PROBLÉMATIQUE. Le tabagisme induit une réponse inflammatoire pulmonaire qui, lorsque soutenue, peut engendrer des dommages tissulaires. Il existe des systèmes de régulation de l’inflammation afin de maintenir et de rétablir l’homéostasie cellulaire tel que le système « Signal regulatory protein alpha » (SIRPa)/CD47. SIRPa est exprimée principalement par les cellules myéloïdes, alors que CD47 est retrouvée de façon ubiquitaire. Il a été démontré que l’activation de SIRPa par la protéine de fusion CD47-Fc réduit la réponse inflammatoire pulmonaire dans un modèle d’asthme allergique sensibilisé à l’ovalbumine. Nous posons donc l’hypothèse que l’activation de SIRPa pourrait limiter l’inflammation pulmonaire induite par la fumée de cigarette. OBJECTIFS. 1) Évaluer l’effet de la fumée de cigarette sur les niveaux d’ARNm et protéiques de SIRPa. 2) Investiguer l’impact d’une activation de SIRPa sur l’inflammation pulmonaire induite par la fumée de cigarette. MÉTHODES. Des souris BALB/c ont été exposées à la fumée de cigarette 2h/jour, 5 jours/semaine pendant 2, 8 et 24 semaines afin d’explorer, par qPCR, les niveaux d’ARNm de SIRPa. D’autres protocoles d’exposition de 4 jours ont été réalisés afin de déterminer les niveaux protéiques de SIRPa par cytométrie en flux et d’investiguer l’impact d’une activation de SIRPa par l’administration systémique du CD47-Fc. L’efficacité du CD47-Fc sur la réponse inflammatoire pulmonaire a été déterminée par des comptes cellulaires totaux et différentiels dans le lavage broncho-alvéolaire. RÉSULTATS. En contexte tabagique, les niveaux d’ARNm de SIRPa augmentent dans le poumon alors que le nombre de phagocytes exprimant cette protéine semble diminuer. Or, SIRPa est retrouvée en plus grande quantité sur les cellules qui l’expriment toujours. L’administration du CD47-Fc engendre une diminution de la neutrophilie chez les souris fumeuses. CONCLUSION. Ces résultats suggèrent que le CD47-Fc peut réduire l’inflammation pulmonaire induite par la fumée de cigarette. De plus amples recherches permettront d’évaluer son potentiel thérapeutique. / RATIONAL. Smoking induces an inflammatory response in the lung that can cause significant tissue damage if sustained. Fortunately, there exist inflammatory regulatory pathways that help maintain and restore cellular homeostasis, such as through the signal regulatory protein alpha (SIRPa)/CD47 system. SIRPa is mainly expressed by myeloid cells while CD47 is found ubiquitously. It has been shown that activation of SIRPa by CD47-Fc fusion protein reduces the inflammatory pulmonary response in an ovalbumin-induced allergic asthma mouse model. Thus, we hypothesize that activation of SIRPa could limit lung inflammation induced by cigarette smoke exposure. OBJECTIVES. 1) To evaluate the effect of cigarette smoke on SIRPa mRNA and protein levels. 2) To investigate the impact of SIRPa activation on lung inflammatory response induced by cigarette smoke exposure. METHODS. SIRPa mRNA levels were explored by qPCR in BALB/c mice that were exposed to cigarette smoke 2 hours/day, 5 days/week during 2, 8 and 24 weeks. Also, 4 days cigarette smoke protocols were performed to investigate SIRPa protein levels by flow cytometry and to evaluate the impact of SIRPa activation by systemic administration of CD47-Fc. Treatment efficacy was determined via total and differential cellular count in the bronchoalveolar lavage (BAL). RESULTS. SIRPa mRNA levels were increased in the lungs of mice exposed to cigarette smoke. Although, the number of phagocytes expressing SIRPa protein seems to decrease, our data show that these cells expressed SIRPa at a higher intensity. Finally, we found that CD47-Fc treatment reduced neutrophilia in BAL of mice exposed to cigarette smoke. CONCLUSION. These results demonstrate that CD47-Fc treatment can reduce lung inflammation induced by cigarette smoke exposure, suggesting further research into CD47-Fc therapeutic potential is required.

