolysate from sugarcane bagasse in a pilot plant with the capacity to process 1 tons of bagasse. According to the results obtained in this study, it was observed that the biotechnological process for xylitol production has shown to be economically viable with a payback period of 24 months and a TIR of 51. 7%, considering that the selling price of xylitol syrup (80% of purity) was estimated to be R$ 211.60 in the internal market. Aiming to reduce the selling cost of xylitol syrup and increase its competitiveness in relation to other polyols found in the market, they were suggested modifications in some stages of the process used in this work (increase in the hydrolysis efficiency to 80% and the utilization of ionic exchange resins in the treatment of the hemicellulosic hydrolysate). The modified process resulted in a reduction in the selling price of xylitol syrup, being this value estimated in R$ 113.10 corresponding to only 28% of the selling price of crystallized xylitol in the internal market (R$ 402.50). The biotechnological production of xylitol has shown to be economically promising for future implantation at industrial level.

A presença de compostos inibidores ao metabolismo de microrganismos é a principal dificuldade encontrada para utilização dos hidrolisados hemicelulósicos para produção de etanol e xilitol. Compostos derivados das degradações da lignina, da celulose e hemicelulose são liberados durante a hidrólise ácida da biomassa. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a utilização de diferentes tratamentos de destoxificação de forma combinada, visando a purificação do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar para obtenção de etanol e xilitol. Os tratamentos utilizados foram: coagulação/floculação de impurezas coloidais, separação por membranas de microfiltração e ultrafiltração e resinas de troca iônica, sendo o material de partida foi um hidrolisado de bagaço recém-obtido. O tratamento de coagulação/floculação foi otimizado utilizando planejamento de experimentos do tipo fatorial e na melhor condição promoveu reduções de 53,3% em compostos fenólicos, 34,8% de furfural, 3,7% de HMF, 4,2% de ácido acético e 67,6% da área espectral. Na sequência, o hidrolisado tratado na etapa anterior foi submetido a testes de microfiltração e ultrafiltração. Para esta etapa os melhores resultados foram obtidos utilizando membranas de 100 kDa em polietersulfona. Com este tratamento foi possível reduzir em 11,9% os compostos fenólicos, 23,8% de furfural, 21,5% de HMF e 21,4% de área espectral. Após o tratamento com membranas o hidrolisado foi percolado em resinas de caráter catiônico e aniônico utilizadas em série possibilitando a eliminação de 34,8% de compostos fenólicos, 38,5% de furfural, 74,7% de HMF, 55% de ácido acético e 10,3% da área espectral. Ao final, a combinação de todas as tecnologias de separação estudadas possibilitou remoções maiores que 97% para compostos fenólicos, furfural e HMF o que resultou numa redução da área espectral em 99,3%. O hidrolisado purificado foi concentrado e submetido a testes fermentativos preliminares para produção de etanol e xilitol. Estas bioconversões apresentaram rendimentos de 0,58 g/g em xilitol e 0,29 g/g em etanol por D-xilose consumida, que equivalem a 86% e 83% dos rendimentos obtidos a partir dos meios sintéticos, respectivamente. Estes resultados indicaram que a purificação obtida através do uso combinado da coagulação/floculação, separação por membranas e resinas de troca iônica foram bastante satisfatórios principalmente considerando a fermentabilidade obtida a partir deste substrato em comparação ao meio sintético. / The presence of inhibitory compounds in the metabolism of microorganisms is the main difficulty for the use of hemicellulosic hydrolyzate for ethanol and xylitol production. Compounds derived from lignin, cellulose and hemicellulose degradation are released during the biomass acid hydrolysis. This study aimed to evaluate the use of different detoxification treatments in combination, aimed at purifying the hydrolyzed hemicellulosic sugarcane bagasse. The treatments were: coagulation / flocculation of colloidal impurities, separation by microfiltration and ultrafiltration membrane and ion exchange resins, and the starting material was a newly obtained hydrolyzed bagasse. The treatment of coagulation / flocculation was optimized using factorial experiments design of the kind that in the best condition promoted reductions of 53.3%, 34.8%, 3.7%, 4.2% and 67.6% in phenolic compounds, furfural, hydroxymethylfurfural, acid acetic acid and spectral area, respectively. Next, the hydrolyzate treated in the previous step was tested for microfiltration and ultrafiltration. For this step the best results were obtained using a 100 kDa membrane in polyethersulfone. With this treatment were obtaneid reduction of 11.9%, 23.8%, 21.5%, 21.4% in phenolic compunds, furfural, hydroxymethylfurfural and spectral area, respectively. After membrane treatment the hydrolyzate was percolated through resins with anionic and cationic character used in series enabling the elimination of 34.8%, 38.5%, 74.7%, 55% and 10.3% of phenolic compounds, furfural, hydroxymethylfurfural, acetic acid and spectral area, respectively. At the end, the combination of all separation technologies studied was able to remove greater than 97% of phenolic compounds, furfural and hydroxymethylfurfural which resulted in a reduction of 99.3% in spectral area. The purified hydrolyzate was concentrated and subjected to preliminary fermentative testing for the ethanol and xylitol production. These bioconversions had income of 0.58 g/g in xylitol and 0.29 g/g in ethanol by D-xylose consumed, equivalent to 86% and 83% of ethanol and xylitol yield obtained from the synthetic medium, respectively. These results indicated that the purification achieved through the combined use of coagulation/flocculation, membrane separation and íon exchange resins were very satisfactory, especially considering the fermentability obtained from this substrate compared to the synthetic medium.

