Francisella tularensis est une bactérie intracellulaire à Gram négatif et l'un des agents les plus infectieux connu à l'heure actuelle, en particulier par voie respiratoire. L'inhalation d'une dizaine de bactéries suffit à provoquer une maladie mortelle : la tularémie pulmonaire. Sa facilité de dissémination par aérosols, ainsi que le caractère létal de cette pathologie, ont contribué à considérer F. tularensis comme une arme biologique potentielle. La tularémie pulmonaire est une infection aigue qui s'accompagne d'une réponse immunitaire inadaptée. F. tularensis infecte en premier lieu les cellules phagocytaires, notamment les macrophages. Alors que ces derniers sont des acteurs majeurs de la défense contre les agents infectieux, de nombreux mécanismes d'échappement permettent à F. tularensis d'éviter ou de résister aux réponses de l'hôte et ainsi de se multiplier et de disséminer dans l'organisme. Ainsi, après un retard initial dans la mise en place de la réponse immunitaire, la présence d'un grand nombre de bactéries et de signaux de danger libérés par les cellules infectées, conduisent au déclenchement d'une réponse inflammatoire excessive. Celle-ci se caractérise par une tempête cytokinique provoquant un recrutement massif de cellules immunitaires, en particulier de neutrophiles, dans les tissus infectés. Les dommages tissulaires associés à cette réponse inflammatoire sont en grande partie responsable de la mortalité associée aux infections pulmonaires par F. tularensis. La tularémie est actuellement traitée par antibiothérapie. Malheureusement, l'absence de symptômes spécifiques de cette maladie rend le diagnostic difficile et, par conséquent, retarde la prescription du traitement adapté. Or, l'efficacité des antibiotiques est considérablement réduite par cette administration tardive. De nouvelles stratégies thérapeutiques sont donc nécessaires pour remplacer ou compléter l'antibiothérapie. Dans ce contexte, nous avons cherché à déterminer si la modulation de la réponse inflammatoire excessive induite par F. tularensis pouvait être bénéfique pour l'hôte infecté et ainsi être utilisée comme thérapie accessoire. L'objectif de mon travail de thèse était d'évaluer les propriétés anti-inflammatoires et le potentiel bénéfice thérapeutique du mannodendrimère 3T (M3T), un composé synthétisé par l'équipe de J. Nigou, dans un modèle murin d'infection pulmonaire par F. tularensis. Le M3T, conçu pour mimer les propriétés anti-inflammatoires d'un glycolipide de la paroi de Mycobacterium tuberculosis, a précédemment montré un effet inhibiteur sur la production de cytokines pro-inflammatoires et le recrutement de neutrophiles dans un modèle murin d'inflammation pulmonaire aigue induite par le LPS. La souche F. novicida, provoquant chez la souris une pathologie similaire à une infection pulmonaire par F. tularensis, a été utilisée comme souche de substitution dans ces travaux. In vitro, nous avons montré que le M3T inhibe la production de cytokines pro-inflammatoires induite par F. novicida dans des macrophages et cellules dendritiques humaines. D'un point de vue mécanistique, l'ensemble des données suggère que le M3T inhibe la réponse inflammatoire induite par F. novicida via le récepteur TLR2, en activant une voie de signalisation dépendante du récepteur DC-SIGN. In vivo, le M3T a été administré par injection intraveineuse 6 h post-infection, puis quotidiennement pendant 3 jours, en combinaison avec un traitement antibiotique sous-optimal. / Francisella tularensis is an intracellular Gram negative bacterium and the causative agent of tularemia. It is one of the most infectious agents known to date. Infection by the respiratory route leads to the deadly pulmonary form of tularemia. For these reasons, F. tularensis has been considered for years as a potential biological weapon. Pulmonary tularemia is characterized by an acute infection and a defect in immune responses. Particularly, the innate immune system plays a central role in F. tularensis infection and pathology. Macrophages, key cells of the innate immune system, are the main target for F. tularensis. This bacterium has evolved many strategies to escape host defenses that allow it to replicate within the cells and then disseminate into the whole organism. At this systemic stage, bacteria, along with alarm signals from infected cells, are recognized by innate immune receptors, triggering an inappropriate inflammatory response. The latter is characterized by a cytokine storm leading to a massive recruitment of immune cells, particularly neutrophils, in infected tissue. Tissue damages caused by this inflammation are a major cause of mortality associated with F. tularensis infections. Today, the treatment of tularemia is based on antibiotherapy. However, no specific symptoms can be assigned to pulmonary tularemia making its diagnosis difficult. This delays the administration of an appropriate antibiotiotherapy whose efficacy is therefore decreased. Thus, new therapeutic