Le 24S-hydroxycholestérol (24S-OH) est un dérivé oxydé du cholestérol retrouvé dans le plasma chez l’humain. C’est un activateur endogène du Liver-X-Receptor (LXR) et un biomarqueur plasmatique potentiel pour diverses maladies neurodégénératives. Les concentrations de 24S-OH dans le plasma sont influencées par son métabolisme hépatique mais sa conjugaison dans le foie n’a pas été caractérisée à ce jour. Après analyse d’échantillons humains de plasma et d’urine par LC-MS/MS, le 24S-hydroxycholestérol-3 sulfate, 24S-hydroxycholestérol-24 glucuronide et 24S-hydroxycholestérol-3 sulfate, 24 glucuronide ont pu être identifiés. Les enzymes responsables de leurs formations au niveau du foie sont principalement UGT1A4 et SULT2A1. De plus, alors que le dérivé sulfaté montre une activité agoniste envers LXRα, les dérivés glucuronidés sont inactifs. Ces résultats indiquent que la glucuronidation et la sulfatation du 24S-OH affectent différemment son activité biologique pour LXRα. De plus, puisqu’UGT1A4 est régulé par LXRα, il est possible de dire que le 24S-OH est régulé par une boucle de rétrocontrôle. / 24S-hydroxycholesterol (24S-OH) is an oxidized derivative of cholesterol detected in the human plasma. It acts as a Liver-X-Receptor (LXR) agonist and its plasmatic levels have also proposed as potential biomarkers for several neurodegenerative diseases. Circulating 24S-OH levels are influenced by its hepatic elimination but the enzymatic processes involved in its conjugation in the liver have only received limited attention. After analysis of human plasma samples by LC-MS/MS, the 24S-hydroxycholesterol-3 sulfate, 24S-hydroxycholesterol-24 glucuronide and 24S-hydroxycholesterol-3 sulfate, 24-glucuronide were identified. The enzymes responsible for their formation in the liver are identified as UGT1A4 and SULT2A1. In addition, while the sulfated derivative shows a LXR agonist activity, glucuronidated derivatives are inactive. These results indicate that 24S-OH glucuronidation and sulfation affect differently its biological activity. Since UGT1A4 is regulated by LXRα, it can be envisioned that 24S-OH hepatic metabolism is controlled by a feedback loop.

Les évidences observationnelles suggèrent une association entre la consommation de produits laitiers et une diminution du risque de diabète de type 2. Néanmoins, les études cliniques demeurent controversées, probablement en raison de la grande variabilité interindividuelle en réponse aux produits laitiers. De plus, très peu d’études utilisent des biomarqueurs objectifs pour évaluer la consommation de produits laitiers. L’analyse sérique des profils de métabolites avec la métabolomique pourrait être une stratégie intéressante d’identification de biomarqueurs de la consommation de produits laitiers et ainsi, améliorer la précision des évaluations nutritionnelles dans les études cliniques. L’objectif global de ce mémoire est d’observer l’effet d’une consommation augmentée de produits laitiers sur les différents paramètres glycémiques et insulinémiques associés au diabète de type 2, de même que sur les profils métabolomiques chez des sujets hyperinsulinémiques. De plus, un objectif spécifique est d’évaluer la réponse interindividuelle en réponse aux produits laitiers. La réalisation d’un essai randomisé en chassé-croisé entrepris auprès de 27 adultes hyperinsulinémiques suggère qu’une consommation de ≥4 portions/jour de produits laitiers pendant 6 semaines n’affecte pas les différents paramètres glycémiques et insulinémiques comparativement à ≤2 portions/jour. Néanmoins, augmenter à ≥4 portions/jour la consommation de produits laitiers semble accentuer la résistance à l’insuline comparativement à avant l’intervention. Toutefois, une grande variabilité dans la réponse interindividuelle fut remarquée pour la résistance à l’insuline, suggérant qu’une consommation augmentée de produits laitiers pourrait être favorable ou défavorable selon les individus. De plus, une consommation de ≥4 portions/jour affecte les profils de métabolites de façon distincte à ≤2 portions par jour, suggérant une signature de métabolites spécifique au nombre de portions consommées. Davantage d’études de longue