O desenvolvimento de alternativas aos combustíveis fósseis como fonte de energia é uma prioridade global. A biomassa celulósica representa uma alternativa para satisfazer a procura de bicombustíveis renováveis. O bagaço de cana-de-açúcar é um abundante subproduto proveniente da produção atual de etanol no Brasil. Tal subproduto pode ser hidrolisado a fim de se obter açúcares fermentáveis para a produção do etanol de segunda-geração. Porém, no processo de pré-tratamento são gerados diversos inibidores como ácido acético, furfural e hidroximetilfurfural que causam efeitos adversos para a levedura no processo de fermentação alcoólica. A adição de melaço ao hidrolisado é uma forma de diminuir os efeitos dos inibidores no metabolismo das leveduras e também permite uma fermentação com maior teor alcoólico contribuindo para um balanço energético favorável da destilação, contribui também com o fornecimento de nutrientes minerais e orgânicos necessários a levedura para um processo empregando reciclo de células. Assim, objetivou-se selecionar linhagens de Saccharomyces cerevisiae com melhores características de multitolerância ao hidrolisado a partir de cruzamento direcionado e cruzamento massal seguido de evolução adaptativa. Para tal, linhagens S. cerevisiae industriais CAT-1, BG-1, PE-2 e SA-1 foram esporuladas e mediante micromanipulação foram obtidos 604 haploides, que foram avaliados quanto ao crescimento (DO570nm) em substrato constituído por hidrolisado e melaço. Os haploides selecionados (25) tiveram o \"mating type\" determinado permitindo a realização de 51 cruzamentos direcionados, gerando 398 zigotos, que foram igualmente avaliados para o crescimento no meio seletivo. Paralelamente, foram realizados cruzamentos massais, resultando em 7 diferentes populações, as quais foram submetidas à evolução adaptativa por 25 gerações, sendo que os isolados selecionados de cada cruzamento foram avaliados em fermentação com reciclo de células. Quatro linhagens se destacaram como superiores aos parentais, evidenciando que a estratégia utilizada permitiu a obtenção de linhagens de S. cerevisiae com maior tolerância aos estresses impostos por um substrato para produção do etanol de segunda geração. / The development of alternatives to fossil fuels as a source of energy is a global priority. Cellulosic biomass is an alternative to meet the demand for renewable biofuels. The sugarcane bagasse, an abundant byproduct generated from ethanol production in Brazil, can be hydrolysed to obtain fermentable sugars to produce second-generation ethanol. However, inhibitors produced in the pre-treatment process such as acetic acid, furfural and hydroxymethylfurfural, cause adverse effects to the yeast in the fermentation process. Addition of molasses in the bagasse hydrolyzate is one way to reduce the effects of inhibitors in the metabolism of yeast and also could allow fermentation with higher alcohol content contributing to a favorable energy balance in the distillation, as well as providing minerals and organic nutrients for the yeast. The main goal of this study was to select strains of Saccharomyces cerevisiae with better features of multi-tolerance to the bagasse hydrolyzate by directed crossing and mass mating followed by adaptive evolution. For that S. cerevisiae lineages CAT-1, BG-1, PE-2 e SA-1 were sporulated and 604 haploid cultures were obtained by micromanipulation and evaluated for growth (OD 570nm) in the substrate consisting of hydrolyzate and molasses. Selected haploids (25) were identified regarding their \"mating type\" (a and α) and used in. 51 directed crossings generating 398 zygotes, which were rescued by micromanipulation and also evaluated for growth in the same selective medium. Mass mating were performed with 7 different haploid populations from the parental strains, followed by an adaptive evolution for 25 generations. The selected zygotes were then subjected to fermentation trails with cell recycling, resulting in 4 strains with superior traits when compared with the parentals, allowing to conclude that the used strategy was successful in obtaining hybrids of Saccharomyces cerevisiae with increased profile of tolerance towards a substrate for second-generation ethanol production.

