Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 2000. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 198-219).

Thesis (Ph. D.), Memorial University of Newfoundland, 1999. / Restricted until June 2000. Bibliography: p. 262-295.

Orientador: Rosiane Lopes da Cunha / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-21T04:58:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moraes_MarisaCorreade_M.pdf: 1452448 bytes, checksum: cbfd0da3e6558c06281ba86e39f14050 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: O colágeno é um subproduto de matadouro sendo amplamente utilizado como ingrediente na indústria, depois de extraído e purificado. As propriedades tecnológicas do colágeno estão intimamente relacionadas com a distribuição da massa molecular de suas fibras, que varia de acordo com as características da matéria-prima e condições do processo de obtenção do material. Com o intuito de avaliar o efeito das variáveis de processo (tempo,temperatura e pH), o colágeno foi extraído da camada interna da pele bovina e submetido a hidrólise em diferentes condições de temperatura (50, 60 e 80°C) e pH (3, 5, 7 e 10) durante 6 horas. Os produtos obtidos foram avaliados quanto ao teor de proteína solúvel, carga superficial, distribuição de massa molecular, desnaturação protéica, capacidade gelificante e emulsificante. Os produtos mostraram teor de proteína solúvel entre 5 e 82% (m/m), sendo os maiores valores obtidos em tratamentos realizados em temperatura mais elevada e/ou condições mais ácidas. Produtos obtidos em condições extremas de pH (3 e 10) ou temperaturas acima ou similar à temperatura de desnaturação do colágeno (80 e 60°C, respectivamente) tiveram sua estrutura mais desnaturada. Em geral, os hidrolisados obtidos em pH ácido formaram géis mais firmes, exceto o produzido a 80°C. Já os hidrolisados obtidos nos outros valores de pH (5, 7 e 10) formaram géis com baixos valores de tensão de ruptura porém, quando tratados em temperatura acima da temperatura de desnaturação e maior tempo de processo, apresentaram uma melhora nas propriedades gelificantes. A capacidade de retenção de água (CRA) foi próxima de 100%, exceto para hidrolisados obtidos em pH igual a 7 e 10 e temperatura de 50°C. A capacidade emulsificante destes hidrolisados também foi avaliada em emulsões óleo/água (O/A). A estabilidade das emulsões aumentou com a redução do pH e com o aumento do tempo de hidrólise, porém somente a emulsão em pH 3 e 6 horas de hidrólise não apresentou separação de fases. As emulsões mais estáveis (pH 3) apresentaram gotas com baixa polidispersão e diâmetro médio entre 1,5 e 5 µm. Em valores de pH próximo ao pI do colágeno houve a formação de agregados que desestabilizaram as emulsões, o que acarretou elevados valores de diâmetro médio (entre 8 e 17 µm). As emulsões estáveis mostraram comportamento pseudoplástico, porém nas emulsões em que ocorreu a separação de fases, a fase inferior (aquosa) sempre apresentou comportamento Newtoniano, enquanto que a fase creme foi pseudoplástica. De maneira geral, o uso de temperaturas mais amenas e pH ácido, possibilita a produção de hidrolisados com boas propriedades mecânicas, no entanto, em temperatura mais elevada obtém-se um produto com alta solubilidade. Se o objetivo é a obtenção de um gel com alta capacidade de retenção de água o mais indica-se utilizar pH abaixo ou próximo do pI ou elevadas temperaturas. Para melhorar a capacidade emulsificante o uso em pH abaixo do pI é o mais indicado / Abstract: Collagen is a byproduct of the slaughterhouse that is widely used as an ingredient in industry, after being extracted and purified. The technological properties of collagen are closely related to the molecular weight distribution of the fibers, which varies with the characteristics of raw materials and process conditions used to obtain the material. In order to evaluate the effect of process variables (time, temperature and pH), collagen was extracted from the inner layer of bovine hide and subjected to hydrolysis under different conditions of temperature (50, 60 and 80°C) and pH (3, 5, 7 and 10) for 6 hours. The products were evaluated