durée tenant compte de la variabilité interindividuelle et utilisant des biomarqueurs objectifs sont requises afin d’identifier les individus qui pourraient réellement bénéficier d’une augmentation de leur consommation produits laitiers pour prévenir le diabète de type 2. / Observational evidences suggest an association between dairy product intake and a reduced risk of developing type 2 diabetes. However, results from clinical studies remain controversial, notably due to large interindividual variability in response to dairy products. Further, clinical studies using objective dietary biomarkers to assess dietary intake are missing. Serum metabolite analysis using metabolomics could be a novel strategy to identify new biomarkers of dairy product intake and thus, improving accuracy of nutritional evaluations in clinical studies. The main objective of this research was to observe the effects of increased dairy product intake on type 2 diabetes related risk factors such as glycemic and insulinemic parameters, along with metabolomic profiles in hyperinsulinemic subjects. Interindividual variability in response to dairy products was also assessed as a specific objective. Results from a cross-over randomized controlled trial undertaken among 27 hyperinsulinemic adults suggest that consuming 4 servings or more of dairy products daily for 6 weeks does not affect glycemic and insulinemic parameters compared to a standard intake of dairy products (2 servings or less per day). Yet, increasing dairy intake to 4 servings or more per day increased insulin resistance compared with baseline values, without affecting insulin secretion of β-cells function. However, large inter-individual variability in response to dairy products was denoted for insulin resistance, suggesting that higher intake of dairy products might be unfavorable or beneficial depending on the individual. Further, consuming 4 servings or more of dairy products daily affected serum metabolomic profiles distinctly from consuming ≤2 servings per day, suggesting specific metabolite signature to increased dairy product intake. Additional long-term trials studying interindividual variability and using objective biomarkers of dairy intake are required to identify which individuals may really benefit from increasing dairy intake to prevent type 2 diabetes.

Les démences sont un problème grandissant dans le monde, principalement à cause du vieillissement de la population. En 2019, ces maladies représentaient la septième cause de décès dans le monde selon l'OMS. D'ici 2050, il est projeté que plus de 130 millions de personnes recevront un diagnostic de démence, dont 70% des cas seront de la maladie d'Alzheimer. Cette maladie, touchant particulièrement les femmes, est caractérisée par l'accumulation d'anormalités protéiques dans le cerveau, soit les plaques d'amyloïde bêta et les enchevêtrements neurofibrillaires de protéine Tau phosphorylée, ainsi que d'une perte synaptique menant à l'apparition de déficits cognitifs chez les patients. Bien que les mutations sur les gènes APP, PSEN1 et PSEN2 soient reconnus comme étant la cause de la forme familiale de la maladie, plus de 95% des cas sont sporadiques et les causes demeurent toujours inconnues à ce jour. Cependant, les études d'association pangénomiques commencent à identifier de nombreux facteurs de prédispositions, dont des mutations sur plusieurs gènes directement liés à la réponse immunitaire cérébrale. Parmi ces facteurs de risque, la mutation R47H sur le gène Trem2, un récepteur exclusivement exprimé par les microglies dans le SNC, a retenu l'attention. Les patients porteurs de cette mutation souffrent d'une forme particulièrement agressive de la pathologie. Également, les recherches récentes montrent que l'intensité des déficits cognitifs corrèle avec l'accumulation de formes pathologiques de Tau. Notre laboratoire s'est donc intéressé à cet aspect de la maladie. Sachant que les microglies, étant le macrophage résident du SNC, jouent un rôle central dans l'établissement de la réponse immunitaire et que Trem2 est un facteur central au niveau du changement phénotypique de la microglie vers un état d'activation, nous