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Background The inducible Cre-lox system is a valuable tool to study gene function in a spatial and time restricted fashion in mouse models. This strategy relies on the limited background activity of the modified Cre recombinase (CreER) in the absence of its inducer, the competitive estrogen receptor ligand, tamoxifen. The RIP-CreER mouse (Tg (Ins2-cre/Esr1) 1Dam) is among the few available β-cell specific CreER mouse lines and thus it has been often used to manipulate gene expression in the insulin-producing cells of the endocrine pancreas. Principal Findings Here, we report the detection of tamoxifen-independent Cre activity as early as 2 months of age in RIP-CreER mice crossed with three distinct reporter strains. Significance Evidence of Cre-mediated recombination of floxed alleles even in the absence of tamoxifen administration should warrant cautious use of this mouse for the study of pancreatic β-cells.

Expression of the kallikrein-related peptidase 7 (KLK7) is dysregulated in ovarian cancer. We assessed KLK7 expression by ELISA and quantitative immunohistochemistry and analyzed its association with clinicopathological parameters and patients’ outcome. KLK7 antigen concentrations were determined in tumor tissue extracts of 98 ovarian cancer patients by ELISA. For analysis of KLK7 immunoexpression in ovarian cancer tissue microarrays, a manual quantitative scoring system as well as a software tool for quantitative high-throughput automated image analysis was used. In immunohistochemical analyses, expression levels of KLK7 were not associated with patients’ outcome. However, in multivariate analyses, KLK7 antigen levels in tumor tissue extracts were significantly associated with both overall and progression-free survival: ovarian cancer patients with high KLK7 levels had a significantly, 2-fold lower risk of death [hazard ratio (HR) = 0.51, 95% confidence interval (CI) = 0.29–0.90, ρ = 0.019] or relapse [HR = 0.47, 95% CI = 0.25–0.91, ρ = 0.024), as compared with patients who displayed low KLK7 levels. Our results indicate that – in contrast to earlier findings – high KLK7 antigen levels in tumor tissue extracts may be associated with a better prognosis of ovarian cancer patients.

Subklinische entzündliche Veränderungen des Endometriums können nur durch die histopathologische Untersuchung eines Bioptates diagnostiziert werden und sind von besonderer Bedeutung bei Fertilitätsstörungen. Die nicht-eitrige (NE) Endometritis ist gekennzeichnet durch eine Infiltration des Endometriums mit Lymphozyten, Plasmazellen und/oder Makrophagen. Die genaue Pathogenese ist unklar. Die immunhistologische Phänotypisierung dieser Zell-(sub-)populationen kann möglicherweise pathogenetische Hinweise geben. Der immunhistologische Nachweis equiner Immunzellen ist jedoch fast ausschließlich an Gefrierschnitten etabliert. Dies ist für die Routinediagnostik ungeeignet. Demzufolge ergaben sich die folgenden Ziele: 1. Eine alternative Methode zur Gewebsfixierung zu etablieren, die in der Routinediagnostik praktikabel einsetzbar ist, die einen guten Strukturerhalt, eine geeignete Anfärbbarkeit und ideale Auswertbarkeit gewährleistet sowie umfangreiche immunhistochemische Untersuchungen ermöglicht; 2. Die immunhistochemische Phänotypisierung von Lymphozyten- und Makrophagen-(sub-)populationen an fixierten equinen Gewebeproben zu entwickeln; 3. Eine semiquantitative Bestimmung der endometrialen Entzündungszellen ohne und mit einer NE Endometritis durchzuführen. Tiere, Material & Methoden: Gewebeproben (Lymphknoten als Referenzgewebe und endometriales Gewebe) wurden von 5 Stuten im Rahmen der