O presente estudo teve como principal objetivo avaliar a capacidade de Saccharomyces cerevisiae em metabolizar os compostos tóxicos presentes em hidrolisados hemicelulósicos de palha de arroz (HHPA) e de poda de oliveira (HHPO), visando a obtenção de hidrolisados com menor grau de toxicidade para Pichia stipitis. Após determinada a composição dos hidrolisados (açúcares e compostos tóxicos) foi avaliado o nível de concentração do HHPA capaz de inibir o metabolismo de P. stipitis. Em seguida, foi avaliado o efeito do tempo, concentração de S. cerevisiae, pH e aeração sobre a composição destes hidrolisados, tendo como resposta a fermentabilidade de P. stipitis. Nas condições otimizadas do biotratamento, as fermentações de P. stipitis foram conduzidas em frascos agitados e em biorreator, e as respostas avaliadas foram o consumo de D-xilose, fator de conversão de substrato em etanol (YP/S) e produtividade volumétrica em etanol (QP). Os ensaios de biotransformação destes hidrolisados, assim como do meio sintético (MS), o qual mimetizou o teor de açúcares e compostos tóxicos presentes no HHPA, mostraram que as modificações na composição destes meios foram dependentes do tempo de tratamento. Durante o tratamento, a levedura S. cerevisiae foi capaz de consumir apenas a D-glicose com baixas produções de etanol glicerol e ácido acético. Além disso, no HHPA e MS o 5-HMF e furfural foram quase que totalmente assimilados (> 90%), com formação de baixos teores de ácido furóico. Nestes meios, S. cerevisiae converteu parcialmente os ácidos ferúlico (15%) e p-cumárico (20%), sendo observado apenas produto de conversão do ácido ferúlico (álcool vanilil). A vanilina foi completamente assimilada em MS, porém, em HHPA foi constatado um residual do composto (42%), sendo o álcool vanilil o principal produto de conversão. Em relação ao HHPO foi observada assimilação de 47% de furanos totais e 11% de fenólicos totais, não sendo identificados produtos de conversão. Os resultados da fermentação de P. stipitis em HHPA mostraram que o tratamento biológico por 6 horas favoreceu o consumo de D-xilose e a produção de etanol, indicando que este parâmetro é um importante fator a ser considerado. Nestas condições, o consumo de D-xilose foi de 57% com produção de 9 g/L de etanol (YP/S = 0,18 g/g e QP = 0,086 g/L.h). Os resultados da fermentação do HHPO apresentaram valores inferiores de YP/S (0,14 g/g) e QP (0,060 g/L.h) quando comparados ao HHPA, o que indica um maior grau de toxicidade deste hidrolisado. Em relação ao MS, verificou-se que o biotratamento favoreceu em aproximadamente 40% o consumo de D-xilose e a produção de etanol por P. stipitis, quando comparado com o MS não-tratado. As melhores condições de concentração de S. cerevisiae (5 g/L), pH (3,0) e fator de aeração (6,5) definidas no HHPA através de um planejamento experimental, proporcionou um consumo de 67% de D-xilose por P. stipitis, com produção de 13,5 g/L de etanol (YP/S = 0,24 g/g e QP = 0,15 g/L.h). Na fermentação em biorreator, P. stipitis foi capaz de consumir totalmente a D-xilose, produzindo 23 g/L de etanol, após 44 horas. Com base nestes resultados, pode-se concluir que o tratamento dos hidrolisado hemicelulósicos com S. cerevisiae é uma técnica promissora capaz de diminuir o grau de toxicidade destes meios com consequente melhoria em sua fermentabilidade, especialmente na velocidade de produção de etanol. / The aim of this work was to study the ability of Saccharomyces cerevisiae to metabolize a variety of toxic compounds found in rice straw (RSHH) and olive tree pruning (OTHH) hemicellulosic hydrolysates, in order to obtain hydrolysates with lower toxicity for Pichia stipitis. After determined the hydrolysate composition (sugar and toxic compounds) was evaluated the RSHH concentration level able to inhibit the P. stipitis metabolism. Then, the effect of time, S. cerevisiae concentration, pH and aeration on the hydrolysates composition was evaluated, and the fermentation was used as response. Under optimized conditions of biotreatment, P. stipitis fermentations were conducted in shake flasks and in bioreactor. In relation to the biotransformation assays of these hydrolysates, as well as synthetic medium (SM), with the same sugar and toxic compounds concentrations found in RSHH, the results showed that changes in the media compositions were dependent on the treatment time. During the treatment, S. cerevisiae consumed only D-glucose with low ethanol, glycerol, and