avons posé l'hypothèse que Trem2 est un facteur essentiel au niveau de la réponse microgliale efficace contre les formes pathologiques de la protéine Tau. Pour valider cette hypothèse, nous avons procédé à une série de tests comportementaux dans le modèle murin de démence hTau et avec des animaux hTau Trem2$^\textup{-/-}$. En effet, l'absence de Trem2 affecte les déficits cognitifs, principalement au niveau de l'anxiété. Cependant, l'âge avancé demeure le facteur de risque le plus important de la maladie. Sachant que l'accumulation de débris de myéline est un phénomène observé dans le cerveau vieillissant, nous nous sommes questionnés sur l'impact des défauts de myélinisation sur la pathologie de Tau. De plus, sachant que Tau est une protéine axonale assurant normalement la stabilité des microtubules et que l'intégrité des axones est essentielle afin d'assurer une myélinisation efficace, nous avons émis l'hypothèse que la protéine Tau est essentielle au maintien de l'homéostasie cérébrale via entre autres la myélinisation. En effet, nos résultats montrent que la déficience en Tau mène à une quantité de myéline moindre dans le cortex dans un contexte de vieillissement à l'état basal, mais également dans le cortex et le corps calleux après un épisode de démyélinisation. De plus, l'absence de Tau est liée à une exacerbation des dommages subis sur les neurones du corps calleux caudal et rostral par un épisode de démyélinisation de cinq semaines. Ce mémoire montre donc l'implication de Trem2 au niveau de l'exacerbation des déficits cognitifs et de l'anxiété chez le modèle murin hTau, ainsi que l'implication de la protéine Tau dans les processus de myélinisation ainsi que dans la limitation de dommages subis sur les axones à la suite d'un épisode de démyélinisation toxique. / Dementia is a growing problem worldwide, primarily due to the aging population. In 2019, dementia was the 7th leading cause of death globally, according to the World Heath Organisation. By 2050, it is projected that over 130 million people will suffer from dementia, with 70% of cases being Alzheimer's disease diagnoses. This progressive neurodegenerative disease, which disproportionately affects women, is characterized by the accumulation of abnormal proteins structures, such as beta-amyloid plaques and neurofibrillary tangles of phosphorylated Tau protein, accompanied by synaptic loss. These three hallmarks lead to cognitive deficits in patients, that eventually completely loss their autonomy. While mutations in the APP, PSEN1, and PSEN2 genes are known to cause the familial form of the disease, over 95% of cases are sporadic and their causes remain unknown. However, large-scale genomic studies are beginning to identify numerous predisposing factors, including mutations in several genes directly related to the brain immune response. Among these risk factors, the R47H mutation in the Trem2 gene, a receptor exclusively expressed by microglia in the central nervous system (CNS), has garnered attention because patients carrying this mutation suffer from a particularly aggressive form of the pathology. Given that microglia, as the resident macrophages of the CNS, play a central role in immune response and that Trem2 is crucial in phenotypic changes of microglia towards an "activated" state, our hypothesis was that Trem2 is essential in the effective microglial response against pathological forms of Tau protein. To validate this hypothesis, we conducted a series of behavioral tests in hTau and hTau Trem2$^\textup{-/-}$ animals. Indeed, the absence of Trem2 affects cognitive deficits, particularly anxiety-related behaviors. We also explored the involvement of Tau protein in brain myelination processes. Advanced age remains the most significant risk factor for the disease. Knowing that myelin debris accumulation is a phenomenon observed in the aging brain, we questioned the impact of myelination defects on Tau pathology. Furthermore, knowing that Tau is an axonal protein normally responsible for the stability of microtubules and that the integrity of axons is essential for effective myelination, we hypothesized that Tau protein is essential for maintaining