HA (Hyaluronan, hyaluronic acid) is a predominant component of the extracellular matrix and plays diverse roles in the process of wound healing. The major significance of the biological functions of HA in wound healing arise from early studies showing that rich and prolonged existence of HA is associated with the fetal scarless wound healing. It has been hypothesized that adult wound healing can be modulated by the application of exogenous HA to make the process of wound repair more like regeneration. / In this thesis, the effects of molecular weight and concentration of HA on the biological behavior of human fibroblasts and keratinocytes have been investigated in both monolayer and 3D culture models. In addition, the mechanism for the HA-induced biological effects has also been investigated. Previous laboratory studies have primarily focused on individual cell type, but in wound healing in vivo there is considerable interaction between the keratinocytes and fibroblasts. The role of HA in keratinocyte-fibroblast interactions is not clear, so an organotypical culture model was used to investigate the keratinocyte differentiation and stratification and basement membrane formation with and without fibroblasts to explore the effect of HA on keratinocyte-fibroblast interactions. / The experimental data suggest that exogenous application of HA modulates the process of wound healing so that it becomes more like regeneration by regulating the biological functions of human keratinocytes and fibroblasts, including their interaction. By further understanding the HA-induced cell biological phenomena and involved mechanisms new approaches for wound care may be revealed. / The skin is the largest organ in the body. It consists of an outer layer, the epidermis supported by a connective tissue matrix, the dermis. The keratinocyte and fibroblast are the major cell types in the epidermis and dermis respectively. When the skin is damaged, the body will active a cascade of mechanisms to restore the tissue integrity. If the damaged tissue is limited to the epidermis, it will be restored by the process of regeneration. Regeneration involves the replacement of injured tissue by new tissue which has both form and function identical to the original tissue. If the defect involves the dermis, healing is achieved by repair which results in permanent scar formation. Wound healing is an extremely complex biological process which involves several overlapping steps; inflammation, granulation tissue formation and remodeling which are coordinated by various cell types, growth factors, cytokines and extracellular matrix components including hyaluronan. / Whilst there have been many studies looking at the effect of HA on different cell types using varying molecular parameters, concentrations and sources of HA, the result are often contradictory. Even the endogenous or exogenous application of HA have been reported to have opposite effects on cell behavior. / Gu, Hua. / Adviser: Andrew Bard. / Source: Dissertation Abstracts International, Volume: 71-01, Section: B, page: 0216. / Thesis (Ph.D.)--Chinese University of Hong Kong, 2009. / Includes bibliographical references (leaves 116-135). / Electronic reproduction. Hong Kong : Chinese University of Hong Kong, [2012] System requirements: Adobe Acrobat Reader. Available via World Wide Web. / Electronic reproduction. Ann Arbor, MI : ProQuest Information and Learning Company, [200-] System requirements: Adobe Acrobat Reader. Available via World Wide Web. / Abstract also in Chinese.

Introduction et objectifs La microchirurgie des pathologies cordales bénignes est une chirurgie fonctionnelle dont le but est daméliorer les caractéristiques mécaniques du vibrateur laryngé. Une connaissance approfondie de la structure cordale normale, de ses altérations pathologiques et des implications bio-mécaniques de la structure tissulaire, est indispensable à la réalisation dune microchirurgie cordale de qualité. Cest grâce aux connaissances de plus en plus approfondies de la structure cordale normale et surtout de son tissu conjonctif, la lamina propria, que la microchirurgie cordale a évolué dune chirurgie de résection pure et simple à une chirurgie fonctionnelle. Cest la partie la plus superficielle de la lamina propria, lespace de Reinke, qui joue le rôle le plus important dans la production du son. Cest aussi lespace de Reinke qui est occupé, détruit ou remanié en cas de pathologie cordale bénigne. La microchirurgie vise à le libérer du processus pathologique. Cest en augmentant la souplesse tissulaire et la fermeture glottique en phonation que le micro-chirurgien espère améliorer les caractéristiques du son laryngé émis. Loriginalité de ce travail est de tenter, non seulement de libérer lespace vibrant de la lésion cordale, mais aussi de modifier les processus cicatriciels post-opératoires par lutilisation dun implant résorbable dacide hyaluronique estérifié. Les objectifs de ce travail sont : - de contribuer à la connaissance des résultats fonctionnels laryngés et vocaux que lon peut attendre dune microchirurgie cordale - dévaluer limpact fonctionnel, sur ces résultats, de lutilisation dun implant résorbable dacide hyaluronique estérifié, en fin dintervention chirurgicale. Caractéristiques méthodologiques Ce travail est une étude clinique, prospective et comparative. Lutilisation dun implant résorbable dacide hyaluronique estérifié en fin dintervention microchirurgicale est une technique originale développée depuis février 2003 et que nous continuons à pratiquer. Les arguments qui ont conduit à implanter de lacide hyaluronique estérifié au sein de lespace de Reinke de certaines cordes opérées, sont été exposés. Le résultat fonctionnel laryngé et vocal obtenu chez 33 patients opérés de différentes lésions cordales bénignes et traités par implantation dacide hyaluronique estérifié dans la plaie microchirurgicale en fin dintervention (groupe implanté), est