acetic acid production. Furthermore, in SM and RSHH media, 5-HMF and furfural were almost completely assimilated (> 90 %), with low levels of furoic acid formation. In these media, S. cerevisiae partially converted ferulic acid (15%) and p-coumaric acid (20%), being observed only the conversion product of ferulic acid (vanillyl alcohol). Vanillin was totally assimilated in SM, however a residual of this compound (42%) was observed in RSHH, being vanillyl alcohol the main conversion product. Regarding OTHH was observed the assimilation of total furans (47%) and total phenolic (11%), and no conversion products were identified. The results from the P. stipitis fermentation in RSHH showed that biotreatment for 6 hours favored D-xylose consumption and ethanol production, indicating that this parameter is an important factor to be considered. In these conditions, D-xylose consumption was 57% with 9 g/L ethanol production (YP/S = 0.18 g/g QP = 0.086 g/Lh). The results of OTHH fermentation showed lower YP/S (0.14 g/g) and QP (0.060 g/L.h ) compared to RSHH, which indicates a higher degree of toxicity in OTHH. Regarding SM, the biotreatment increased D-xylose consumption and ethanol production by P. stipitis in approximately 40%, when compared with untreated-SM. The most suitable conditions of S. cerevisiae concentration (5 g/ L), pH (3.0) and the aeration factor (6.5) defined in RSHH through an experimental design, provided 67% of D-xylose consumption, and 13.5 g/L ethanol production by P. stipitis (YP/S = 0.24 g/g QP = 0.15 g/L.h). In bioreactor, P. stipitis was able to completely consume D-xylose, producing 23 g/L ethanol after 44 hours. Based on these results, it can be concluded that previous treatment of hemicellulose hydrolysates with S. cerevisiae is a promising technique capable of reducing the toxicity degree of RSHH and OTHH, with consequent improvement in their fermentability, especially on ethanol production rate.

A disponibilidade de nitrogênio no solo e o fornecimento de doses de potássio podem alterar a nutrição do capim-marandu, com reflexos diretos na morfologia, atividade de enzimas e acúmulo de poliaminas nas plantas. Objetivou-se: i) identificar a forma de nitrogênio e a dose de potássio que promovem a maximização dos atributos morfológicos da parte aérea e das raízes e, consequentemente, a produção de forragem do capim-marandu (Brachiaria brizantha cv. Marandu); ii) avaliar as concentrações de nitrogênio, nitrato, amônio, potássio, prolina, poliaminas e clorofila, além do valor SPAD e da redutase do nitrato nas folhas diagnósticas, em função da adubação de formas de nitrogênio com doses de potássio e iii) quantificar as transformações do nitrogênio do solo, em função da aplicação de formas de nitrogênio e adição de material vegetal de capim-marandu. Os experimentos foram realizados em duas etapas: a) em casa de vegetação onde as plantas de capim-marandu foram cultivadas em solo classificado como Neossolo Quartzarênico. Quatro formas de nitrogênio (nitrato, amônio, 70%nitrato+30%amônio e amídica) mais controle e quatro doses de potássio (0, 150; 300 e 450 mg dm-3) foram combinados em um fatorial completo 5x4. As unidades experimentais consistiram em 80 vasos e o delineamento experimental foi o de blocos inteiramente casualizados, com quatro repetições; b) em laboratório, seis combinações envolvendo formas de nitrogênio (nitrato e amônio enriquecidos com 15N e controle) e presença/ausência de material vegetal de capim-marandu foram avaliados em incubação aeróbica. Cada combinação foi repetida três vezes e todos foram incubados por oito períodos de avaliação (0, 1, 2, 4, 8, 12, 16 e 20 semanas) com o Neossolo Quartzarênico, em delineamento completamente causalizado. Os resultados demonstraram que o fornecimento de nitrogênio associado ao de potássio foi fundamental para elevar a produção de forragem e das raízes e a concentração desses elementos nas folhas diagnósticas do capim-marandu. A forma nitrato+amônio, na dose de potássio de 450 mg dm-3, proporcionou mais elevada área foliar, a qual foi determinante no incremento da produção de forragem. O fornecimento das formas de nitrato, nitrato+amônio e amídica, associados à máxima dose de potássio proporcionaram incrementos nos números de perfilhos e folhas, área foliar, e consequentemente na produção de forragem. O não fornecimento de nitrogênio e a aplicação na forma de amônio proporcionaram as mais baixas produções de forragem. O incremento das