strategies are needed to replace or complement antibiotics. In this context, we investigated whether reducing the excessive inflammation induced by F. tularensis could be beneficial for the host and be considered as an adjunctive host- directed therapy. The aim of my work was to evaluate the anti-inflammatory properties and the therapeutic potential of mannodendrimer 3T (M3T), a synthetic coumpond designed in the team, in a mouse model of pulmonary infection by F. tularensis. M3T was previously designed to mimic the anti-inflammatory traits of a specific glycolipid from Mycobacterium tuberculosis. It was previously shown to inhibit the production of pro-inflammatory cytokines and neutrophils recruitment in a mouse model of LPS-induced pulmonary inflammation. Here, we used F. novicida as a surrogate for F. tularensis since it induces an identical inflammatory pathology. In vitro, M3T was found to inhibit the production of pro-inflammatory cytokines in human macrophages and dendritic cells infected by F. novicida. M3T modulates inflammatory response triggered by F. novicida via TLR2 most likely by the activation of a DC-SIGN-dependant pathway. In vivo, M3T was administered 6 h post-infection and then, daily for 3 days, by intraveinous injection and combined with a suboptimal antibiotic. This combination increases the survival rate of mice infected with F. novicida as compared to mice treated with antibiotic alone. M3T treatment has no impact on bacterial burden but seems to reduce tissue damages as observed by histological analyses of lungs, liver and spleen of infected mice. Altogether, our data demonstrate that M3T administration provides a therapeutic benefit in a mouse model of pulmonary infection by F. novicida. On a more general perspective our results suggest that targeting inflammation can be considered as an adjunctive treatment in acute pulmonary infections.

Heme oxygenase (HO) is an enzyme that facilitates the oxidative breakdown of free heme into equi-molar concentrations of carbon monoxide (CO), the bile pigment biliverdin IX and free iron. These products have immuno-modulatory and antioxidative properties, which may be useful in the treatment of diseases characterised by low-grade inflammation and oxidative stress, such as insulin resistance and hyperglycaemia in type 2 diabetes. In fact, HO-1 protein levels and carbon monoxide generation are down-regulated in murine models of obesity and type 2 diabetes. Two independent research teams have reported that pharmacological induction of HO activity by protoporphyrin-based compounds, such as hemin and cobalt (III) protoporphyrin IX chloride (CoPP), exerts anti-diabetic effects, including protection from weight gain, systemic inflammation and peripheral insulin resistance, in various experimental models of type 2 diabetes. However, the relative insolubility and instability of hemin in solution and the multiple side-effects of CoPP, including weight loss, preclude their use for the treatment of patients in clinic. Heme arginate (HA) is a stable and soluble composition of hemin and L-arginine (LA) in a solution containing propylene glycol, ethanol and water. Furthermore, HA is licensed for the treatment of acute porphyria in several European countries. Therefore, HA may potentially be used in clinical trials. The current PhD thesis tests the hypothesis that the heme component of HA ameliorates hyperglycaemia via induction of HO activity in the leptin receptor deficient db/db (db/db) mouse model of type 2 diabetes. A preliminary in vivo study demonstrates that the heme but not the LA component of HA exerts an anti-hyperglycaemic effect in db/db mice. In a separate in vivo study, concomitant treatment of HA with stannous (IV) mesoporphyrin IX dichloride (SM), an inhibitor of HO activity, further improves the glycaemic control despite complete abrogation of the HA-mediated increase in HO activity in db/db mice. This result is in contrast to the above stated hypothesis, and demonstrates that the antihyperglycaemic effect of HA is due to a HO activity independent mechanism. Furthermore, the ameliorative effect of HA and HA+SM treatment on hyperglycaemia in db/db mice coincides with a gain in body and visceral fat weight, a reduction in islet β-cell inflammation and the preservation of islet β-cell function. Subsequent in vitro experiments demonstrate that HA exerts anti-inflammatory effects by a HO activity independent mechanism in pro-inflammatory in vitro models such as in cytokine mix-stimulated MIN6 β-cells and in classically activated bone marrow derived macrophages (BMDMs). In conclusion, the current thesis demonstrates the novel finding that the heme component of HA can exert anti-inflammatory and anti-diabetic effects via a HO activity independent mechanism. Future work should focus on studies to test the hypothesis that the interaction of heme with the nuclear receptor Rev-erb-α is responsible for the anti-inflammatory and anti-diabetic effects of HA.