comparé à celui de 50 patients également opérés de lésions cordales bénignes mais qui ne bénéficient pas dune implantation dacide hyaluronique estérifié (groupe non-implanté). Les patients ont été opérés entre février 2003 et décembre 2006. Deux études statistiques distinctes ont été pratiquées : 1) une analyse de variance comparant les données préopératoires aux données postopératoires immédiates 2) Les observations différées (en dehors de la période post-opératoire immédiate) sont analysées par une étude statistique corrélationnelle. Résultats La microchirurgie cordale des lésions bénignes savère être une chirurgie fonctionnelle efficace : elle améliore rapidement, dès le premier examen post-opératoire, la qualité vocale et le rendement phonatoire des patients opérés, et ce dans les deux groupes. Nos observations vidéo-stroboscopiques postopératoires précoces plaident en faveur de caractéristiques visco-élastiques favorables de limplant dacide hyaluronique estérifié. Si ce dernier sétait avéré trop visqueux ou trop rigide, nous aurions observé une absence dondulation muqueuse ou une détérioration de celle-ci lors du premier contrôle postopératoire. Mais une des originalités de notre travail est de réaliser un suivi clinique à long terme de lévolution vocale et laryngée de nos patients. Celle-ci est analysée par une étude statistique corrélationnelle non paramétrique. Un comportement très différent est observé: le groupe de patients implantés continue daméliorer 10 variables sur les 20 variables évaluées et quantifiées, alors que le groupe non-implanté naméliore significativement quune seule variable. Autrement dit, le groupe implanté manifeste une évolution significative et favorable au fil du temps, bien au-delà de la période post-opératoire immédiate. Le groupe contrôle, quant à lui, ne témoigne daucune évolution des paramètres vocaux et laryngés quantifiés lors de ce suivi à long terme. Lexplication de cette évolution différente pourrait être une atteinte plus sévère du groupe implanté, et donc une amélioration plus lente des paramètres vocaux et laryngés. Cela pourrait expliquer partiellement lévolution de G, R, S, I et des caractéristiques stroboscopiques droites qui étaient moins bonnes au sein du groupe implanté lors de lexamen pré-opératoire. Mais cette vision nous paraît insuffisante et réductrice : certaines variables étaient altérées de manière équivalente dans les deux groupes lors de lexamen préopératoire et névoluent favorablement quau sein du groupe implanté. Mais surtout, les deux groupes évoluent de la même manière lors du premier examen post-opératoire (analyse de variance des résultats post-opératoires immédiats, cf plus haut). Le groupe contrôle nest certes pas « normalisé » après la microchirurgie et sil ne sagissait que dune évolution retardée, elle devrait également sobserver dans le groupe contrôle. On peut donc raisonnablement envisager une action favorable de lacide hyaluronique estérifié sur le processus de cicatrisation intratissulaire : une lente amélioration de la souplesse de la couverture cordale se fait jour, grâce à une reconstitution au moins partielle dune matrice extracellulaire par des fibroblastes dont le phénotype a été modifié par la présence dun taux élevé dacide hyaluronique au sein de la plaie microchirurgicale. Nous pourrions donc expliquer lévolution particulière de notre groupe implanté par un véritable processus régénératif au sein de lespace de Reinke. Ce processus ne peut être que lent, connaissant le caractère pauci-cellulaire de cette couche tissulaire, et donc nest pas perceptible lors du premier contrôle post-opératoire : à ce moment, les deux groupes évoluent de manière identique. Conclusions Loriginalité de notre travail réside dans lutilisation dun dérivé dacide hyaluronique afin de moduler le processus de cicatrisation post-opératoire : cest la première fois que ce type de technique est mis en oeuvre, les travaux précédemment publiés par dautres auteurs ne portant que sur des études in vitro ou sur modèles animaux. Notre travail constitue dès lors un premier pas vers une microchirurgie cordale non pas seulement fonctionnelle, mais aussi régénérative. En effet, nous nous sommes appuyés sur linfluence bénéfique que peut exercer la composition de la matrice extracellulaire sur le fonctionnement cellulaire cordal. Les résultats obtenus sont très intéressants puisquils montrent une amélioration post-opératoire, non seulement précoce mais aussi retardée, chez des patients implantés dont la souplesse cordale était, en phase pré-opératoire, sévèrement altérée. Lamélioration continue observée, au fil dune longue période de temps, chez les seuls patients implantés, est à nos yeux le résultat le plus surprenant et le plus enthousiasmant. Cette observation constitue un argument important en faveur dun processus de cicatrisation régénératif dans lespace de Reinke traité par notre technique originale dimplantation dacide hyaluronique estérifié. Notre travail nous a permis dappréhender la complexité de la structure et de la physiologie tissulaire cordale. Il soulève aussi de nombreuses questions qui dans lavenir, doivent faire lobjet de projets de recherches fondamentales : quels sont les mécanismes de lhoméostasie de la composition de la matrice extracellulaire du tissu cordal sain ? quelles sont les dérégulations à lorigine du développement des pathologies cordales bénignes ? quelle est linfluence des contraintes mécaniques sur la composition matricielle cordale ? quelle est linfluence du bagage génétique sur le développement des lésions bénignes ? quels sont les processus de cicatrisation du tissu cordal humain ? De la même manière que par le passé, ce sont les connaissances approfondies de la structure laminaire cordale qui ont modifié le geste microchirurgical, ce sont les réponses à ces questions qui permetteront certainement à la microchirurgie cordale dévoluer vers une chirurgie de plus en plus régénérative.