doses de potássio reduziu os sintomas de toxicidade de amônio nas plantas de capim. Os atributos produtivos do sistema radicular foram alterados positivamente pelas formas nitrato, nitrato+amônio e amídica e pelas doses de potássio. O valor SPAD foi incrementado pelas formas nitrato, nitrato+amônio e amídica e a aplicação de potássio de 336 mg dm-3 que resultou em 38 unidades SPAD. A concentração de clorofila de 35 ?g g-1 correspondeu à de nitrogênio total de 22,5 g kg-1. A enzima redutase do nitrato teve sua atividade aumentada com o incremento das doses de potássio e o fornecimento de nitrato+amônio. As concentrações de putrescina, espermidina, espermina e prolina aumentaram mediante o fornecimento de amônio e diminuíram com incremento das doses de potássio. Os baixos teores de 15NH4 + no solo após a segunda semana permitiram verificar que todo amônio foi imobilizado pelos microrganismos do solo, em todas as combinações. A aplicação de amônio, com material vegetal de capimmarandu, resultou nos mais elevados teores de amônio, aminoácido, aminoaçúcar e nitrogênio total hidrolisados. / Soil nitrogen availability and potassium supply rates can influence Marandu palisadegrass nutrition, with direct effect on the morphology, enzyme activity and polyamines accumulation in plants. This study aimed to: i) identify the nitrogen form and the potassium rate that maximizes the morphological attributes of shoots and roots, and consequently, the forage production of Marandu palisadegrass (Brachiaria brizantha cv. Marandu), ii) evaluate the nitrogen, nitrate, ammonium, potassium, proline, polyamines and chlorophyll concentration, as well as the SPAD value and the nitrate reductase activity in diagnostic leaves, as a function of nitrogen forms and potassium rates, and iii) quantify the soil nitrogen changes according to different forms of nitrogen and addition of Marandu residue. The experiments were carried out in two stages: a) in a greenhouse, where Marandu plants were grown in an Entisol. Four nitrogen forms (nitrate, ammonium, 70% nitrate+30% ammonium, urea) plus the control (no nitrogen) and four potassium rates (0, 150, 300 and 450 mg dm-3) were arranged in a 5x4 complete factorial design. The experimental units consisted on 80 pots. The twenty combinations were evaluated in a completely randomized block design with four replications; b) in the laboratory experiment, six combinations involving three forms of N (nitrate and ammonium enriched with15N atoms 1% and no nitrogen) and Marandu residue (presence/absence) were evaluated using aerobic incubation. Each combination was replicated three times and incubated under eight incubation periods (0, 1, 2, 4, 8, 12, 16 and 20 weeks) in an Entisol. In total, 144 experimental units were evaluated using a completely randomized design. The results from the first experiment showed that nitrogen supply associated with potassium rates were important for increasing the forage and roots biomass and the concentration of these elements in the diagnostic leaves. Nitrate+ammonium and potassium at 450 mg dm-3 provided with the largest leaf area, which was decisive for high forage production. The supply of nitrate, nitrate+ammonium and urea, associated with the maximum potassium rate resulted in increased number of tillers, leaves, leaf area, and consequently, increased forage production. Combinations involving ammonium and no nitrogen provided with the lowest forage production. High potassium rates were associated with less ammonium toxicity symptoms on the plants. The productive attributes of the root system were positively modified by nitrate, nitrate+ammonium and urea and by the high potassium rates. The SPAD value increased with nitrate, nitrate+ammonium and urea and potassium at 336 mg dm-3 resulted in 38 SPAD units. Chlorophyll concentration of 35 mg g-1 corresponded to a total nitrogen concentration of 22.5 g kg-1. Nitrate reductase activity increased with higher potassium rates and nitrate+ammonium supply. Higher concentrations of putrescine, spermidine, spermine and proline were observed with ammonium supply, but they decreased with higher potassium rates. The low concentration of 15NH4 + in the soil after the second week indicates that all ammonium was immobilized by soil microorganisms, for all combinations. The application of ammonium in combination with Marandu residue resulted in higher concentration of ammonium, amino acid, amino sugar and total nitrogen hydrolysates.