Depuis quelques années, les probiotiques sont devenus un front de science très actif. La majorité des bactéries probiotiques actuellement sur le marché sont des bactéries lactiques. L’identification de nouvelles souches bactériennes aux propriétés probiotiques est l’objectif principal de ces travaux de thèse, et s’inscrivent dans le cadre du projet Probiotique en partenariat avec deux groupes industriels et le pôle de compétitivité VITAGORA. / In recent years, probiotics market is boosting. Most probiotic bacteria on the market today are lactic acid bacteria. The identification of novel bacterial strains with probiotic properties is the main objective of this thesis, which is part of the Probiotic project in partnership with two industry groups and the network innovation VITAGORA.

Crohn’s disease is a chronic inflammatory bowel disease with unknown origin. This study investigates the combined use of surgery and immuno modulation in Crohn’s disease. The outcome of medication and surgery in 371 operations on 237 patients between 1989 and 2006 were evaluated. Moreover the effects of prednisolone, azathioprine and infliximab on the healing of colo-colonic anastomosis in 84 mice with or without colitis were evaluated. The use of thiopurines after abdominal surgery in selected cases of severe Crohn’s disease was found to prolong the time to clinical relapse of the disease from 24 to 53 months. Patients on postoperative maintenance therapy with azathioprine had a decreased symptomatic load over time and needed fewer steroid courses. The use of thiopurines was found to be a risk factor of anastomotic complications in abdominal surgery for Crohn’s disease together with pre-operative intra-abdominal sepsis and colo-colonic anastomosis. The risk for anastomotic complications increased from 4 % in those without any of these risk factors to 13 % in those with any one and 24 % if two or three risk factors were present. In patients with two or more of these, or previously established, risk factors prior to surgery one should consider refraining from anastomosis or doing a proximal diverting stoma. Another possibility is to use a split stoma in which both ends of a future delayed anastomosis are brought out in the same ostomy hole of the abdominal wall. This method was found to significantly decrease the number of risk factors prior to the actual anastomosis as well as decreasing the risk of anastomotic complications, without increasing the number of operations or the time spent in hospital. In the animal model all three medications had an ameliorating effect on the colitis compared with placebo. Only prednisolone was found to interfere with the healing of the colo-colonic anastomoses with significantly decreased bursting pressure compared with placebo as well as azathioprine and infliximab. The association between azathioprine therapy and anastomotic complications may be due to a subgroup of patients with a more severe form of the disease who have an increased risk of such complications and also are more prone to receive intense pharmacological therapy. / Crohns sjukdom är en kronisk inflammatorisk tarmsjukdom av oklar orsak. Huvudsyftet med denna avhandling var att undersöka den kombinerade behandlingen med kirurgi och immunhämmare vid Crohns sjukdom. Utfallet av medicinsk och kirurgisk behandling vid 371 operationer på 237 patienter mellan 1989 och 2006 utvärderades. Därutöver studerades effekterna av kortison, immunhämmare och behandling med inflammationsdämpande antikroppar på läkning av tjocktarms-skarv på 84 möss med eller utan inflammation i tarmen. Vid utvalda fall med svårare form av Crohns sjukdom visade sig förebyggande behandling med immunhämmare efter kirurgi förlänga tiden till återfall av symptom från 24 till 53 månader. Patienter med immunhämmare som underhållsbehandling hade också minskade symptom under uppföljningstiden med ett minskat behov av kortison. Immunhämmande behandling inför kirurgi visade sig, liksom pågående infektion i bukhålan och sydd skarv på tjocktarmen, vara en riskfaktor för att drabbas av komplikationer vid bukkirurgi på grund av Crohns sjukdom. Risken för infektionskomplikationer i bukhålan ökade från 4 % hos dem utan någon av dessa riskfaktorer till 13 % hos dem med någon och 24 % hos dem med två eller tre riskfaktorer inför operationen. Hos patienter med två eller fler kända riskfaktorer bör man överväga att avstå från att sy en skarv på tarmen vid kirurgi eller möjligen skydda skarven med en avlastande stomi. Ett alternativ till detta är att anlägga en delad stomi där bägge ändarna av den framtida skarven tas ut genom en och samma stomiöppning i bukväggen. Denna metod med en fördröjd skarv på tarmen visade sig minska antalet kirurgiska riskfaktorer inför själva skarvningen och dessutom minska risken för tidiga infektiösa komplikationer i bukhålan, utan att vare sig öka antalet kirurgiska ingrepp eller förlänga vårdtiden på sjukhus. I en djurmodell visade sig alla tre läkemedlen ha en lindrande effekt på tarminflammation jämfört med placebo. Endast kortison visade sig påverka läkningen negativt med en sänkning av bristningstrycket i den sydda skarven på tjocktarmen, jämfört med placebo såväl som med immunhämmare och antikropps-behandling. Kopplingen mellan immunhämmare och komplikationer efter sydda skarvar på tarmen behöver alltså inte vara en direkt läkemedelseffekt. Orsaken kan istället vara att en undergrupp av Crohnpatienter har en svårare sjukdomsform som ger både ökad komplikationsrisk och större behov av intensiv medicinsk behandling.