Η νεοπλασία των όρχεων, αν και σχετικά αποτελεί μια σπάνια μορφή νεοπλασίας (1- 2% όλων των νεοπλασμάτων του άνδρα), είναι ο πιο συχνός όγκος στις ηλικίες 20-40 ετών, αποτελώντας την τρίτη κατά σειρά αιτία θανάτου στις ηλικίες αυτές. Περίπου το 95% των όγκων όρχεων προέρχεται από τα βλαστικά κύτταρα. Η αλληλεπίδραση των κυττάρων με άλλα κύτταρα ή με συστατικά του εξωκυττάριου χώρου, καθώς και η μετακίνηση στο ενδοθήλιο των αρτηριών και στο εξωφλεβικό ιστό, είναι εξαρτημένη από την ενεργότητα των μορίων προσκόλλησης όπως οι ιντεγκρίνες, οι σελεκτίνες και μέλη της υπεροικογένειας των ανοσοσφαιρινών, καντχερίνες και ο CD44. Ο CD44 είναι μια γλυκοπρωτεΐνη και αποτελεί τον κύριο υποδοχέα του ΗA. Η ισομορφή που δεν περιέχει ενδιάμεσα εξώνια ονομάζεται CD44s, ενώ όλες οι υπόλοιπες ισομορφές προκύπτουν με εναλλακτικό μάτισμα δέκα διαφορετικών εξωνίων, παράγοντας πληθώρα διαφορετικών μορίων του CD44. Πληθώρα μελετών υποστηρίζει ότι ο μεμβρανικός υποδοχέας CD44 και το ΗΑ υπερεκφράζονται σε πολλές κακοήθειες και η αλληλεπίδρασή τους διεγείρει σειρά λειτουργιών στα κύτταρα του όγκου που συντελούν στην πρόοδο της νόσου. Η κύρια ισομορφή CD44s εκφράζεται ευρέως στους ιστούς και υπερεκφράζεται σε διάφορους τύπους καρκίνου όπου και συνυπάρχει με το ΗΑ, ενώ κάποιες ισομορφές όπως η CD44v5, CD44v6, παίζουν σημαντικό ρόλο στην επιθετικότητα μερικών τύπων καρκίνου. Η έκφραση του CD44 έχει μελετηθεί μερικώς στους όγκους όρχεων και έχουν δημοσιευθεί αντικρουόμενα ευρήματα, ενώ δεν υπάρχουν διαθέσιμα στοιχεία για την έκφραση των ενζύμων που συνθέτουν το ΗΑ. Στόχος της μεταπτυχιακής εργασίας ήταν να διερευνηθεί η έκφραση των ισομορφών του CD44 και των συνθασών του ΗΑ σε τρεις κυτταρικές σειρές όγκων όρχεων (Σεμίνωμα, Εμβρυϊκό καρκίνωμα, Τερατοκαρκίνωμα). Η μελέτη του υποδοχέα CD44 πραγματοποιήθηκε με RT-PCR και ανοσοαποτύπωση. Σε επίπεδο mRNA βρέθηκε πως η κύρια ισομορφή του CD44 που εκφράζεται στο σεμίνωμα καθώς και σε μη- σεμινωματώδεις όγκους είναι η ισομορφή CD44s. Ακόμη στην κυτταρική σειρά σεμινώματος όρχεων εκφράζονται και άλλες ισομορφές, κυρίως όμως εκφράζονται οι ισομορφές CD44v7-v10, CD44v8-v10, CD44v9-v10 και CD44v10. Στις κυτταρικές σειρές μη σεμινωματωδών όγκων (εμβρυϊκό καρκίνωμα και τερατοκαρκίνωμα) εκτός της CD44s ισομορφής που είναι η κυρίαρχη ισομορφή εκφράζονται και κάποιες άλλες ισομορφές του CD44. Στο εμβρυϊκό καρκίνωμα εκφράζονται οι ισομορφές CD44v5,v8, CD44v9-v10 και CD44v10, ενώ στο τερατοκαρκίνωμα παρατηρείται η έκφραση κυρίως της CD44v5,v8, ενώ εκφράζονται και οι CD44v5,v9, CD44v5, CD44v8-v10, CD44v9-v10 και η CD44v10. Η μελέτη του CD44 σε επίπεδο πρωτεΐνης με το αντίσωμα Hermes-3 κατέδειξε πως η κύρια ισομορφή που εκφράζεται στην κυτταρική σειρά σεμινώματος είναι η CD44s με μοριακό βάρος~90kDa. Ακόμα φάνηκε πως υπάρχει έκφραση και κάποιων ισομορφών και θραυσμάτων του CD44 με μικρότερο μοριακό μέγεθος. Αντίθετα στις κυτταρικές σειρές εμβρυϊκού καρκίνωματος και τερατοκαρκινώματος παρατηρήθηκε η έκφραση μόνο της CD44s ισομορφής. Αντίθετα με την υψηλή έκφραση του CD44s στην κυτταρική σειρά σεμινώματος, παρατηρήθηκε μικρή έκφραση του CD44s στην κυτταρική σειρά εμβρυϊκού καρκινώματος και μια ελάχιστη έκφραση στην κυτταρική σειρά του τερατοκαρκινώματος. Η μελέτη του υποδοχέα CD44 σε επίπεδο ιστού έδειξε ότι η πρωτεΐνη του CD44 εκφράζεται στα κύτταρα του όγκου. Η σηματοδοτική δράση του ΗΑ στα καρκινικά κύτταρα μέσω του υποδοχέα CD44 έχει προταθεί ως βασικό βήμα για την ανάπτυξη και πρόοδο της νόσου. Οι συνθάσες του HA είναι τα ένζυμα που βιοσυνθέτουν το ΗΑ και διακρίνονται σε τρεις ισομορφές τις HAS- 1, HAS-2, HAS-3α, και HAS-3β. Στα πλαίσια της μεταπτυχιακής διατριβής βρέθηκε πως η κυτταρική σειρά σεμινώματος εκφράζει μόνο την ισομορφή HAS-3α, ενώ οι κυτταρικές σειρές εμβρυϊκού καρκινώματος και τερατοκαρκινώματος εμφανίζουν ισχυρή έκφραση της ισομορφής HAS-3α και μικρή έκφραση της HAS-2. / Testicular tumors are present in men aged 15-35 years with increasing incidence in the last 40 years. Approximately 95% of these tumors arise from germ cells. The interaction of cells with other cells or with components of the extracellular matrix (ECM), as well as their locomotion on blood vessel endothelium and extravascular tissue, are substantially dependent on the activity of adhesion molecules such as integrins, selectins, members of the immunoglobulin superfamily, addressins, cadherins, and CD44. CD44 is a glycoprotein and represents the major receptor for HA. The isoform with no variant exons is named CD44s, whereas the other isoforms arise from alternative splicing of the 10 variant exons of the CD44 mRNA, producing a huge variety of diverse CD44 molecules. A lot of studies supports that the membrane receptor CD44 and HA are overexpressed in several malignancies and their interaction trigger fuctions in tumour cells, which conduce to the disease progression. The major isoform is the CD44s which is expressed widely in tissues, whereas is overexpressed in several types of tumours ,coexisting with HA. The expression of CD44 has been partly studied in testicular tumours but controversial findings have been published, whereas no data about the enzymes which synthesize HA are available. The aim of this thesis was to examine