Importantes produtos úteis à sociedade podem ser obtidos a partir do bagaço de cana-deaçúcar, como por exemplo, o etanol de segunda geração. Para a produção deste álcool, reforçam-se estudos visando alternativas de processos diferenciados, como por exemplo, utilizando células imobilizadas em biorreatores. O presente trabalho teve como objetivos o estudo de condições de imobilização da levedura Scheffersomyces shehatae UFMG-HM 52.2, encapsulada em gel de alginato de cálcio, e a avaliação de condições de produção de etanol a partir de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar, com as células imobilizadas em processos operados em reator de leito fluidizado. Inicialmente, o bagaço de cana-de-açúcar foi submetido à hidrólise ácida seguida de concentração e destoxificação do hidrolisado hemicelulósico. Em ensaios fermentativos em frascos Erlenmeyer, com a nova e promissora levedura fermentadora de pentoses, Scheffersomyces shehatae UFMGHM 52.2 na forma livre, testou-se diferentes meios nutricionais para a seleção dos nutrientes importantes na suplementação do hidrolisado hemicelulósico. Após análise, escolheu-se o meio composto por 5 g/l de sulfato de amônio, 3 g/l de extrato de levedura e 3 g/l de extrato de malte para as fermentações subsequentes. Utilizando-se este meio, observou-se valores de fator de rendimento (YP/S) e produtividade volumétrica em etanol (QP) de 0,38 g/g e 0,19 g/l.h, respectivamente. Em uma primeira etapa, determinou-se as condições de imobilização celular da levedura por encapsulamento em gel de alginato de cálcio, utilizando um planejamento experimental 23 completo com três pontos centrais. Avaliou-se a influência da concentração de alginato de sódio, de cloreto de cálcio e tempo de cura, tendo como variáveis resposta YP/S e QP. Pela análise estatística e fermentativa, definiu-se o uso da concentração de 1% de alginato de sódio, 0,2 M de cloreto de cálcio e 12 h de tempo de cura para o processo de imobilização celular. Nesta condição, observou-se valores de YP/S e QP de 0,32 g/g e 0,14 g/l.h, respectivamente. Posteriormente, conduziuse fermentações utilizando células imobilizadas em modo de bateladas repetidas em frascos Erlenmeyer, verificando-se a estabilidade na produção de etanol em cinco ciclos fermentativos consecutivos. Em uma segunda etapa, avaliou-se as condições de produção de etanol utilizando células imobilizadas em reator de leito fluidizado, por meio de planejamento experimental 22 completo com três pontos centrais. Avaliou-se a influência da vazão de aeração e massa de suporte com células imobilizadas, tendo como variáveis resposta YP/S e QP. A partir da análise estatística e fermentativa, verificou-se como melhores condições para o processo, o uso de 200 g de suporte e 200 ml/min de vazão de aeração. Nestas condições, observou-se valores de YP/S e QP de 0,26 g/g e 0,17 g/l.h, respectivamente. Sob estas condições de processo, realizou-se também fermentações em modo de bateladas repetidas, verificando-se a estabilidade do sistema operacional de produção de etanol em sete ciclos fermentativos consecutivos. Por estes resultados, concluiu-se que esse processo fermentativo com células imobilizadas em reator de leito fluidizado apresenta destacada potencialidade, podendo servir como conhecimentos para estudos futuros visando a sua implementação em maiores escalas. / Important useful products to society can be obtained from sugarcane bagasse, e.g. secondgeneration ethanol. For the production of this alcohol, studies are focused on alternatives for different processes, e.g., using immobilized cells in bioreactors. This work had as objectives the study of immobilization conditions on the yeast Scheffersomyces shehatae UFMG-HM 52.2, encapsulated in gel of calcium alginate, and evaluating the conditions of ethanol production from sugarcane bagasse hemicellulosic hydrolysate, with the immobilized cells in the process carried out in a fluidized bed reactor. Initially, the sugarcane bagasse was subject to acid hydrolysis followed by concentration and detoxification of hemicellulosic hydrolysate. In fermentation tests in Erlenmeyer flasks, with the novel and promising pentose fermenting yeast, Scheffersomyces shehatae UFMGHM 52.2 in free form, different nutritional media were tested for the selection of important