for soluble protein content, surface charge, molecular weight distribution, protein denaturation, gelling and emulsifying capacity. The products showed soluble protein content between 5 and 82% (w / w), in which the highest values were obtained in the treatments carried out at higher temperature and/or under more acidic conditions. Products obtained under extreme conditions of pH (3 and 10) or temperatures above or similar to the collagen denaturation temperature (80 and 60°C, respectively) were more denatured. In general, the hydrolysates obtained at acidic pH formed firmer gels, except that produced at 80°C. The hydrolysates obtained in the other pH values (5, 7 and 10), in turn, formed gels with low values of strain at fractures but, when treated at temperatures above the denaturation during long time, they showed an improvement in those properties. The water holding capacity (WHC) was approximately 100%, except for hydrolysates obtained at pH 7 and 10 and temperature of 50°C. The emulsifying capacity of such hydrolysates, was also evaluated in oil/water (O/W) emulsions. The stability of the emulsion increases with decreasing pH and increasing hydrolysis time, but only at pH 3 and 6 hours of process the emulsion showed no phase separation. These emulsions showed low polydispersity and droplet size between 1.5 and 5 µm. At pH values near the pI of collagen the formation of aggregates that destabilized the emulsions occurred, which resulted in higher droplet size (between 8 and 17 mm). The stable emulsions showed shearthinning behavior, but in case of emulsions in which phase separation occurred, the lower phase (aqueous) always presented Newtonian behavior, while the cream phase was a shearthinning fluid. In general, lower temperatures and acid pH, allows the production of hydrolysates with good mechanical properties, however, at higher temperature gives a product with high solubility. If the goal is to obtain a gel with high water retention capacity, it is indicated using pH below or close to the pI or elevated temperatures. To improve the emulsifying capacity the use of pH below the pI is the most suitable / Mestrado / Engenharia de Alimentos / Mestre em Engenharia de Alimentos

Both liquid and solid wastes from Pacific whiting surimi manufacturing were characterized and value-added products were recovered. A proteinase in surimi wash water (SWW) was determined to be cathepsin L with Mr 54,200 on SDS-substrate gel. Heat treatment and acidification shifted the activity zone to M [subscript r] 39,500. No evidence of calpain, cathepsin B or H activity was found. Cathepsin L from SWW was recovered by ohmic heating (55°C for 3 min), ultrafiltration, and freeze-drying with overall yield of 0.83 g protein/L SWW and 78% recovery of activity. A 5.9 purification fold was achieved by these processes. The recovered enzyme had an optimum activity at pH 4.0 and showed preferable hydrolytic activity towards casein, acid-denatured hemoglobin and myofibrils. β-Mercaptoethanol, dithiothreitol and urea enhanced the enzyme activity. The recovered proteinase showed 18.5% residual activity after 7 wk storage at 4°C. Proteolytic activity in solid waste and digestive organs from Pacific whiting was investigated. Pepsin-like proteinase predominated in solid waste, while trypsin-like proteinase was predominant in viscera. Carboxypeptidase b was found in both viscera and solid waste. Protein hydrolysate was produced from Pacific whiting solid waste (PWSW) using commercial proteinase, Alcalase, under optimum hydrolysis conditions. Enzyme concentration, reaction time and waste/buffer ratio affected the hydrolysis and nitrogen recovery (NR). Correlation between the degree of hydrolysis (DH) and NR was high (R₂=0.978). Freeze-dried hydrolysate contained 79.97% protein and showed similar amino acid composition to PWSW and Pacific whiting muscle but tryptophan was reduced. With different DH (20, 30, 40, 50, 60%), surface hydrophobicity, total and surface sulfhydryl content decreased as the DH increased. The hydrolysate showed a high solubility over a wide pH range. Fat adsorption and fat binding capacity were reduced, while foam expansion was enhanced with an increased DH. Hydrolysate with DH of 30% showed highest emulsifying activity. Low emulsion stability and high foam stability were obtained in all hydrolysates tested. Hydrolysate showed antioxidant activity, but no obvious differences in activity were found with varying DH and hydrolysate concentrations. / Graduation date: 1997