the expression of CD44 isoforms and HA synthases in three cell lines (seminoma, embryonic carcinoma, teratocarcinoma). The study of CD44 was conducted by RT-PCR analysis and western blotting. It was found that in mRNA level, the major isoform that is expressed in seminoma and nonseminomas is the CD44s isoform. Moreover, in seminoma cell line, other isoforms are also expressed, namely CD44v7-v10, CD44v8-v10, CD44v9-v10 and CD44v10 isoforms. In nonseminomas cell lines CD44s is expressed as the major isoform , but also other isoforms are expressed. CD44v5,v8, CD44v9-v10 and CD44v10 isoforms are expressed in embryonic carcinoma , whereas in teratocarcinoma the expression mainly of the CD44v5,v8 isoform is observed, together with CD44v5,v9, CD44v5, CD44v8-v10, CD44v9-v10 and CD44v10 isoforms. The study of CD44 in protein level conducted by western blotting using the monoclonal antibody Hermes-3. It was shown that the major isoform expressed in seminoma cell line is CD44s with a molecular mass approximately 90kDa. Moreover it was shown that other CD44 isoforms and CD44 fragments with smaller molecular mass are expressed. On the other hand, in embryonic carcinoma and teratocarcinoma cell lines, the expression only of CD44s isoform was observed. The study of CD44 in tissue level revealed that CD44protein is expressed in tumour cells. The signaling effect of HA in tumor cells through CD44 has been stated to be a crucial step in the development and progression of the disease. The synthases of HA are the enzymes that produce HA and represent three distinct isoforms HAS-1, HAS-2, HAS-3a, and HAS-3b. The findings of this study revealed that seminoma cell line express only HAS-3a isoform, whereas embryonic carcinoma and teratocarcinoma cell lines showed high expression of HAS-3a isoform and low expression of HAS-2 isoform.

During production of different Hyaluronic acid (HA) products Galderma use a high concentration of NaOH in the crosslinking process of HA. HA’s degradation kinetics are widely unknown at higher pH’s and is interesting for the future of product development of HA. Static Light Scattering (SLS) was used to determine the weight average molecular weight (MW ) of samples with four different NaOH concentrations, four temperatures, three reaction times and one t0  sample. The results were evaluated in forms of Arrhenius-graphs for different NaOH concentrations, the activation energy (EA ) with respect to pH and the reaction rate for each temperature with respect to NaOH concentration. It was found that the degradation of HA was more strongly affected by temperature than by NaOH concentration and that the EA  did not show any significant signs of change between higher concentrations of NaOH.

This thesis presents deeper insights into bone applicable biomaterials’ design. Poor affinity of BMP-2 towards scaffolds required supra-physiological dose administration. Though molecules containing sulfate could sustain BMP-2 release, side effects occurred due to BMP-2 supra-dose, or these sulfate-containing biomolecules. Improved affinity between BMP-2 and scaffolds was first witnessed by using an acidic carrier (paper I). Hyaluronic acid (HA) hydrazone derived hydrogels having a pH of 4.5-loaded BMP-2 showed sustained release of bioactive BMP-2 in vitro and enhanced bone formation in vivo, while pH 7 HA hydrogels showed Fickian behavior and less bone formation in vivo. Computational evaluation revealed stronger electrostatic interactions between BMP-2, and HA were predominant at pH 4.5, whereas, weaker Van der Waals interactions played a key role at pH 7. During the pre-bone formation phase, endogenous cell responses to pH 4.5 and 7 with or without BMP-2 were investigated. HA hydrogels exhibited extraordinary biocompatibility and recruitment of neutrophils, monocytes, macrophages and stromal cells regardless of hydrogels’ pH and BMP-2 presence.  The different inflammatory responses to HA hydrogels were observed (Appendix). Thiol derivatives can cleave the disulfide bond of BMP-2 to generate inactive monomeric BMP-2. In paper II, thiol-acrylate chemistry-based HA hydrogels (HA-SH) were compared to hydrazone-based HA hydrogels as BMP-2 carriers. Thiol modified HA disrupted BMP-2 integrity and bioactivity. HA-SH hydrogels with BMP-2 exhibited less bioactive BMP-2 release in vitro and induced less bone formation in vivo. Accumulated evidence has shown great osteogenic potential of lithium ions (Li). In paper III, we coordinated Li onto HA-PVA hydrazone hydrogels (Li-gel); Li-gel enhanced 3D cultured hMSCs osteogenic differentiation and induced higher bone formation in CAM defect model. Instead of BMP-2 protein, delivery of BMP-2-coding-plasmid can produce BMP-2 over a long term at a closer physiological level. Yet, efficient gene delivery reagents are needed. In paper IV, two novel gene delivery nanoplexes were developed by post coating DNA-nanoplexes with chondroitin sulfate (CS). To ensure the stability, aldehyde-modified CS (CS-CHO) reacted with free amines of pDNA/PEI complexes. We provided first evidence that CS-CHO coated nanoplexes controlled the release from endosomes, which is essential for higher transfection efficiency.