nutrients in the supplementation of hemicellulosic hydrolysate. After the analysis, the medium composed of 5 g/l of ammonium sulfate, 3 g/l of yeast extract and 3 g/l of malt extract was chosen for subsequent fermentations. By using this medium, it was observed values of etanol yield (YP/S) and volumetric productivity (QP) of 0.38 g/g and 0.19 g/l.h, respectively. In a first step, it was determined the yeast cells immobilization conditions by encapsulation in calcium alginate gel using a 23 full factorial design with three central points. The influence of the concentration of sodium alginate, calcium chloride and conditioning time was evaluated, with the response variables YP/S and QP. By statistical and fermentative analysis, it was chosen the concentrations of 1% for sodium alginate, 0.2 M for calcium chloride and 12 h for conditioning time in the immobilization process. In this condition, it was observed values of YP/S and QP of 0.32 g/g and 0.14 g/l.h, respectively. Thus, fermentations were performed applying immobilized cells in Erlenmeyer flasks in repeated batch, where the stability of ethanol production in five consecutive cycles was verified. In a second step, the conditions of ethanol production using immobilized cells in fluidized bed reactor were evaluated, by using a 22 full factorial design with three central points. In this investigation, the influence of aeration rate and mass of suport with immobilized cells was tested, and the response variable were YP/S and QP. By statistical and fermentative analysis, it was found that the best conditions for the process included the use of 200 g of support with immobilized cells and 200 ml/min for aeration rate. Under these conditions, it was observed values of YP/S and QP of 0.26 g/g and 0.17 g/l.h, respectively. Also, under the same conditions, repeated batch fermentations were carried out, where it was verified that ethanol production system stability in seven consecutive fermentation cycles. For these results, it was concluded that this fermentation with immobilized cells in fluidized bed reactor offers outstanding potential and could be used as basis for future studies aiming its implementation in large scales.

O presente estudo teve como principal objetivo avaliar a capacidade de Saccharomyces cerevisiae em metabolizar os compostos tóxicos presentes em hidrolisados hemicelulósicos de palha de arroz (HHPA) e de poda de oliveira (HHPO), visando a obtenção de hidrolisados com menor grau de toxicidade para Pichia stipitis. Após determinada a composição dos hidrolisados (açúcares e compostos tóxicos) foi avaliado o nível de concentração do HHPA capaz de inibir o metabolismo de P. stipitis. Em seguida, foi avaliado o efeito do tempo, concentração de S. cerevisiae, pH e aeração sobre a composição destes hidrolisados, tendo como resposta a fermentabilidade de P. stipitis. Nas condições otimizadas do biotratamento, as fermentações de P. stipitis foram conduzidas em frascos agitados e em biorreator, e as respostas avaliadas foram o consumo de D-xilose, fator de conversão de substrato em etanol (YP/S) e produtividade volumétrica em etanol (QP). Os ensaios de biotransformação destes hidrolisados, assim como do meio sintético (MS), o qual mimetizou o teor de açúcares e compostos tóxicos presentes no HHPA, mostraram que as modificações na composição destes meios foram dependentes do tempo de tratamento. Durante o tratamento, a levedura S. cerevisiae foi capaz de consumir apenas a D-glicose com baixas produções de etanol glicerol e ácido acético. Além disso, no HHPA e MS o 5-HMF e furfural foram quase que totalmente assimilados (> 90%), com formação de baixos teores de ácido furóico. Nestes meios, S. cerevisiae converteu parcialmente os ácidos ferúlico (15%) e p-cumárico (20%), sendo observado apenas produto de conversão do ácido ferúlico (álcool vanilil). A vanilina foi completamente assimilada em MS, porém, em HHPA foi constatado um residual do composto (42%), sendo o álcool vanilil o principal produto de conversão. Em relação ao HHPO foi observada assimilação de 47% de furanos totais e 11% de fenólicos totais, não sendo identificados produtos de conversão. Os resultados da fermentação de P. stipitis em HHPA mostraram que o tratamento biológico por 6 horas favoreceu o consumo de D-xilose e a