cerebral homeostasis, among other things, through myelination. Indeed, our results show that Tau deficiency leads to a reduced amount of myelin in the cortex in the context of basal aging, but also in the cortex and corpus callosum after an episode of demyelination. Additionally, the absence of Tau is linked to an exacerbation of the damage sustained by the neurons of the caudal and rostral corpus callosum from a five-week demyelination episode. This thesis thus demonstrates the involvement of Trem2 in the exacerbation of both cognitive deficits and anxiety in hTau mouse model, as well as the involvement of the Tau protein in myelination processes and in limiting damage to axons following a toxic demyelination episode

De nombreux processus métaboliques nécessitent la présence de fer en tant que cofacteur. Paradoxalement, la surabondance en fer peut contribuer à la formation de dérivés oxygénés hautement réactifs qui sont toxiques pour la cellule. Ceci fait en sorte que sa concentration intracellulaire doit être finement régulée. Chez la levure à fission, Schizosaccharomyces pombe, plusieurs mécanismes participent à l'établissement de l'homéostasie du fer. Parmi ces mécanismes, on y retrouve des protéines de transport du fer à la surface cellulaire, ainsi que d'autres responsables de la séquestration de l'ion à l'intérieur de la vacuole. Un rôle pour la vacuole consiste à emmagasiner le fer afin de détoxifier la cellule s'il est trop abondant. Du même coup, la vacuole sert de réservoir qui pourra redonner le fer plus tard à la cellule si cette dernière croît en condition de rareté pour cet élément. La voie par laquelle le fer peut ressortir de la vacuole n'a cependant pas encore été identifiée. L'objectif de cette étude est d'identifier le transporteur responsable du relâchement du fer de la vacuole vers le compartiment cytosolique. Nos recherches ont permis d'identifier un candidat, un transporteur transmembranaire de type ABC (ATP binding cassette) nommé Abc3, dont l'expression augmente de 16.9 fois en carence de fer selon des études comparatives par biopuces à ADN. Tout d'abord, l'étude de la régulation du gène abc3[indice supérieur +] a été effectuée selon la présence ou non de fer dans le milieu de culture. L'expression du gène abc3[indice supérieur +] a été comparée avec d'autres gènes codant pour d'autres protéines de la même famille. Seul le gène abc3[indice supérieur +] a montré une expression variant selon le statut en fer. Il est réprimé en présence de fer et activé en carence de ce dernier. Par la suite, des éléments en cis du promoteur abc3[indice supérieur +] pouvant être responsables de la régulation selon le statut en fer ont été analysés. Parmi ces derniers, nous avons démontré que seul l'élément de régulation le plus près du cadre de lecture est fonctionnel permettant la répression du gène abc3[indice supérieur +] en présence de fer. Un essai fonctionnel permettant de montrer l'importance de la protéine Abc3 a été mis au point. Ainsi, une souche nulle pour le gène abc3[indice supérieur +] montre une perte de croissance en présence de cérulénine, un antibiotique qui inhibe la biosynthèse des acides gras. La souche abc3[delta] mutante est également sensible à la présence du chélateur de fer, le 2,2-dipyridyl (Dip), lorsque le système de transport de surface constitué de Fio1 et de Fip1 est inactivé. Une protéine Abc3 portant une étiquette fluorescente exprimée sous le contrôle du promoteur endogène abc3[indice supérieur +] a permis de localiser la protéine Abc3-GFP au niveau des vacuoles en carence de fer. Des analyses de profils transcriptionnels ont indiqué que l'expression forcée du gène abc3[indice supérieur +] en présence de fer active le répresseur Fep1. La surexpression du transporteur Abc3 libérerait plus de fer de la vacuole ce qui aurait pour effet d'activer Fep1, résultant en la répression de la transcription des gènes impliqués dans l'acquisition du fer à la surface cellulaire. Les résultats obtenus sur Abc3 suggèrent fortement que cette protéine pourrait être impliquée dans l'exportation du fer de la vacuole vers le cytoplasme de la levure lorsque cette dernière croît en carence de fer.