Des progrès récents dans l’utilisation préclinique et clinique des petits ARN interférents (siRNA) ont montré leur potentiel en tant qu’inhibiteur de la synthèse protéique dans de nombreuses pathologies comme le cancer. L’administration des siRNA rencontre un certain nombre de problèmes liés à leur dégradation rapide dans les milieux biologiques, ainsi qu’à leur difficulté à pénétrer au sein des cellules cibles en raison de leur hydrophilie et de leur charge négative. Une des clés de l’amélioration de l’efficacité thérapeutique de ces molécules repose sur l’emploi de vecteurs. Au cours de cette thèse, des lipoplexes capables de protéger les siRNA contre la dégradation et de favoriser leur transport jusqu’aux cellules cibles ont été développés et optimisés. Pour ce faire, des lipoplexes recouverts d’HA ont été formulés pour la vectorisation active de siRNA vers des cellules tumorales surexprimant le récepteur CD44. Dans la première partie de cette thèse, la formation des lipoplexes a été étudiée, ainsi que les paramètres influençant leur organisation supramoléculaire. L'insertion de l'HA dans la structure du liposome au moment de la formation des vésicules a entraîné une augmentation de la taille des liposomes en fonction de la concentration d’HA. Leur complexation avec les siRNA a encore augmenté la taille des particules obtenues. L’ajout des acides nucléiques lors de la formation des lipoplexes a provoqué un déplacement d'une partie du conjugué HA-DOPE de la structure des lipoplexes, comme montré par électrophorèse capillaire. La titration calorimétrique isotherme et les études de diffraction des rayons X ont démontré que, sous l’effet des interactions électrostatiques avec les siRNA, un réarrangement des bicouches lipidiques a lieu, conduisant à la formation de vésicules oligolamellaires, confirmé visuellement par cryo-microscopie. Enfin, le positionnement convenable de l’HA sur la surface des lipoplexes et sa capacité de se lier spécifiquement aux récepteurs de CD44 ont été démontrés par la technique de résonance plasmonique de surface. Dans la deuxième partie de cette thèse, la capture cellulaire et localisation intracellulaire des lipoplexes-HA ont été évalués par cytométrie en flux et microscopie de fluorescence, et ont montré que les lipoplexes modifies par l’HA sont internalisés plus rapidement que les lipoplexes non modifiés, et une fois dans des cellules, ils sont localisés principalement à l’intérieur des endosomes. La capacité des lipoplexes à transporter des molécules de siRNA intactes au cytoplasme a été confirmée par 81 % d'inhibition d'expression de luciferase in vitro sur la lignée cellulaire de cancer du poumon A549-luc. In vivo, le traitement avec les lipoplexes-HA transportant un siRNA anti-luciferase a mené à une diminution statistiquement significative de l’expression de luciferase, ce qui a été confirmé par la réduction de l'expression d’ARNm de la luciferase dans le poumon des animaux traités avec les lipoplexes-HA. L'analyse de la distribution des lipoplexes dans les poumons a montré que les lipoplexes modifiés par l’HA sont distribués de façon plus importante et plus homogène dans le tissu pulmonaire que les lipoplexes non modifiés. Dans la troisième partie de cette thèse, la diffusion des lipoplexes-HA de siRNA dans le mucus a été étudié, afin d’évaluer la faisabilité de l’administration pulmonaire de ces particules. Les études utilisant la technique de « multiple particle tracking (MPT) » ont montré que la présence d’HA combinée à l'ajout de siRNA ont permis l’obtention de deux formulations de lipoplexes présentant une pénétration efficace dans le mucus, les lipoplexes-HA and les lipoplexes-PEG/HA. En conclusion, un système efficace de lipoplexes utilisant siRNA pour l'inhibition de l'expression génique ciblant les récepteurs CD44 a été développé. Les résultats obtenus confirment que les HA-lipoplexes sont capables de libérer efficacement le siRNA dans le cytoplasme des cellules in vitro et in vivo. / Recent progresses in the preclinical and clinical use of small interfering RNA (siRNA) have shown their potential as an inhibitor of protein synthesis in many diseases such as cancer. The administration of siRNA encounters a number of problems related to their rapid degradation in biological media, and their difficulty in penetrating targeted cells due to their hydrophilicity and negative charge. A key to improving the therapeutic efficacy of these molecules is based on the use of vectors. In this thesis, lipoplexes that can protect siRNA against degradation and facilitate their transport into target cells were developed and optimized. To do this, lipoplexes covered with HA were formulated for active vectorization of siRNA to tumor cells overexpressing the receptor CD44.In the first part of this thesis, the formation of lipoplexes was studied, and the parameters influencing their supramolecular organization. Insertion of HA within the liposome structure during vesicle formation resulted in the increase in liposome size as a function of HA concentration. Their complexation with siRNA has further increased the size of the particles obtained. The addition of siRNAs when forming lipoplexes caused a displacement of a portion of the HA-DOPE conjugate from the lipoplexes structure, as shown by capillary electrophoresis. The isothermal titration calorimetry and X-ray diffraction studies showed that a rearrangement of the lipid bilayers occur under the effect of electrostatic interactions with siRNAs, leading to the formation of oligolamellar vesicles, which was visually confirmed by cryo-microscopy. Finally, the proper positioning of the HA on the surface of the lipoplexes and its ability to specifically bind to the CD44 receptors has been demonstrated by the surface plasmon resonance technique.In the second part of this thesis, cellular uptake and intracellular localization of HA-lipoplexes were assessed by flow cytometry and fluorescence microscopy, and showed that lipoplexes modified by HA are internalized more rapidly than unmodified lipoplexes, and once in the cells, they are mainly localized within the endosomes. The ability of lipoplexes to transport intact siRNA molecules to the cytoplasm was confirmed by 81% of luciferase in vitro expression inhibition on the lung cancer cell line A549-luc. In vivo, treatment with HA-lipoplexes carrying anti-luciferase siRNA led to a statistically significant decrease in expression of luciferase, which was confirmed by reducing the mRNA expression of luciferase in lungs of animals treated with HA-lipoplexes. The analysis of the distribution of lipoplexes in the lungs showed that lipoplexes modified with HA are distributed more evenly in the lung tissue than unmodified lipoplexes.In the third part of this thesis, the movement of siRNA HA-lipoplexes in the mucus was studied to assess the feasibility of administering these particles directly to the lungs. Studies using the technique of "multiple particle tracking (MPT)" showed that the presence of HA combined with the addition of siRNA allowed the preparation of two lipoplexes formulations with efficient mucus-penetration, HA-lipoplexes and PEG/HA-lipoplexes.In conclusion, an efficient siRNA lipoplex system for inhibiting gene expression targeted TO the CD44 receptorS has been developed. The results confirm that the HA-lipoplexes are able to effectively release in vitro and in vivo the siRNA molecules in the cytoplasm of cells.