Atualmente, muitas pesquisas são realizadas com o objetivo de desenvolver novas formulações, sejam elas cosméticas ou farmacêuticas baseadas em nanocarreadores. Devido às suas características favoráveis, nanopartículas poliméricas são propostas como veículos tópicos, principalmente para fotoprotetores, com o intuito de prolongar o tempo de resistência dos filtros na pele, evitando assim o processo de fotodegradação. Filtros solares, de uma maneira geral, são formas cosméticas emulsionadas as quais são termodinamicamente instáveis. Para evitar este processo é necessário um componente capaz de manter esta estabilidade, isto é, um tensoativo. Em alguns sistemas, polissacarídeos ou proteínas atuam como tensoativos/estabilizantes em emulsões óleo/água (O/A). Neste contexto, a proposta deste trabalho é introduzir amidos modificados (catiônicos e aniônicos) e hidrolisados como tensoativo em uma formulação para a encapsulação da benzofenona-3 com uma matriz polimérica de poli(?-caprolactona) (PCL), avaliando a influência deste estabilizante nas características físico-químicas das nanopartículas. As nanopartículas foram preparadas mediante a técnica de deposição interfacial do polímero pré-formado, empregando-se um planejamento de experimentos de mistura. Previamente, foram avaliadas as condições da hidrólise enzimática, via planejamento de experimentos, para verificar quais parâmetros (tempo e concentração da enzima) maximizariam este processo reduzindo de maneira satisfatória a massa molar do amido para posterior aplicação como estabilizante. Foram realizados testes de tensão para avaliar a capacidade tensoativa das soluções aquosas dos amidos hidrolisados, para posterior aplicação na formulação de nanopartículas. Os resultados indicaram que dois lotes de amido, de quatro avaliados, podem ser empregados como tensoativos na formulação de nanopartículas, sem alterar significativamente propriedades, como diâmetro, polidispersão e teor de encapsulação. / Currently, many researches are conducted with the aim of developing new formulations, whether cosmetic or pharmaceutical-based nanocarriers. Due to its favorable characteristics, polymeric nanoparticles are proposed as topics vehicles, mainly for sunscreens, in order to prolong the resistance of the filters on the skin, thus preventing the photodegradation process. Sunscreens, in general, are emulsified cosmetic forms which are thermodynamically unstable. To avoid this process requires a component capable of maintaining this stability, i.e., a surfactant. In some systems, polysaccharides or proteins act as surfactants/stabilizers in oil-water emulsions (O/W). In this context, the purpose of this work is to introduce modified starches (cationic and anionic) and hydrolyzed as surfactant in a formulation for the encapsulation of benzophenone-3 with a polymer matrix of poly(?-caprolactone) (PCL), evaluating the influence of this stabilizer the physical-chemical characteristics of nanoparticles. The nanoparticles were prepared by interfacial deposition pre-formed polymer technique, using a design of experiments like mixture. Previously evaluated the conditions of enzymatic hydrolysis, by design of experiments to determine which parameters (time and enzyme concentration) to maximize this process satisfactorily reducing the molecular weight of the starch for subsequent use as a stabilizer. Tension tests were conducted to assess the ability of surfactant aqueous solutions of hydrolyzed starch for application in the formulation of nanoparticles. The results indicated that two batches of starch, four-valued, can be employed as a surfactant in the suspension of nanoparticles, without significantly altering properties such as diameter, polydispersity and the content of encapsulation.