Depuis plus d’un siècle, l’œil est décrit comme un site immuno-privilégié : les réponses immunitaires sont fortement contrôlées localement et un mécanisme de déviation immunitaire peut être induit en périphérie après injection d’antigènes en chambre antérieure (ACAID, Anterior Chamber-Associated Immune Deviation). Mieux caractériser le statut immunitaire de l’œil, et en particulier de la rétine, est devenu un enjeu majeur à l’heure actuel au vu des nombreuses approches thérapeutiques innovantes pour le traitement de pathologies rétiniennes. L’objectif de mon travail de thèse a été d’étudier l’impact immunitaire périphérique d’une injection sous-rétinienne, tout d’abord dans un contexte antigénique simple, puis dans le cadre d’un transfert de gène par virus adéno-associé recombinant. En utilisant un modèle murin, j’ai pu démontrer que l’injection sous-rétinienne de peptides induit une inhibition des réponses lymphocytaires Th1/Tc1, Th2/Tc2, Th17/Tc17 en périphérie, de manière similaire à l’ACAID. Néanmoins, ce privilège immunitaire de la zone sous-rétinienne présente ses limites puisque l’injection sous-rétinienne de fortes doses d’AAV8 induit une réponse anti-transgène pro-inflammatoire en périphérie, accompagnée d’une altération locale de la structure rétinienne. Ce travail de thèse ouvre par ailleurs des voies de recherche quant à des approches d’immuno-modulation spécifiques. A terme, ces résultats devraient permettre d’optimiser l’immuno-monitorage des patients dans les essais cliniques. / For over a century, the eye has been described as an immune privileged site : immune responses are tighly controlled locally and an immune deviation mechanism is induced in periphery after the injtection of antigens in the anterior chamber (ACAID, Anterior Chamber-Associated Immune Deviation). A better comprehension of the immune status of the eye, especially the retina, has become a major concern regarding emerging and innovative therapeutic approaches to treat retinal pathologies. The aim of my work was to study the peripheral immune consequences of a subretinal injection, first in an simple antigenic context, and second in the context of adeno-associated virus-mediated gene transfer. In a murine model, I have shown that the subretinal injection of peptides induces an inhbition of Th1/Tc1, Th2/Tc2, Th17/Tc17 immune responses, similarly to ACAID. However, such an immune privilege has its limits. Indeed, the subretinal injection of high doses of AAV8 induces a pro-inflammatory anti-transgene immune response, along with a local alteration of the retinal structure. This work also provides new leads for specific approaches of immune modulation. On the long term, these results should provide new insights in optimizing the immuno-monitoring of patients enrolled in clinical trials.

Les bénéfices attribués aux probiotiques sont nombreux : effets bénéfiques sur le microbiote intestinal, confort digestif, modulation du système immunitaire et prévention des infections intestinales. Ces effets divers et variés sont souches-spécifiques. Actuellement, de nombreuses études visent à mieux caractériser ces effets probiotiques.Ces travaux avaient pour objectif de déterminer et d’analyser les effets probiotiques de trois souches de la collection Danone : la souche de Lactobacillus paracasei CNCM I-3689, la souche de L. rhamnosus CNCM I-3690 ainsi que la souche de Bifidobacterium animalis subps. lactis CNCM I-2494. Dans un premier temps, leurs effets ont été caractérisés dans des modèles in vitro pour des propriétés anti-pathogènes, des propriétés d’immuno-modulation ainsi que pour des propriétés de protection de la barrière épithéliale intestinale. Dans un second temps, leurs effets de la protection de la barrière ont été confirmés dans un modèle murin de faible inflammation.Une analyse des mécanismes sous-jacents à ces effets à la fois chez la souche probiotique et chez l’hôte a été initiée par la construction et l’analyse fonctionnelle de banques génomiques bactériennes ainsi que par l’étude de la modulation des gènes impliqués dans le maintien de la barrière intestinale chez l’hôte. / Health benefits of probiotic bacteria are numerous: beneficial effects on the intestinal microbiota, digestive comfort, modulation of the immune system and prevention of winter infection. These diverse and various effects are strain-specific. Nowadays, numerous studies aim at better characterizing those probiotics effects.This project aimed at identifying and analyzing the probiotic effects of three strains from Danone collection: Lactobacillus paracasei CNCM I-3689, L. rhamnosus CNCM I-3690 and Bifidobacterium animalis subsp. lactis CNCM I-2494. First, their effects were assessed in in vitro models for immunomodulation properties, antipathogens activity and intestinal barrier protection. Secondly, their beneficial effects were confirmed in low-grade inflammation murine model.The analysis of the underlying mechanisms has been initiated both in the bacterial strains by the construction and the functional analysis of genomic libraries and in the host by measuring the modulation of the genes involved in the intestinal barrier maintain.