A osteocondrite dissecante (OCD) é uma doença que surge nos equinos durante a fase de desenvolvimento sendo caracterizada pela presença de fragmento osteocondral intra-articular. Pouco se sabe sobre a condição da articulação doente em animais mais velhos, principalmente nos casos assintomáticos, que são operados muitas vezes com a finalidade de comercialização posterior ou para impedir a progressão da doença. A finalidade deste estudo, portanto, foi analisar as articulações tíbio-társicas de equinos com idade superior a um ano apresentando OCD na crista intermédia da tíbia, e comparar animais saudáveis (grupo controle) com animais acometidos de OCD nas formas sintomática e assintomática, empregando análise física; contagem de células totais, dosagem de proteína total, análise de glicosaminoglicanos (GAGs) e da proteína oligomérica da matriz cartilagínea (COMP) no líquido sinovial; análise dos GAGs urinários e análise histológica da membrana sinovial e fragmento osteocondral. Os eqüinos utilizados foram divididos em três grupos. No Grupo I foram utilizados eqüinos clinicamente sadios, livres de doença na articulação tíbiotársica. Os Grupos II e III foram constituídos por animais portadores de OCD nas formas sintomática e assintomática respectivamente, atendidos e operados no Serviço de Cirurgia de Grandes Animais do Hospital Veterinário FMVZ-USP. A presença de sinais clínicos esteve mais relacionada com a presença de múltiplos fragmentos do que com a de fragmento osteocondral único, independente de seu tamanho. O sinal clínico mais observado nos animais do Grupo III foi a efusão articular. As principais alterações encontradas no líquido sinovial foram: o aumento na concentração de condroitim sulfato (CS) no Grupo II (P<0,01) e no Grupo III (P<0,001) em relação ao Grupo I; o aumento na concentração de ácido hialurônico associado à diminuição da viscosidade nos animais do Grupo III; e a redução na presença de fragmentos de alto peso molecular associado ao aumento de fragmentos de baixo peso molecular de COMP nos animais dos Grupos II e III. A análise dos GAGs urinários evidenciou aumento na proporção de CS nos animais dos Grupos II e III em relação ao Grupo I. Na análise histológica dos fragmentos osteocondrais foram observadas alterações na integridade da cartilagem articular, associada a proliferação de condrócitos e a redução na presença de proteoglicanos tanto no Grupo II como no Grupo III. As amostras de membrana sinovial do Grupo I apresentaram presença discreta de vilos e sinoviócitos. No Grupo II houve aumento moderado nas vilosidades sinoviais, e na maior parte das amostras avaliadas no Grupo III, além da presença moderada a severa de vilosidades sinoviais, foi observada proliferação intensa de sinoviócitos. Os resultados obtidos no presente estudo demonstram que a OCD na articulação tíbio-társica de equinos com idade superior a um ano representa processo ativo, com degradação da MEC da cartilagem articular, independente da presença de sinais clínicos, e que o tratamento cirúrgico é indicado, mesmo em animais assintomáticos, buscando interromper o processo de degradação cartilagínea e prevenir o desenvolvimento de doença articular degenerativa, particularmente em equinos que irão iniciar treinamento atlético esportivo. / Osteochondritis dissecans (OCD) is an orthopedic disease that appears in foals during growth phase and is characterized by the presence (occurrence???) of an osteochondral fragment in the articular space. There are few studies in the literature concerning the follow up of the disease in adult horses, mainly those without clinical signs, which are submitted to surgical treatment to commercial proposes or to prevent the progression of the disease. The objective of the present study was to analyze tibiotarsal joints of horses older than one year with OCD in the intermediate ridge of distal tibia and compare healthy animals (control group) with OCD horses, either with or without clinical signs. Synovial fluid was analyzed to total cell count, total protein concentration, and cartilage oligomeric matrix protein (COMP) fragmentation. The synovial fluid and urine glycosaminoglycans (GAGs) were evaluated. The synovial membrane and osteochondral fragment were analyzed by istological assessment. Horses were divided in three groups: healthy horses without joint disease (Group I), horses with OCD without clinical sings (Group II) and horses with OCD and clinical signs (Group III). Horses of Groups II and III were admitted to the Large Animal Surgery Session of the Veterinary Hospital FMVZ USP. The presence of clinical signs was more related with multiple articular fragments than with one fragment, irrespective of the size. The most common clinical sign observed in Group III was joint effusion. The main changes in synovial fluid were: increase in chondroitin sulfate (CS) in Groups II (P<0,01) and III (P<0,001) when compared with Group I; increase in hyaluronic acid (HA) concentration associated with decrease in the viscosity in Group III; and the decrease of COMP fragments of higher molecular weight associated with increase of fragments of low molecular weight in Group II and III. The proportion of urinary CS was increased in Group II and III when compared with Group I. Alterations in the articular cartilage integrity associated with chondrocytes proliferation and loss of proteoglycan were observed in the histological analysis of the osteochondral fragments. In Group I the presence of synovial vilos and synoviocytes in the synovial membrane samples was discreet. In Group II samples there were a moderate increase in the presence of synovial vilos and synoviocytes. In almost samples analyzed in Group III the presence of synovial vilos was moderate to severe and synoviocytes proliferation was intense. Our results indicate that OCD in tibiotarsal joint of horses older than one year represents an active process, with degradation of the extra cellular matrix of the articular cartilage, regardless the presence of clinical signs, indicating surgical treatment, even in assymptomatic horses, avoiding the progression of cartilage degradation process and preventing the development of degenerative joint disease, mainly in horses that are going to begin athletic training.