Sektion entnommen, in Formalin (F), HOPE® (H) oder IHC Zinc Fixative (Z) fixiert und zusätzlich als natives Gefriermaterial aufgearbeitet. Es erfolgte eine vergleichende Beurteilung der Gewebemorphologie, des Färbeverhaltens und der Artefakte am equinen Endometrium in HE gefärbten Gefrierschnitten bzw. im fixierten, Paraffin-eingebetteten Material (F, H und Z). Equine Lymphknoten dienten als Referenzgewebe für die immunhistochemische Etablierung der Lymphozytenmarker (anti-CD3, -CD4, -CD8) an Gefrierschnitten und am fixierten, Paraffin-eingebetteten Material (F, H und Z). F- und Z-fixiertes Referenzgewebe (Leber, Dünndarm, Darmlymphknoten) von 4 Stuten wurde für die Etablierung der Makrophagenmarker (anti-CD172a, -CD14, -CD206) verwendet. Die Immunreaktionen der Primärantikörper wurden verglichen. Als Resultat aus den vergleichenden Analysen wurde die Z-Fixierung als effektivste alternative Fixierungsmethode ausgewählt. Im abschließenden Teil der Untersuchungen wurden 28 Z-fixierte Endometriumbioptate hinsichtlich der Entzündungszellen semiquantitativ ausgewertet. 4 Stuten zeigten keine Entzündungsreaktion und dienten als Kontrolle. 24 Stuten wiesen eine oberflächliche NE Endometritis auf. Die Anzahl CD3+, CD4+, CD8+, CD20+, CD172a+, CD14+ und CD206+ Zellen sowie die Anzahl von Plasmazellen mittels Methylgrün-Pyronin-Färbung wurde an Serienschnitten in 5 zufällig ausgewählten Gesichtsfeldern (400x) jeweils für das Stratum compactum, Stratum spongiosum und das luminale sowie glanduläre Epithel erhoben. Ergebnisse: 1. Die Z-Fixierung zeigt mit der F-Fixierung vergleichbare, exzellente Eigenschaften hinsichtlich des Strukturerhalts, der Anfärbbarkeit und Auswertbarkeit. Sie übersteigt insgesamt die Eigenschaften der H-Fixierung: die Z-Fixierung erweist sich einfacher in der Anwendung und zeigt eine geringere Artefaktbildung. 2. Die immunhistochemische Charakterisierung von T- und B-Lymphozyten, Helfer-T-Lymphozyten sowie zytotoxischen T-Lymphozyten und Makrophagenpopulationen sowie der Nachweis von Plasmazellen mittels Methylgrün-Pyronin-Färbung an Z-fixierten equinen Gewebeproben ist möglich. 3. Im entzündlich veränderten Endometrium sind mehr CD3+, CD4+, CD8+, CD20+, CD172a+, CD206+ Zellen sowie Plasmazellen nachweisbar als in unveränderten Gewebeproben bezogen auf das Stratum compactum und Stratum spongiosum. Die durchschnittliche Anzahl CD3+ Zellen ist im Stratum compactum NE Endometritiden knapp 3x höher als im unveränderten Endometrium. Wenige CD20+ B-Zellen und CD172a+ Makrophagen sowie eine unterschiedliche Anzahl an Plasmazellen sind innerhalb des Stratum compactum entzündlich veränderter Endometrien nachweisbar. Es existieren große individuelle Unterschiede in der Anzahl CD4+ und CD8+ T-Zellen in Endometrien ohne sowie mit einer Entzündung. Schlussfolgerungen: Eine Integration der Z-Fixierung in die Routinediagnostik mit zusätzlichen Anwendungsmöglichkeiten ist problemlos möglich. Die immunhistochemische Entzündungszelldifferenzierung im Endometrium der Stute kann an fixierten equinen Endometriumbioptaten durchgeführt werden und bietet darüber hinaus die Möglichkeit, diese Methode an anderen equinen Organen anzuwenden. Die Ergebnisse der semiquantitiven Auswertung deuten auf das mögliche Vorliegen unterschiedlicher Formen der nicht-eitrigen Entzündung hin. Das etablierte Verfahren gibt möglicherweise nähere Hinweise auf immunologische Konstellationen, die das Auftreten einer nicht-eitrigen Endometritis begünstigen.:INHALTSVERZEICHNIS I ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS II 1 EINLEITUNG 1 2 LITERATURÜBERSICHT 2 2.1 Das Endometrium der Stute 2 2.1.1 Endometritiden 4 2.1.1.1 Eitrige Endometritis 4 