produção de etanol, indicando que este parâmetro é um importante fator a ser considerado. Nestas condições, o consumo de D-xilose foi de 57% com produção de 9 g/L de etanol (YP/S = 0,18 g/g e QP = 0,086 g/L.h). Os resultados da fermentação do HHPO apresentaram valores inferiores de YP/S (0,14 g/g) e QP (0,060 g/L.h) quando comparados ao HHPA, o que indica um maior grau de toxicidade deste hidrolisado. Em relação ao MS, verificou-se que o biotratamento favoreceu em aproximadamente 40% o consumo de D-xilose e a produção de etanol por P. stipitis, quando comparado com o MS não-tratado. As melhores condições de concentração de S. cerevisiae (5 g/L), pH (3,0) e fator de aeração (6,5) definidas no HHPA através de um planejamento experimental, proporcionou um consumo de 67% de D-xilose por P. stipitis, com produção de 13,5 g/L de etanol (YP/S = 0,24 g/g e QP = 0,15 g/L.h). Na fermentação em biorreator, P. stipitis foi capaz de consumir totalmente a D-xilose, produzindo 23 g/L de etanol, após 44 horas. Com base nestes resultados, pode-se concluir que o tratamento dos hidrolisado hemicelulósicos com S. cerevisiae é uma técnica promissora capaz de diminuir o grau de toxicidade destes meios com consequente melhoria em sua fermentabilidade, especialmente na velocidade de produção de etanol. / The aim of this work was to study the ability of Saccharomyces cerevisiae to metabolize a variety of toxic compounds found in rice straw (RSHH) and olive tree pruning (OTHH) hemicellulosic hydrolysates, in order to obtain hydrolysates with lower toxicity for Pichia stipitis. After determined the hydrolysate composition (sugar and toxic compounds) was evaluated the RSHH concentration level able to inhibit the P. stipitis metabolism. Then, the effect of time, S. cerevisiae concentration, pH and aeration on the hydrolysates composition was evaluated, and the fermentation was used as response. Under optimized conditions of biotreatment, P. stipitis fermentations were conducted in shake flasks and in bioreactor. In relation to the biotransformation assays of these hydrolysates, as well as synthetic medium (SM), with the same sugar and toxic compounds concentrations found in RSHH, the results showed that changes in the media compositions were dependent on the treatment time. During the treatment, S. cerevisiae consumed only D-glucose with low ethanol, glycerol, and acetic acid production. Furthermore, in SM and RSHH media, 5-HMF and furfural were almost completely assimilated (> 90 %), with low levels of furoic acid formation. In these media, S. cerevisiae partially converted ferulic acid (15%) and p-coumaric acid (20%), being observed only the conversion product of ferulic acid (vanillyl alcohol). Vanillin was totally assimilated in SM, however a residual of this compound (42%) was observed in RSHH, being vanillyl alcohol the main conversion product. Regarding OTHH was observed the assimilation of total furans (47%) and total phenolic (11%), and no conversion products were identified. The results from the P. stipitis fermentation in RSHH showed that biotreatment for 6 hours favored D-xylose consumption and ethanol production, indicating that this parameter is an important factor to be considered. In these conditions, D-xylose consumption was 57% with 9 g/L ethanol production (YP/S = 0.18 g/g QP = 0.086 g/Lh). The results of OTHH fermentation showed lower YP/S (0.14 g/g) and QP (0.060 g/L.h ) compared to RSHH, which indicates a higher degree of toxicity in OTHH. Regarding SM, the biotreatment increased D-xylose consumption and ethanol production by P. stipitis in approximately 40%, when compared with untreated-SM. The most suitable conditions of S. cerevisiae concentration (5 g/ L), pH (3.0) and the aeration factor (6.5) defined in RSHH through an experimental design, provided 67% of D-xylose consumption, and 13.5 g/L ethanol production by P. stipitis (YP/S = 0.24 g/g QP = 0.15 g/L.h). In bioreactor, P. stipitis was able to completely consume D-xylose, producing 23 g/L ethanol after 44 hours. Based on these results, it can be concluded that previous treatment of hemicellulose hydrolysates with S. cerevisiae is a promising technique capable of reducing the toxicity degree of RSHH and OTHH, with consequent improvement in their fermentability, especially on ethanol production rate.