Lorsque le cartilage est altéré, la réponse des chondrocytes est insuffisante pour stopper ce processus et réparer le tissu. Les thérapies non chirurgicales actuelles sont basées sur les anti-inflammatoires pour soulager la douleur. Cependant, certaines molécules thérapeutiques ne sont pas utilisées en raison d'une faible biodisponibilité ou d'effets secondaires importants. Le but est de préparer des particules polymère pour améliorer la biodisponibilité dans l'articulation de principes actifs (PA). Ceci est obtenu par le recouvrement des particules par des dérivés de l'acide hyaluronique (HA), naturellement présent dans le cartilage et qui possède une affinité pour un récepteur (CD44) à la surface des chondrocytes. Ce ciblage actif permet de concentrer les PA à proximité ou dans (internalisation) ces cellules et donc, d'obtenir un effet à des concentrations plus faibles en PA. Le HA est estérifié par des groupements hydrophobes pour obtenir des propriétés tensio-actives. Puis ces dérivés servent de stabilisant pour la formulation d'émulsions conduisant à l'obtention de particules polymère. Elles sont alors caractérisées: taille, distribution et quantité de HA modifié en surface. L'encapsulation de traceurs fluorescents démontre une internalisation in vitro et l'administration par injection intra-articulaire (ia) chez le rat n'engendre pas d'inflammation. L'encapsulation de PA (HA, chondroïtine sulfate) est possible, avec des tailles de particules plus importantes. Ceci ouvre de nouvelles approches dans le traitement des atteintes articulaires: l'injection ia de particules polymère recouvertes de HA permet un adressage des molécules qu'elles contiennent dans les cellules / A defect in articular cartilage yield to a biological response of the chondrocytes but it is not sufficient to stop the damage or heal the tissue. The non-chirurgical therapies available are based on anti-inflammatory, to relieve the pain. But, many molecules which might have therapeutic effects are not used because of poor bioavailability or severe side effects. Here, we described the elaboration of polymeric nanoparticles that can enhance articular bioavailability of entrapped drugs. One can reach this goal by using HA derivatives at the surface of such particles. HA is a polysaccharide naturally present in the joint, with a strong affinity for one receptor expressed by the chondrocytes: CD44. Such an active targeting will allow the accumulation of drugs near or in the cells (internalization) and therefore, lead to biological effects with lower concentration. We chemically modified the HA by esterification with hydrophobic chains to confer tensio-actives properties. Then, those derivatives were used to stabilize the formulation of polymeric particles and the characterization (size, distribution and amount of HA derivatives present) was determined. The encapsulation of fluorescent probes proved in vitro an internalization by the chondrocytes. Moreover, intra-articular (ia) injection of particles in healthy rats did not generate any inflammation. Entrapment of molecules (HA or Chondroitin Sulfate) was possible but the size was higher and the encapsulated amount could not be precisely measured. This work is promising for new therapies in articular diseases, the ia injection of polymeric particles covered by HA derivatives allow an active targeting of the entrapped drugs

Un des écueils du traitement des pathologies ostéoarticulaires est l’adressage de molécules aux cellules et tissus qui constituent l’articulation. L’administration de principes actifs par voie sanguine ou orale nécessite l’apport de quantités importantes et peut causer des effets indésirables. Dans ces travaux, nous avons évalué un système d’adressage de molécules hydrophiles. Des particules de polymère d’acide lactique et glycolique, marquées par un traceur fluorescent ont été évaluées in vitro puis in vivo. Ces particules possèdent un recouvrement en acide hyaluronique pour améliorer les interactions avec les cellules. Les études réalisées ont permis de mettre en évidence l’internalisation des particules dans les synoviocytes, chondrocytes, et cellules souches mésenchymateuses après 8 heures d’exposition. Parallèlement, l’évaluation in vitro de différents paramètres de cytotoxicité et d’inflammation a permis de souligner la compatibilité de ces vecteurs avec les cellules articulaires. Enfin, les effets de l’injection intra-articulaire de particules ont été évalués chez le rat sain et différents modèles pathologiques. L’analyse histologique des articulations a démontré l’absence de dégradation de la matrice cartilagineuse et de réaction inflammatoire suite à l’injection de particules. Il a été également constaté un ciblage majoritaire des particules vers la membrane synoviale. Ces travaux permettent de valider l’utilisation de ce type de vecteur pour le ciblage de l’articulation et l’apport de principes actifs. L’association de ces particules à des molécules hydrophiles (acides nucléiques, médicaments,…), pourra permettre leur apport direct dans l’articulation et ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques. / One of the major issues with treatment of osteoarticular diseases is reaching cells or tissue inside the joint. Administration of an active compound by intravenous or per os requires elevated amount to be effective, and can initiate systemic and negative side effects. In this work we have evaluated a drug delivery system for hydrophilic molecule, which can be used for articular tissues. Polymeric nanoparticles of poly lactic-co-glycolic acid, labelled with a fluorescent dye were evaluated both in vitro and in vivo. These nanoparticles are covered with hyaluronic acid to favor particles-cells interaction. We demonstrated here that such particles are internalized after 8 hours of exposure in synoviocytes, chondrocytes and mesenchymal stem cells. Evaluation of cytotoxicity and inflammation revealed the neutrality of these particles for articular cell types. Finally, intraarticular injections of particles were performed in healthy rat joint and in pathological models. Histological analyses of extracellular matrix integrity and inflammatory status do not demonstrate any side-effect following particles injections. These healthy nano-device target primarily synovial cells, and their degradation inside cells does not provoke deleterious effects. This PLGA based drug delivery system would be used to safely deliver active molecules to the joint. The combination of these particles with various hydrophilic molecules (as nucleic acid, drugs,…) may allow their direct distribution in the joint, and lead to new therapeutics perspectives.