O presente estudo teve como objetivo identificar os principais compostos inibidores presentes nos hidrolisados hemicelulósicos de palha de arroz (HHPA) e bagaço de malte (HHBM), assim como avaliar o perfil fermentativo de Pichia stipitis em meio semissintético contendo os compostos previamente identificados. Foi também objetivo do trabalho avaliar a fermentação da levedura em HHPA e HHBM não destoxificados, de forma a se obter informações sobre o grau de toxicidade destes meios. Após identificação dos inibidores, incluindo ácido acético, furfural, 5-hidroximetilfurfural, vanilina, ácido ferúlico e ácido p-cumárico, foram realizados ensaios fermentativos em meio semissintético variando-se a concentração de cada composto. Os resultados mostraram que, para todos os níveis de ácido acético avaliados (1,5 a 4,5 g.L-1), o fator de conversão de substrato em etanol (YP/S) foi menos afetado do que a produtividade volumétrica em etanol (QP), sendo que para os meios contendo o maior nível deste ácido os valores de YP/S e QP foram reduzidos em 25 e 77%, respectivamente, em relação ao controle. Dentre os furanos (furfural, de 12 a 84 mg.L-1 e hidroximetilfurfural, de 218 a 553 mg.L-1), o hidroximetilfurfural na concentração de 553 mg.L-1 foi o que apresentou a maior redução nos valores de YP/S (_30%) e QP (_50%) em relação ao controle. Para os fenólicos (vanilina, siringaldeído, ácido ferúlico e ácido pcumárico), o maior impacto sobre o metabolismo fermentativo de P stipitis foi observado com o siringaldeído visto que, em todos os níveis avaliados (90 a 620 mg.L-1), os parâmetros fermentativos foram afetados. Os resultados também demonstraram que, com exceção do ácido p-cumárico, a levedura foi capaz de assimilar todos os inibidores presentes no meio e que o perfil de assimilação variou com o tipo e concentração do composto. A vanilina e os furanos foram completamente assimilados em todos os níveis estudados, enquanto que o ácido acético foi totalmente assimilado pela levedura apenas na menor concentração. Nas fermentações realizadas em HHPA e HHBM não destoxificados, os resultados mostraram que a produção de etanol foi similar ao meio semissintético sem inibidores, porém em tempos mais elevados. Além disso, em HHBM o valor de YP/S foi ligeiramente superior (_10%) ao observado no HHPA, o que pode ser atribuído às variações na composição nutricional de cada hidrolisado. O perfil fermentativo da levedura em ambos os hidrolisados mostrou uma cinética mais lenta quando comparado aos meios semissintéticos mimetizando a composição destes, o que sugere a existência de outras substâncias tóxicas nos hidrolisados além das avaliadas neste estudo. Com base nos resultados obtidos no presente estudo pode-se concluir que, dentre os inibidores identificados nos hidrolisados, o ácido acético foi o composto de maior potencial inibitório, seguido pelos furanos e fenólicos, sendo o efeito destes compostos mais pronunciado na produtividade volumétrica em etanol do que no fator de conversão de substrato em etanol. Estas informações são de fundamental importância na elaboração de estratégias de destoxificação e/ou condução do processo visando à melhoria da fermentação em hidrolisados. / The aim of this study was to identify the major inhibitory compounds present in rice straw hemicellulose hydrolysate (RSHH) and brewer\'s spent grain hemicellulose hydrolysate (BSGHH), as well as evaluate Pichia stipitis fermentation profile in semi-synthetic medium containing the previously identified compounds. It was also purpose of this study to evaluate the fermentation of RSHH and BSGHH without detoxification, in order to obtain information about the degree of toxicity of these media. After inhibitors identification, including acetic acid, furfural, 5- hydroxymethylfurfural, vanillin, ferulic acid and p-coumaric acid, fermentation assays were carried out on semi-synthetic medium by varying the concentration of each compound. The results showed that, for all evaluated levels of acetic acid (from 1.5 to 4.5 g.L-1), the ethanol yield (YP/S) was less affected than the ethanol volumetric productivity (QP), and for the media containing the higher evaluated level, the values of YP/S and QP were reduced by 25 and 77%, respectively, compared to control. Among furans (furfural, from 12 to 84 mg.L-1 and hydroxymethylfurfural, from 218 to 553 mg.L-1), the hydroxymethylfurfural at 553 mg.L-1 showed the highest reduction in YP/S (~30%) and QP (~50%) compared to control. For the phenolic compounds (vanillin, syringaldehyde, ferulic acid and pcoumaric acid), the greatest impact on the Pichia stipitis fermentative metabolism was observed with syringaldehyde since the fermentative parameters were affected at all evaluated levels (from 90 to 620 mg.L-1). The results also showed that, except for the p-coumaric acid, the yeast was able to assimilate all inhibitory compunds in the medium and that the assimilation profile varied with the type and concentration of these compounds. Vanillin and furans were completely assimilated at all studied levels, whereas acetic acid was completely assimilated only at the lowest concentration. The ethanol production in RSHH and BSGHH was similar to that observed in semi-synthetic medium without inhibitors, but in a longer period of time. In addition, the YP/S value obtained in BSGHH was slightly higher (~10%) than that observed in RSHH, which can be attributed to variations in the nutritional composition of each hydrolysate. The yeast fermentation profile in both hydrolysates showed slower kinetics when compared to semi-synthetic medium containing the same inhibitors, which suggests the existence of other toxic substances in the hydrolysate in addition to those evaluated in this study. Based on the results obtained in this study, it can be concluded that, among the inhibitors identified in hydrolysates, acetic acid was the main inhibitory compound, followed by furans and phenolics. The most pronounced effect of these compounds was in ethanol volumetric productivity rather than in the ethanol yield. This information is of fundamental importance in the development of detoxification and/or process conduction strategies aimed at improving the fermentation in hemicellulosic hydrolysates.