2.1.1.2 Nicht-eitrige Endometritis 5 2.1.1.3 Sonderformen 6 2.1.2 Resistant und susceptible mares 8 2.1.3 Entzündungszelltypisierung im Endometrium der Stute 10 2.1.4 Diagnostische Bedeutung des Endometriumbioptates 13 2.2 Immunologie 14 2.2.1 T-Lymphozyten 14 2.2.2 B-Lymphozyten 17 2.2.3 Makrophagen 18 2.2.4 Immunhistochemische Charakterisierung von equinen Entzündungszellen 21 2.3 Fixierungsmethoden 24 2.4 Fazit aus der Literatur bezüglich der Fragestellung dieser Arbeit 26 3 PUBLIKATIONEN 28 3.1 Publikation 1 inkl. Stellungnahme zum Eigenanteil 28 3.2 Publikation 2 inkl. Stellungnahme zum Eigenanteil 39 4 DISKUSSION 53 4.1 Etablierung alternativer Methoden zur Gewebefixierung 54 4.2 Immunhistochemische Detektion von Immunzell- (sub-)populationen 59 4.3 Erkenntnisse im Hinblick auf die Pathogenese nicht-eitriger Endometritiden 60 5 ZUSAMMENFASSUNG 63 6 SUMMARY 65 7 LITERATURVERZEICHNIS 67 8 DANKSAGUNG 81 / Clinically unapparent inflammatory alterations of the equine endometrium can only be diagnosed by the histopathological examination of a biopsy and are the main cause of subfertility in mares. The non-suppurative endometritis is characterised by infiltration of the endometrium with lymphocytes, plasma cells and/or macrophages. So far, the cause and pathogenesis of non-suppurative endometritis are unclear. The subclassification of the immune cell populations involved will likely provide important information on the etiology and pathogenesis of this disease. Available antibodies are often established exclusively for immunohistochemistry on cryostat sections of native frozen equine tissue. However, this method is impractical for the routine diagnostic work-up. The aim of the present study was: 1. To reveal the method most suitable for a routine diagnostic work-up in combination with proper tissue preservation, staining results as well as histological and immunohistochemical analysis; 2. To establish an immunohistochemical method for the detection of lymphocytes and macrophages including their subpopulations in fixed equine tissue samples; 3. To characterize the immune cell populations in fixed endometria of mares without and with non-suppurative endometritis. Material & methods: Equine endometrial tissue and intestinal lymph node were obtained from five mares during post mortem examination and were either fixed in formalin, HOPE® or IHC Zinc Fixative. Aditionally snap frozen tissue samples were processed for cryostat sectioning. HE stained cryostat sections and fixed paraffin embedded tissue samples (formalin, HOPE®, IHC Zinc Fixative) of the equine endometrium were analysed regarding tissue preservation, staining results and artefacts. To establish lymphocyte markers (anti-CD3, anti-CD4 and anti-CD8) immunohistochemically on cryostat sections and fixed paraffin embedded tissue samples (formalin, HOPE®, IHC Zinc Fixative) equine lymph node was used as reference. Formalin fixed and zinc fixed tissue samples with macrophage populations (liver, small intestine, intestinal lymph node) from four mares were used for the immunohistochemical establishment of the macrophage markers (anti-CD172a, anti-CD14, anti-CD206). The immunoreactivity of the primary antibodies was compared. The results of the comparative analysis revealed the most suitable alternative fixation method (zinc fixation). Finally, 28 zinc fixed endometrial biopsies were evaluated semiquantitatively with regard to the numbers of CD3+, CD4+, CD8+, CD20+ lymphocytes, CD172+, CD14+, CD206+ macrophages as well as plasma cells. Four mares had no evidence of endometritis and represent the control group. The remaining 24 mares showed a mild superficial non-suppurative endometritis. The comparative analysis was performed in serial sections within five randomly selected high power fields (400x). Positive cells were counted separately within the luminal and glandular epithelium, the stratum compactum and the stratum spongiosum. Results: 1. The zinc fixation provides excellent staining results, tissue preservation and allows histological and immunohistochemical analysis. It has even some advantages compared to the HOPE® fixation regarding the routine diagnostic work-up. The zinc fixation produces less artefacts. 