Le diabète de Type 1 est une maladie auto-immune caractérisée par la perte de production d'insuline par les îlots [béta] du pancréas. Les causes menant à la destruction de ces îlots par les cellules T autoréactives sont méconnues. Certains événements tels qu'une infection virale ou des facteurs environnementaux peuvent déclencher cette auto-immunité. Chez le rat BB-DP qui développe un diabète de type 1 semblable à l'homme, une mutation qui affecte les cellules T a été découverte. La mutation nommée lyp amène une perte de survie des cellules T dans la périphérie malgré tous les facteurs de survie des cellules T présents chez l'animal. Cette mutation située sur le chromosome 4 affecte un gène de la famille GIMAP, plus particulièrement la protéine GIMAP5 qui se retrouve tronquée et non fonctionnelle. Des résultats du laboratoire ont démontré une implication de GIMAP5 dans la voie du calcium. La manière par laquelle GIMAP5 joue son rôle dans la survie des lymphocytes T n'est pas connue. Afin de comprendre ces fonctions, nous voulons identifier la localisation cellulaire de GIMAP5 ainsi que ses partenaires d'interaction. Les lignées cellulaires transfectées avec le gène de GIMAP5 étiqueté ont été marquées en fluorescence à l'aide de marqueurs d'organelles et examinées en microscopie confocale afin de déterminer la localisation de GIMAP5. Une étude de double-hybride combinée avec des marquages fluorescents à l'aide d'anticorps fluorescents dirigés contre ces protéines et l'utilisation de la microscopie confocale permettent de vérifier les partenaires d'interaction de GIMAP5. Les cellules T de rats gimap5[indice supérieur lyp/lyp] et sauvages ont été utilisées afin de faire des marquages au Rhod-2 (calcium mitochondrial) et de vérifier l'effet de la mutation sur la capacité des mitochondries à absorber le calcium. Une localisation de GIMAP5 au niveau du RE a été identifiée dans les cellules HEK 293T surexprimant GIMAP5, mais n'as [i.e. n'a] pu être vu chez les lignées de cellules T Jurkats. Les résultats de l'étude de double-hybride ont donné des partenaires d'interaction de faible affinité (avec une cote de D). Les essais de microscopie confocale n'ont pu démontrer cette interaction. Finalement, les mitochondries des cellules T de rats gimap5[indice supérieur lyp/lyp] ont une vitesse d'incorporation du calcium plus lente et un retour à la normale plus lent que les mitochondries des cellules T de rats sauvages. Chez le rat, GIMAP5 semble jouer un rôle au niveau de l'homéostasie du calcium et de l'intégrité des mitochondries, puisque la mutation gimap5[indice supérieur lyp/lyp] apporte une baisse du potentiel membranaire des mitochondries et une baisse de l'accumulation du calcium par ces dernières.Le mécanisme par lequel GIMAP5 régule l'homéostasie du calcium reste encore à élucider.