Atualmente, muitas pesquisas são realizadas com o objetivo de desenvolver novas formulações, sejam elas cosméticas ou farmacêuticas baseadas em nanocarreadores. Devido às suas características favoráveis, nanopartículas poliméricas são propostas como veículos tópicos, principalmente para fotoprotetores, com o intuito de prolongar o tempo de resistência dos filtros na pele, evitando assim o processo de fotodegradação. Filtros solares, de uma maneira geral, são formas cosméticas emulsionadas as quais são termodinamicamente instáveis. Para evitar este processo é necessário um componente capaz de manter esta estabilidade, isto é, um tensoativo. Em alguns sistemas, polissacarídeos ou proteínas atuam como tensoativos/estabilizantes em emulsões óleo/água (O/A). Neste contexto, a proposta deste trabalho é introduzir amidos modificados (catiônicos e aniônicos) e hidrolisados como tensoativo em uma formulação para a encapsulação da benzofenona-3 com uma matriz polimérica de poli(?-caprolactona) (PCL), avaliando a influência deste estabilizante nas características físico-químicas das nanopartículas. As nanopartículas foram preparadas mediante a técnica de deposição interfacial do polímero pré-formado, empregando-se um planejamento de experimentos de mistura. Previamente, foram avaliadas as condições da hidrólise enzimática, via planejamento de experimentos, para verificar quais parâmetros (tempo e concentração da enzima) maximizariam este processo reduzindo de maneira satisfatória a massa molar do amido para posterior aplicação como estabilizante. Foram realizados testes de tensão para avaliar a capacidade tensoativa das soluções aquosas dos amidos hidrolisados, para posterior aplicação na formulação de nanopartículas. Os resultados indicaram que dois lotes de amido, de quatro avaliados, podem ser empregados como tensoativos na formulação de nanopartículas, sem alterar significativamente propriedades, como diâmetro, polidispersão e teor de encapsulação. / Currently, many researches are conducted with the aim of developing new formulations, whether cosmetic or pharmaceutical-based nanocarriers. Due to its favorable characteristics, polymeric nanoparticles are proposed as topics vehicles, mainly for sunscreens, in order to prolong the resistance of the filters on the skin, thus preventing the photodegradation process. Sunscreens, in general, are emulsified cosmetic forms which are thermodynamically unstable. To avoid this process requires a component capable of maintaining this stability, i.e., a surfactant. In some systems, polysaccharides or proteins act as surfactants/stabilizers in oil-water emulsions (O/W). In this context, the purpose of this work is to introduce modified starches (cationic and anionic) and hydrolyzed as surfactant in a formulation for the encapsulation of benzophenone-3 with a polymer matrix of poly(?-caprolactone) (PCL), evaluating the influence of this stabilizer the physical-chemical characteristics of nanoparticles. The nanoparticles were prepared by interfacial deposition pre-formed polymer technique, using a design of experiments like mixture. Previously evaluated the conditions of enzymatic hydrolysis, by design of experiments to determine which parameters (time and enzyme concentration) to maximize this process satisfactorily reducing the molecular weight of the starch for subsequent use as a stabilizer. Tension tests were conducted to assess the ability of surfactant aqueous solutions of hydrolyzed starch for application in the formulation of nanoparticles. The results indicated that two batches of starch, four-valued, can be employed as a surfactant in the suspension of nanoparticles, without significantly altering properties such as diameter, polydispersity and the content of encapsulation.