2. The zinc fixation allows the immunohistochemical detection of all applied T- and B-lymphocyte-, helper- and cytotoxic-T-cell- and macrophage-markers and the histochemical detection of plasma cells (methyl green-pyronin stain) within equine fixed tissue. 3. Endometria with non-suppurative endometritis have higher numbers of CD3+, CD4+, CD8+, CD20+, CD172a+, CD206+ as well as plasma cells within the stratum compactum and stratum spongiosum than endometria without inflammation. The average cell count of CD3+ lymphocytes within the stratum compactum was approximately 3 x higher within inflamed endometria than this value obtained from endometria without endometritis. Few CD20+ B cells and CD172+ macrophages as well as variable numbers of plasma cells could be detected within the stratum compactum of mares with non-suppurative endometritis. Endometria with and without inflammation showed marked differences in the numbers of CD4+ and CD8+ T cells. Conclusion: The zinc fixation can be easily incoorporated into the routine diagnostic work-up and offers additional application possibilities. Immunohistochemical phenotyping of immune cells in the equine endometrium can be performed on fixed endometrial biopsies of the mare. Furthermore, a widespread applicability is possible, e. g. on other equine organs. These findings suggest the existence of different forms of non-suppurative endometritis. The established method will likely assist to reveal possible etiologies and predisposing conditions for non-suppurative endometritis.:INHALTSVERZEICHNIS I ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS II 1 EINLEITUNG 1 2 LITERATURÜBERSICHT 2 2.1 Das Endometrium der Stute 2 2.1.1 Endometritiden 4 2.1.1.1 Eitrige Endometritis 4 2.1.1.2 Nicht-eitrige Endometritis 5 2.1.1.3 Sonderformen 6 2.1.2 Resistant und susceptible mares 8 2.1.3 Entzündungszelltypisierung im Endometrium der Stute 10 2.1.4 Diagnostische Bedeutung des Endometriumbioptates 13 2.2 Immunologie 14 2.2.1 T-Lymphozyten 14 2.2.2 B-Lymphozyten 17 2.2.3 Makrophagen 18 2.2.4 Immunhistochemische Charakterisierung von equinen Entzündungszellen 21 2.3 Fixierungsmethoden 24 2.4 Fazit aus der Literatur bezüglich der Fragestellung dieser Arbeit 26 3 PUBLIKATIONEN 28 3.1 Publikation 1 inkl. Stellungnahme zum Eigenanteil 28 3.2 Publikation 2 inkl. Stellungnahme zum Eigenanteil 39 4 DISKUSSION 53 4.1 Etablierung alternativer Methoden zur Gewebefixierung 54 4.2 Immunhistochemische Detektion von Immunzell- (sub-)populationen 59 4.3 Erkenntnisse im Hinblick auf die Pathogenese nicht-eitriger Endometritiden 60 5 ZUSAMMENFASSUNG 63 6 SUMMARY 65 7 LITERATURVERZEICHNIS 67 8 DANKSAGUNG 81