INTRODUÇÃO: A matriz extracelular no endométrio fornece vasta gama de sinais envolvidos em diferentes processos celulares, tais como morte celular e proliferação. Neste sentido, os glicosaminoglicanos e os proteoglicanos, juntamente com os fatores de crescimento, modulam várias etapas da angiogênese, proliferação celular e remodelação do estroma, o que pode ser importante para o fluxo menstrual regular e a redução dos processos proliferativos. Além disso, são importantes para a adequada interação maternofetal. OBJETIVO: Avaliar a concentração de ácido hialurônico, das enzimas de biossíntese do ácido hialurônico - hialurônico sintases (HAS1, HAS2 e HAS3) e dos pequenos proteoglicanos ricos em leucina (decorim, biglicam, lumicam e fibromodulina) no endométrio de pacientes com síndrome dos ovários policísticos (SOP) e de mulheres eumenorreicas. MÉTODOS: Foram analisadas 20 amostras de endométrio, 10 provenientes de pacientes com SOP e 10 de mulheres com ciclos menstruais regulares na fase proliferativa do ciclo, com idade variando entre 20 e 35 anos, atendidas na Divisão de Clínica Ginecológica do Hospital das Clínicas da FMUSP (HC-FMUSP). A determinação do perfil e da concentração do ácido hialurônico foi efetuada por método bioquímico de ensaio fluorimétrico (ELISA-like). A sua localização no tecido endometrial, assim como as dosagens das enzimas sintases (HAS1, HAS2 e HAS3) e dos pequenos proteoglicanos ricos em leucina (decorim, biglicam, lumicam e fibromodulina e), foi feita por imunoistoquímica e \"western blotting\". Para a análise dos resultados foi utilizado o teste t de student (p<=0,05). Os cálculos foram realizados com auxílio do programa SPSS versão13 (SPSS, Chicago, IL). RESUTADOS: Houve maior concentração de ácido hialurônico no endométrio de mulheres eumenorreicas na fase proliferativa do ciclo menstrual do que no das com síndrome dos ovários policísticos. Com relação às sintases do ácido hialurônico, observou-se maior reatividade de HAS1 e HAS2 e menor reatividade de HAS3 no endométrio de mulheres com SOP em relação às mulheres com ciclos menstruais regulares na fase proliferativa. Quanto aos pequenos proteoglicanos ricos em leucina notou-se maior imunorreatividade de decorim e lumicam no endométrio de pacientes com SOP. CONCLUSÕES: As pacientes com SOP apresentam menor concentração de ácido hialurônico e maior reatividade ao decorim e lumicam em relação às mulheres com ciclos regulares na fase proliferativa. Esses dados sugerem que nas pacientes com SOP, o endométrio seria menos receptivo e teria mecanismos para evitar a proliferação excessiva / INTRODUCTION: Endometrium extracellular matrix provides wide range of signals at different cellular levels like cell death and proliferation. In this regard, glycosaminoglycans and proteoglycans, along with growth factors, modulate various stages of angiogenesis, cell proliferation and remodeling of the stroma, which can be important for regulating menses and reducing the proliferative processes. Additionally, it is important for proper fetal-maternal interactions. OBJECTIVE: Evaluate hyaluronic acid concentration, the enzymes of hyaluronic acid synthases (HAS1, HAS2 and HAS3) and small leucine-rich proteoglycans (decorin, lumican, fibromodulim and biglycan) in the endometrium of patients with polycystic ovary syndrome (PCOS) and eumenorrheic women. METHODS: A total of 20 endometrial samples from 10 patients with PCOS and 10 women with regular menstrual cycles in the proliferative phase, with ages ranging between 20 and 35 years, attended at Gynecology Division of Clinical Hospital of the FMUSP (HC-USP). Profile determination and the concentration of hyaluronic acid were performed by biochemical method of fluorimetric assay (ELISA-like). Its location in the endometrial tissue as well as the dosage of enzymes synthases (HAS1, HAS2 and HAS3) and small leucine-rich proteoglycans (decorin, lumican, fibromodulim and biglycan) was done by immunohistochemistry and western blotting. To analyze the results Student t test was used (p < 0.05). The calculations were performed with software SPSS version 13. RESULTS: A higher concentration of hyaluronic acid in eumenorrheic women endometrium in proliferative phase when compared with polycystic ovary syndrome. Regarding hyaluronic acid synthases, there was a higher HAS1 and HAS2 reactivity and lower HAS3 reactivity in the PCOS endometrium compared to women with regular menstrual cycles in the proliferative phase. Decorin and lumican showed higher immunoreactivity in PCOS endometrium. CONCLUSIONS: PCOS patients have a lower concentration of hyaluronic acid and greater reactivity to decorin and lumican than eumenorrheic women in proliferative phase. These data suggest that in patients with PCOS, the endometrium would be less receptive and have mechanisms to prevent excessive proliferation