O presente estudo teve como objetivo identificar os principais compostos inibidores presentes nos hidrolisados hemicelulósicos de palha de arroz (HHPA) e bagaço de malte (HHBM), assim como avaliar o perfil fermentativo de Pichia stipitis em meio semissintético contendo os compostos previamente identificados. Foi também objetivo do trabalho avaliar a fermentação da levedura em HHPA e HHBM não destoxificados, de forma a se obter informações sobre o grau de toxicidade destes meios. Após identificação dos inibidores, incluindo ácido acético, furfural, 5-hidroximetilfurfural, vanilina, ácido ferúlico e ácido p-cumárico, foram realizados ensaios fermentativos em meio semissintético variando-se a concentração de cada composto. Os resultados mostraram que, para todos os níveis de ácido acético avaliados (1,5 a 4,5 g.L-1), o fator de conversão de substrato em etanol (YP/S) foi menos afetado do que a produtividade volumétrica em etanol (QP), sendo que para os meios contendo o maior nível deste ácido os valores de YP/S e QP foram reduzidos em 25 e 77%, respectivamente, em relação ao controle. Dentre os furanos (furfural, de 12 a 84 mg.L-1 e hidroximetilfurfural, de 218 a 553 mg.L-1), o hidroximetilfurfural na concentração de 553 mg.L-1 foi o que apresentou a maior redução nos valores de YP/S (_30%) e QP (_50%) em relação ao controle. Para os fenólicos (vanilina, siringaldeído, ácido ferúlico e ácido pcumárico), o maior impacto sobre o metabolismo fermentativo de P stipitis foi observado com o siringaldeído visto que, em todos os níveis avaliados (90 a 620 mg.L-1), os parâmetros fermentativos foram afetados. Os resultados também demonstraram que, com exceção do ácido p-cumárico, a levedura foi capaz de assimilar todos os inibidores presentes no meio e que o perfil de assimilação variou com o tipo e concentração do composto. A vanilina e os furanos foram completamente assimilados em todos os níveis estudados, enquanto que o ácido acético foi totalmente assimilado pela levedura apenas na menor concentração. Nas fermentações realizadas em HHPA e HHBM não destoxificados, os resultados mostraram que a produção de etanol foi similar ao meio semissintético sem inibidores, porém em tempos mais elevados. Além disso, em HHBM o valor de YP/S foi ligeiramente superior (_10%) ao observado no HHPA, o que pode ser atribuído às variações na composição nutricional de cada hidrolisado. O perfil fermentativo da levedura em ambos os hidrolisados mostrou uma cinética mais lenta quando comparado aos meios semissintéticos mimetizando a composição destes, o que sugere a existência de outras substâncias tóxicas nos hidrolisados além das avaliadas neste estudo. Com base nos resultados obtidos no presente estudo pode-se concluir que, dentre os inibidores identificados nos hidrolisados, o ácido acético foi o composto de maior potencial inibitório, seguido pelos furanos e fenólicos, sendo o efeito destes compostos mais pronunciado na produtividade volumétrica em etanol do que no fator de conversão de substrato em etanol. Estas informações são de fundamental importância na elaboração de estratégias de destoxificação e/ou condução do processo visando à melhoria da fermentação em hidrolisados. / The aim of this study was to identify the major inhibitory compounds present in rice straw hemicellulose hydrolysate (RSHH) and brewer\'s spent grain hemicellulose hydrolysate (BSGHH), as well as evaluate Pichia stipitis fermentation profile in semi-synthetic medium containing the previously identified compounds. It was also purpose of this study to evaluate the fermentation of RSHH and BSGHH without detoxification, in order to obtain information about the degree of toxicity of these media. After inhibitors identification, including acetic acid, furfural, 5- hydroxymethylfurfural, vanillin, ferulic acid and p-coumaric acid, fermentation assays were carried out on semi-synthetic medium by varying the concentration of each compound. The results showed that, for all evaluated levels of acetic acid (from 1.5 to 4.5 g.L-1), the ethanol yield (YP/S) was less affected than the ethanol volumetric productivity (QP), and for the media containing the higher evaluated level, the values of YP/S and QP were reduced by 25 and 77%, respectively, compared to control. Among furans (furfural, from 12 to 84 mg.L-1 and hydroxymethylfurfural, from 218 