Background: Pancreatic cancer is one of the leading causes of cancer-related death. Using DNA gene expression analysis based on a custom made Affymetrix cancer array, we investigated the expression pattern of both primary and established pancreatic carcinoma cell lines. Methods: We analyzed the gene expression of 5 established pancreatic cancer cell lines (AsPC-1, BxPC-3, Capan-1, Capan-2 and HPAF II) and 5 primary isolates, 1 of them derived from benign pancreatic duct cells. Results: Out of 1,540 genes which were expressed in at least 3 experiments, we found 122 genes upregulated and 18 downregulated in tumor cell lines compared to benign cells with a fold change > 3. Several of the upregulated genes (like Prefoldin 5, ADAM9 and E-cadherin) have been associated with pancreatic cancer before. The other differentially regulated genes, however, play a so far unknown role in the course of human pancreatic carcinoma. By means of immunohistochemistry we could show that thymosin [β-10 (TMSB10), upregulated in tumor cell lines, is expressed in human pancreatic carcinoma, but not in non-neoplastic pancreatic tissue, suggesting a role for TMSB10 in the carcinogenesis of pancreatic carcinoma. Conclusion: Using gene expression profiling of pancreatic cell lines we were able to identify genes differentially expressed in pancreatic adenocarcinoma, which might contribute to pancreatic cancer development. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

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Der monoklonale Antikörper SM5-1 wurde in Vorarbeiten mittels eines Immunisierungsprotokolls (Kooperation Prof. Guo, Cleveland, USA) von einer humanen Melanom-Zell-Linie gewonnen. In der vorliegenden Arbeit wurde an nicht-melanozytären benignen Geweben, 16 Nävi, 84 nicht-melanozytären Tumoren sowie 745 Melanomproben das Färbeverhalten von SM5-1 mittels Immunhistochemie charakterisiert. SM5-1 wurde zunächst mit HMB-45 und anti-S100 an 250 primären und 151 metastasierten Melanomen und in einer zweiten Stichprobe mit Antikörpern gegen Melan-A/MART-1 (A103) und Tyrosinase (T311) an 101 primären und 243 metastasierten Melanomen verglichen. Es zeigte sich, dass SM5-1 für normale Zellen negativ ist. SM5-1, anti-S100 und HMB-45 färbten 100% der Nävi und 97 - 99% der 250 primären Melanome. Während SM5-1 und anti-S100 96% der 151 Melanommetastasen korrekt identifizierten, waren für HMB-45 nur 83% der Proben positiv. Alle HMB-45 negativen Metastasen reagierten mit SM5-1. Weder SM5-1 noch HMB-45 färbten nicht-melanozytäre Tumore, wohingegen der unspezifischere Antikörper anti-S100 21 von 84 dieser Tumore färbte. Insgesamt wurde beim primären und metastasierten Melanom für SM5-1 eine Sensitivität von 98%, für HMB-45 von 93% und für anti-S100 von 97% beobachtet. Im Vergleich der Antikörper SM5-1, A103 und T311 färbten SM5-1 92,4%, A103 82,9% und T311 71,2% der insgesamt 344 primären und metastasierten Melanome. SM5-1 zeigte innerhalb einer Tumorzellpopulation ein homogeneres Färbeverhalten und eine höhere Färbeintensität bei den 243 Melanommetastasen als A103 und T311. Der monoklonale Antikörper SM5-1 zeigte gegenüber den gebräuchlichen Antikörpern erhebliche Vorteile bei der immunhistochemischen Beurteilung des Melanoms, insbesondere bei dessen Metastasen. Somit kann er als Marker der ersten Wahl bei der immunhistochemischen Diagnostik von Melanomen empfohlen werden. Um die Rolle des durch SM5-1 erkannten Antigens zu verstehen, sind jedoch noch weitere Untersuchungen notwendig. / Antibodies such as HMB-45 and anti-S100 protein have been widely used as markers of malignant melanoma. Using a subtractive immunization protocol in preliminary works (cooperation Prof. Guo, Cleveland, USA), the monoclonal antibody SM5-1 was generated from a mouse model of human melanoma. The immunhistochemical staining of SM5-1 was studied in paraffin-embedded specimens of normal non-melanocytic tissue, melanocytic nevi of the skin (n = 16), non-melanocytic neoplasms (n = 84) and 745 melanomas. 