Le fer est un cofacteur essentiel à la croissance des organismes. Cependant, un surplus de fer conduit à la production de dérivés toxiques de l’oxygène qui sont dangereux pour les cellules. La concentration intracellulaire de fer doit donc être régulée. Lorsque la biodisponibilité du fer s’amenuise, la plupart des cellules augmentent leur acquisition du fer environnemental tout en réduisant sa consommation en réprimant plusieurs voies métaboliques fer-dépendantes non-essentielles. Alors que les mécanismes qui régissent l’augmentation de l’acquisition du fer sont assez bien caractérisés, les composantes qui contrôlent la promotion de l’économie du fer sont largement méconnues. Mes travaux ont porté sur l’étude des mécanismes de contrôle de l’économie du fer chez la levure à fission Schizosaccharomyces pombe. Php4, une sous-unité du complexe liant les boîtes CCAAT, est responsable de la répression des gènes codants pour des protéines qui utilisent du fer lorsque ce dernier est en faible concentration. Il est déjà connu qu’en présence de fer, l’expression du gène php4+ est réprimée via le facteur de transcription Fep1. De plus, la protéine Php4 est inactivée et exportée hors du noyau lorsque les cellules croissent en présence de fer. Ce processus est dépendant à la fois de la présence de l’exportine Crm1 et de la monothiol glutarédoxine Grx4. L’objectif de recherche est de découvrir le mécanisme par lequel Grx4 inhibe Php4 en réponse à la présence de fer. L’approche du double-hybride a été utilisée pour quantifier la force de l’interaction entre Php4 et Grx4 et identifier les domaines de ces protéines qui y participent. Ce système nous a permis de déterminer que Php4 interagit de façon constitutive avec le domaine thiorédoxine (TRX) de Grx4, alors que l’interaction entre Php4 et le domaine glutarédoxine (GRX) est dépendante de la présence de fer. Nous avons déterminé que la cystéine 35 du domaine TRX et la cystéine 172 du domaine GRX sont essentiels pour l’interaction de chacun de ces domaines avec Php4. Des régions minimales de Php4 nécessaires pour son interaction avec chacun des domaines GRX et TRX ont aussi été identifiées. Par la suite, nous avons démontré que l’expression du domaine GRX seul de Grx4 est suffisante pour l’inactivation de Php4 en présence de fer. Puis, par des essais de fluorescence par complémentation bimoléculaire (BiFC), nous avons démontré que le domaine GRX de Grx4 interagit de façon fer-dépendante avec Php4 et qu’il est suffisant pour l’exportation de Php4 hors du noyau en présence de fer. Ces résultats révèlent que le mécanisme par lequel Php4 est inhibé en présence de fer dépend de son interaction avec le domaine GRX de Grx4. À la suite des résultats obtenus, un modèle illustrant l’interaction fer-dépendante entre Grx4 et Php4 suggère la présence potentielle d’un centre fer-soufre qui pourrait expliquer la nature de l’interaction fer-dépendante entre les deux protéines.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La pollution par les métaux lourds entraine des conséquences néfastes pour les sols et pour les communautés qui les colonisent. Afin d'étudier la diversité des mécanismes moléculaires mis en jeu par ces organismes en réponse au stress métallique, deux approches différentes ont été menées.Premièrement, une approche ciblée de caractérisation fonctionnelle de gènes impliqués dans l'homéostasie et la tolérance au zinc a été menée chez Laccaria bicolor, un champignon ectomycorhizien modèle à forte valeur économique ajoutée. L'homéostasie et la tolérance au zinc sont essentiellement liées à l'activité des transporteurs des familles ZIP (Zrt-, Irt- related Protein) et CDF (Cation Diffusion Facilitator). Une étude phylogénétique a permis de mettre en évidence une expansion du nombre de gènes appartenant à ces deux familles dans le génome de L. bicolor, comparé à celui de S. cerevisiae. Le niveau d'expression de ces différents gènes a ensuite été étudié dans différents tissus fongiques ou en présence de différentes concentrations en zinc. L'étude s'est poursuivie par la caractérisation fonctionnelle et la localisation subcellulaire de plusieurs membres CDF et ZIP. L'ensemble de ces analyses ont permis d'affiner fortement les connaissances dans le domaine de l'homéostasie et de la tolérance au zinc chez les champignons ectomycorhiziens. Enfin, une approche expérimentale innovante de métatranscriptomique a également été utilisée. Cette étude du métatranscriptome a permis la comparaison