to 553 mg.L-1), the hydroxymethylfurfural at 553 mg.L-1 showed the highest reduction in YP/S (~30%) and QP (~50%) compared to control. For the phenolic compounds (vanillin, syringaldehyde, ferulic acid and pcoumaric acid), the greatest impact on the Pichia stipitis fermentative metabolism was observed with syringaldehyde since the fermentative parameters were affected at all evaluated levels (from 90 to 620 mg.L-1). The results also showed that, except for the p-coumaric acid, the yeast was able to assimilate all inhibitory compunds in the medium and that the assimilation profile varied with the type and concentration of these compounds. Vanillin and furans were completely assimilated at all studied levels, whereas acetic acid was completely assimilated only at the lowest concentration. The ethanol production in RSHH and BSGHH was similar to that observed in semi-synthetic medium without inhibitors, but in a longer period of time. In addition, the YP/S value obtained in BSGHH was slightly higher (~10%) than that observed in RSHH, which can be attributed to variations in the nutritional composition of each hydrolysate. The yeast fermentation profile in both hydrolysates showed slower kinetics when compared to semi-synthetic medium containing the same inhibitors, which suggests the existence of other toxic substances in the hydrolysate in addition to those evaluated in this study. Based on the results obtained in this study, it can be concluded that, among the inhibitors identified in hydrolysates, acetic acid was the main inhibitory compound, followed by furans and phenolics. The most pronounced effect of these compounds was in ethanol volumetric productivity rather than in the ethanol yield. This information is of fundamental importance in the development of detoxification and/or process conduction strategies aimed at improving the fermentation in hemicellulosic hydrolysates.

Microbial-based industrial production has experienced a revolutionary development in the last decades as chemical industry has shifted its focus towards more sustain- able production of fuels, building blocks for materials, polymers, chemicals, etc. The strain engineering and optimization programs for industrially relevant phenotypes tackle three challenges for increased production: optimization of titer, productivity, and yield. The yield of production is function of the robustness of the microbe, generally associated with complex phenotypes. The poor understanding of complex phenotypes associated with increased production poses a challenge for the rational design of strains of more robust microbial producers. Laboratory adaptive evolution is a strain engineering technique used to provide fundamental biological insight through observation of the evolutionary process, in order to uncover molecular determinants associated with the desired phenotype. In this dissertation, the development of different methodologies to study complex phenotypes in microbial systems using laboratory adaptive evolution is described. Several limitations imposed for the nature of the technique were discussed and tackled. Three different cases were studied. Initially, the n-butanol tolerance in Escherichia coli was studied in order to illustrate the effect of clonal interference in microbial systems propagated under selective pressure of an individual stressor. The methodology called Visualizing Evolution in Real Time (VERT) was developed, to aid in mapping out the adaptive landscape of n-butanol tolerance, allowing the uncovering of divergent mechanisms of tolerance. A second case involves the study of clonal interference of microbial systems propagated under several stressors. Using VERT, Saccharomyces cerevisiae was evolved in presence of hydrolysates of lignocellulosic biomass. Isolated mutants showed differential fitness advantage to individual inhibitors present in the hydrolysates; however, some mutants exhibited increased tolerance to hydrolysates, but not to individ- ual stressors. Finally, dealing with the problem of using adaptive evolution to increase production of secondary metabolites, an evolutionary strategy was successfully designed and applied in S. cerevisiae, to increase the production of carotenoids in a short-term experiment. Molecular mechanisms for increased carotenoids production in isolates were identified.