250 primary melanomas and 151 metastases were compared with HMB-45 and anti-S100 staining. Further 101 primary melanomas and 243 metastases were compared with Melan-A/MART-1 (A103) and tyrosinase (T311). Staining of normal cells for SM5-1 was found to be negative. SM5-1, anti-S100 and HMB-45 reacted with nevi and 97 - 99% of 250 primary melanomas. Whereas SM5-1 and anti-S100 showed a high degree of positive staining in 96% of 151 metastases, only 83% reacted with HMB-45. All HMB-45-negative melanoma metastases were found to be positive for SM5-1. Whereas neither SM5-1 nor HMB-45 stained any of 84 specimens from non-melanocytic neoplasms, anti-S100 was positive in 21/84. Altogether SM5-1 has a sensitivity of 98%, HMB-45 of 93% and anti-S100 of 97% for primary and metastatic melanomas. SM5-1 stained 92,3%, A103 82,9% and T311 71,2% of 344 primary and metastatic melanomas. SM5-1 showed a stronger and more homogeneous reactivity as A103 und T311 in metastases (n = 243). All tested antibodies had a comparable staining intensity for primary melanomas (n = 101). The monoclonal antibody SM5-1 appears to have advantages for the immunhistochemical analysis of melanoma over currently available antibodies, especially for melanoma metastases. Therefore it is useful as a first line reagent in immunohistochemistry of melanoma. Further studies are needed to elucidate the exact nature of the antigen recognized by SM5-1.

Aufgrund ihres sehr hohen Metastasierungsrisikos weisen Patienten mit klarzelligem Nierenzellkarzinom (kzNZK) eine sehr hohe Sterblichkeit auf. Mit den zurzeit zur Verfügung stehenden klinischen Parametern kann der Krankheitsverlauf der Patienten nach der operativen Entfernung des Primärtumors nur unzureichend vorhergesagt werden. Um das Nachsorge- und Therapieregime der Patienten zu optimieren, muss die Vorhersagegenauigkeit der bestehenden Prognosemodelle durch molekulare Marker erhöht werden. Um geeignete Gene für eine Abschätzung von Metastasierungsrisiko und krankheitsfreiem Überleben (DFS) zu identifizieren, wurden genomweite Expressionsanalysen sowohl an Lungenmetastasen (n = 24) als auch an Primärtumoren (n = 24) des kzNZK vorgenommen. Durch Vergleich von Metastasensubgruppen, die sich nach unterschiedlich langen DFS entwickelt hatten bzw. Primärtumoren, die nach unterschiedlich langen DFS Metastasen bedingten, wurden tumorintrinsische DFS-assoziierte Expressionsmuster identifiziert. Weiterhin wurden Gene identifiziert, deren Expression sich zwischen Primärtumoren unterschied, die im Krankheitsverlauf manifeste Metastasen bedingten und solchen, die dies nicht taten. Die differenzielle Expression funktionell interessanter, teilweise auch in anderen publizierten Microarraystudien an kzNZK bestätigter Gene wurde im Folgenden mittels quantitativer Polymerasekettenreaktion (qPCR) validiert. Anschließend wurde die Assoziation ausgewählter Gene mit klinischen Parametern und dem Überleben der Patienten untersucht. Ein von klinischen Parametern unabhängiger Einfluss auf den Krankheitsverlauf der Patienten wurde dabei für EDNRB und PECAM1 auf Expressionsebene (qPCR; n = 86) sowie für TSPAN7 auf Proteinebene (Immunhistochemie an „Tissue Microarrays“; n = 106) belegt. EDNRB und PECAM1 waren signifikant höher exprimiert in Primärtumoren mit günstigen klinischen Parametern (TNMI/II, G1/2, V0, N0/M0). TSPAN7 war vorwiegend in den Gefäßen der primären kzNZK nachweisbar; eine signifikant höhere Zahl TSPAN7-positiver Gefäße war ebenfalls in Tumoren mit günstigen klinischen Parametern zu verzeichnen (pT1/2, TNMI/II, N0). Überlebensanalysen zeigten ein signifikant längeres DFS für Patienten mit einer hohen im Vergleich zu solchen mit einer geringen EDNRB-Expression und für Patienten, die in beiden untersuchten Gewebestanzen der „Tissue Microarrays“ TSPAN7-positive Gefäße