de fonctions exprimées au sein de communautés de microorganismes eucaryotes colonisant des sols d'intérêt (contaminé, anciennement contaminé et non contaminé par des métaux lourds). Des banques environnementales d'ADNc construites à partir des ARN messagers extraits directement de ces sols ont été criblées par complémentation fonctionnelle de mutants de levures sensibles au zinc. Cette étude a permis l'identification de nouveaux gènes et de nouveaux mécanismes impliqués dans la résistance au zinc. La mise au point de cette approche ouvre de nouvelles perspectives intéressantes au niveau de la recherche fondamentale mais aussi de la recherche appliquée en permettant la détection de gènes d'intérêt, que l'organisme soit cultivable ou non / Heavy metal pollution leads to harmful impacts on lands and their associated communities. In order to study the diversity of the molecular determinants involved in metal tolerance by these organisms, two different strategies were employed. First, the mechanisms involved in zinc homeostasis and tolerance were studied by functional characterization of selected genes in Laccaria bicolor, an ectomycorrhizal model fungus with high economic value. Zinc homeostasis and tolerance mechanisms are mainly achieve d through the intracellular traffic of zinc mediated by transporters belonging to the ZIP (Zrt-, Irt- related Protein) and CDF (Cation Diffusion Facilitator) families. Phylogenetic analyses revealed an expansion of both CDF and ZIP gene numbers in the genome of L. bicolor, when compared to that of S. cerevisiae. Gene expression was also studied in different fungal tissues or under different zinc concentrations in the culture medium. Moreover, the functional characterization of several CDF and ZIP members was performed, as well as their subcellular localization. These data allowed us to refine the knowledge on the molecular mechanisms involved in both zinc homeostasis and tolerance in ectomycorrhizal fungi. Finally, an innovative experimental approach of metatranscriptomics was used. The study of the soil metatranscriptome from eukaryotes allows the comparison of functions expressed in eukaryotic communities colonizing different types of soil (contaminated, formerly contaminated, or non-contaminated by heavy metals). Environmental cDNA libraries constructed from mRNA extracted directly from these soils were screened by functional complementation of yeast mutants sensitive to zinc. This study allowed the identification of new genes and new mechanisms involved in zinc resistance. The development of this approach opens new insights into both fundamental and applied research for the detection of genes of interest, whatever the organism is cultivable or not

La fixation biologique d’azote (réduction du N2 atmosphérique, non biodisponible, en ammonium (NH3) bioassimilable) est catalysée par la métalloenzyme nitrogénase. Cette enzyme existe sous trois isoformes chez la bactérie du sol Azotobacter vinelandii: les nitrogénases au molybdène (Mo), au vanadium (V) et au fer (Fe). L’acquisition des métaux cofacteurs constitue un paramètre d’intérêt majeur car Mo et V sont fortement complexés à la matrice (matière organique et oxydes) ce qui peut limiter leur disponibilité. Ces travaux ont montré que la présence d’acide tannique et d’oxydes de fer entraîne des changements majeurs dans la gestion des métaux cofacteurs (Mo et V) chez A. vinelandii. Les stratégies d’acquisition des métaux cofacteurs sont fortement modifiées en présence de ces complexants avec (i) un changement important de la quantité des metallophores produits ainsi que (ii) une acquisition simultanée de Mo et V dans des conditions traditionnellement considérées comme non limitantes en Mo. Ceci se traduit par un changement important dans l’utilisation des nitrogénases; les niveaux de transcrits élevés des gènes nifD et vnfD, spécifiques des nitrogénases au Mo et au V respectivement, suggèrent une utilisation simultanée de ces isoenzymes pour assurer la fixation d’azote. Ce projet a permis de mettre en évidence que face à un stress métallique, l’utilisation des isoformes de la nitrogénase par A. vinelandii est un processus plus versatile que précédemment décrit et que le coût d’acquisition des métaux dans ces conditions constitue un facteur important de la régulation de l’activité des nitrogénases. Ceci suggère que les nitrogénases alternatives pourraient contribuer à la fixation d’azote de manière plus importante que présentement admis.