Orientadores: Angela Maria Moraes, Carlos Augusto Pereira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-09T04:29:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Galesi_AdrianaLagesLima_D.pdf: 1381119 bytes, checksum: 756e8fc5c7c30b40f7e2ebe60c293b63 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Células de inseto têm sido freqüentemente empregadas na obtenção de proteínas recombinantes devido a algumas vantagens em relação às células de mamíferos, e a linhagem Drosophila melanogaster Schneider 2 é um dos sistemas de expressão utilizados para este propósito. Entretanto, a literatura é escassa em relação ao metabolismo e ao cultivo destas células, o que motivou o desenvolvimento deste trabalho. O objetivo deste estudo foi determinar, através da técnica estatística de planejamento fatorial de experimentos, um meio de cultura adequado ao crescimento da linhagem Drosophila melanogaster Schneider 2 transfectada para expressão da glicoproteína do vírus da raiva (GPV) e avaliar seu comportamento nos diferentes meios formulados. Para tal, no meio basal TC100, foram estudados os efeitos dos suplementos glicose, glutamina, concentrado protéico de soro de leite, yeastolate (extrato de levedura), hidrolisado de soja, lactoalbumina hidrolisada, emulsão lipídica e Pluronic F68 sobre o crescimento e a viabilidade celular, na tentativa de reduzir o percentual de soro fetal bovino do meio de cultura. A combinação de diferentes suplementos permitiu que o soro fetal bovino fosse eliminado do meio de cultura, principalmente em decorrência da adição de yeastolate, e, em várias das formulações desenvolvidas, a densidade de células foi bastante superior àquela obtida empregando o meio basal TC100 suplementado com 10% de soro fetal bovino. O meio de cultura que resultou no melhor desempenho celular foi formulado com o meio TC100 suplementado com 10 g/L de glicose e 3,5 g/L de glutamina (concentrações finais), 3 g/L de yeastolate, 1% (v/v) de emulsão lipídica e 0,1 % (m/v) de Pluronic F68. Inicialmente, os ensaios realizados em biorreator não reproduziram o crescimento celular obtido em menor escala. Porém, com o aumento da concentração de Pluronic F68 para 0,6%, tal limitação foi contornada. Glicose não foi o substrato limitante nos meios formulados e lactato foi produzido em pequenas quantidades. Apesar de produzido em elevadas concentrações, o amônio não influenciou o crescimento celular. A dosagem da glicoproteína mostrou que as células não perderam sua capacidade de expressão após a adaptação em diferentes meios de cultura e que a produção de GPV no meio formulado é superior à verificada com os meios comerciais SF900 II e TC100 suplementado com 10% de soro fetal bovino / Abstract: Insect cells have been intensively employed to obtain recombinant proteins due to some advantages over mammalian cells, and the Drosophila melanogaster Schneider 2 cell line is one of the expression systems used for this purpose. Nevertheless, literature is scarce with regard to metabolism and culture of these cells, what motivated the development of this work. The aim of this study was to establish an adequate culture medium to cultivate Drosophila melanogaster Schneider 2 cells transfected for the expression of the rabies virus glycoprotein (GPV), and to evaluate their behaviour in different formulated media. For this, the factorial design strategy was employed. The effects of glucose, glutamine, whey protein concentrate, yeastolate, soy hydrolysate, lactoalbumin hydrolysate, lipid emulsion and Pluronic F68 were studied over cell growth and viability, aiming to reduce the fetal bovine serum percentage from the culture medium. Adjusting the concentration of these distinct compounds, serum was eliminated, mainly due to the addition of yeastolate, and cell concentration was higher in several of the developed formulations than that achieved with basal TC100 medium supplemented with 10% of serum. The formulated medium which resulted in best cell performance was composed by TC100 containing 10 g/L of glucose, 3.5 g/L of glutamine, 3 g/L of yeastolate, 1% (v/v) of lipid emulsion and 0.1% (w/v) of Pluronic F68. When in bioreactor, initially the cells did not reproduce the growth behavior observed in smaller scale. However, increasing Pluronic F68 percentage to 0.6%, this limitation was circunvended. Glucose was not the limiting substrate in formulated culture media and lactate was produced in low quantities. Despite ammonium was produced in high concentrations, this compound did not influence cell growth. Glycoprotein quantification shows that cells did not loose their expression capacity after adaptation in the different media, and that glycoprotein production in the formulated medium was higher than that obtained in SF900 II medium and TC100 medium containing 10% of fetal bovine serum / Doutorado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Doutor em Engenharia Química