aufwiesen im Vergleich zu Patienten mit nur einer oder keiner TSPAN7-gefäßpositiven Stanze. Für Patienten mit einer hohen im Vergleich zu solchen mit einer geringen EDNRB- bzw. PECAM1-Expression oder mit zwei im Vergleich zu keiner oder einer TSPAN7-gefäßpositiven Gewebestanze war zudem ein signifikant längeres tumorspezifisches Überleben (TSS) zu verzeichnen. Mit Hilfe multivariater Cox-Regressionsanalysen wurde eine unabhängige günstige prognostische Relevanz für EDNRB auf das DFS sowie für EDNRB, PECAM1 und TSPAN7 auf das TSS nachgewiesen. Somit sind diese molekularen Faktoren geeignet, um die Genauigkeit der bestehenden und ausschließlich auf klinischen Parametern basierenden Prognosemodelle zu erhöhen. Für eine Abschätzung von DFS und Metastasierungsrisiko erscheint dabei insbesondere EDNRB geeignet. / Patients with clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) have an extremely poor prognosis due to their high risk of metastases. Currently used clinico-patological parameters are insufficient for reliable prediction of metastatic risk and disease free survival (DFS) after surgical resection of the primary tumor. Molecular markers are strongly needed to improve outcome prediction, and thus to optimize the follow up and treatment schedule for patients with ccRCC. To identify genes which are suitable for the prediction of metastatic risk and DFS, genome-wide expression analyses were performed on pulmonary metastases (n = 24) and primary tumors (n = 24) obtained from patients with ccRCC. Tumor-intrinsic DFS-associated expression patterns were observed by comparing subgroups of metastases, which had developed within different DFS as well as primary tumors, which had caused metastases after different DFS. Furthermore, genes differentially expressed in primary tumors, which caused macroscopic metastases and tumors, which did not were identified. The differential expression of genes with a potential function in metastatic spread, which has in part been identified in independent published microarray studies as well, were validated by quantitative polymerase chain reaction (qPCR). Moreover, an independent prognostic impact on the survival of ccRCC patients was observed for the EDNRB und the PECAM1 gene expression (qPCR; n = 86) as well as for the TSPAN7 protein level (immunohistochemistry on tissue microarrays; n = 106). Primary tumors of patients with favourable clinico-pathological parameters (TNMI/II, G1/2, V0, N0/M0) showed a significantly higher EDNRB und PECAM1 gene expression than those with unfavorable parameters. TSPAN7 was predominantly detected in blood vessels of ccRCC tissues. In patients with favourable clinico-pathological parameters (pT1/2, TNMI/II, N0) a significantly higher number of TSPAN7-positive vessels was observed. Using survival analyses, a significantly longer DFS was observed for patients with a high compared to those with a low EDNRB expression as well as for patients with TSPAN7-positive vessels in both cores compared to no or one of the both cores investigated on tissue microarrays. A significantly longer TSS was observed for patients with a high EDNRB or PECAM1 expression as well as for patients with TSPAN7-positive vessles in both tissue cores investigated. Furthermore, EDNRB was an independent prognostic factor for the DFS of the patients; EDNRB, PECAM and TSPAN7 had an independent prognostic impact on the TSS. Therefore, these molecular markers are suitable to improve the accuracy of outcome prediction based on clinico-pathological parameters in ccRCC. For the prediction of DFS and metastatic risk EDNRB is particularly interesting.

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