L’activité anti-tumorale des cellules NK est régulée par des récepteurs de surface activateurs et inhibiteurs qui reconnaissent des ligands exprimés par les cellules cibles. Afin d’augmenter le potentiel cytotoxique des cellules NK face à des cellules cancéreuses autologues, Innate Pharma a développé des Ac bloquant les interactions entre certains récepteurs inhibiteurs de la cellule NK, les KIRs, et leurs ligands, des molécules du CMH de classe I.Dans un premier temps, nous avons mis en place un modèle tumoral d’efficacité des Ac anti-KIR dans des souris transgéniques pour l’expression d’un KIR. Ce modèle nous a permis de démontrer l’efficacité thérapeutique anti-tumorale du blocage des interactions entre les KIRs exprimés par les cellules NK et les molécules HLA exprimées par la tumeur. Ce modèle nous a également permis de tester la combinaison de l’Ac anti-KIR avec un Ac thérapeutique utilisé dans le traitement des lymphomes B non-hodgkiniens, rituximab. Utilisé en combinaison, ces deux Ac augmentent significativement la survie de souris greffées avec une lignée tumorale d’origine B humaine par rapport à chacun des deux traitements seuls.Ces données précliniques nous amènent à proposer une stratégie thérapeutique pour le traitement de tumeurs hématologiques, basée sur la combinaison d’un Ac anti-KIR avec un Ac induisant de l’ADCC afin de potentialiser la réponse anti-tumorale des cellules NK. / NK cell anti-tumoral activity is regulated by inhibitory and activating receptors interacting with target cell ligands. Innate Pharma has developed anti-KIR Abs (IPH2101 and lirilumab), directed against inhibitory NK cell receptors interacting with HLA molecules, in order to increase NK cell activity against autologous tumor cells.We have set up a preclinical model to assess anti-KIR anti-tumoral efficacy in transgenic mice expressing a KIR receptor. With this model, we have also shown the therapeutic benefit of combining lirilumab with rituximab, a therapeutic Ab mediating ADCC.These results support the rationale of combining anti-KIR Ab with Ab mediating ADCC as a therapeutic strategy for hematological malignancies.

Numerous studies have focused on identifying novel probiotic-based treatment options for immune homeostasis maintenance and favorable modulation of the gut microbiota which acts as a key regulator of the gut-brain axis. Recently, probiotics interventions are gaining interest as effective approaches to treat neuropsychiatric disorders through the gut-brain axis. However, there is limiting knowledge about probiotics' effects during puberty on the developing brain and immune responses. Probiotic intake could offer a strategy to counteract the immune, microbial and behavioral disturbances induced by inflammatory LPS. Thus, we hypothesized that the intake of a novel probiotic bacterium Rouxiella badensis subsp. acadiensis would modulate the immune response and that pubertal administration could mitigate LPS- induced inflammation and prevent enduring behavioral changes later in life. We investigated the interaction of the probiotic with the intestinal mucosa and its ability of modulating the gut mucosal immunity (Article 1). Next, we examined the ability of pubertal treatment with R. badensis subsp. acadiensis to alleviate LPS-induced anxiety-like and depression-like behaviors in adult male and female mice and to affect the expression of 5HT1A receptors in specific brain areas of adult mice (Article 2). We finally studied the ability of R. badensis subsp. acadiensis treatment during puberty to mitigate the effects of LPS on the immune system and on the gut microbiome composition (Article 3). These studies have demonstrated the ability of R. badensis subsp. acadiensis to survive the gastrointestinal conditions, interact with the gut epithelium and modulate the intestinal homeostasis. Pubertal use of the bacterium was associated with sex-specific effects on the acute immune response, microbiome structure, enduring neurobehavioral outcomes and the expression of 5HT1A receptors in specific brain areas, later in life. This dissertation emphasizes on the importance of puberty as a window of opportunities during which probiotic use can alleviate the long-term neural, behavioral, immunological and microbiome alterations induced by stress.