Afin de mieux comprendre l’évolution des fonctions du récepteur EphA4 pendant le développement du système nerveux central (SNC), nous avons étudié sa localisation cellulaire et subcellulaire dans l’hippocampe du rat, d’abord chez l’adulte, puis pendant le développement postnatal, ainsi que ses rôles potentiels dans la genèse, la migration ou la maturation des cellules granulaires dans l’hippocampe adulte. Pour ce faire, nous avons utilisé la méthode d’immunocytochimie en microscopie photonique, électronique et confocale. En microscopie photonique, une forte immunoréactivité (peroxydase/DAB) pour EphA4 est observée aux jours 1 et 7 suivant la naissance (P1 et P7) dans les couches de corps cellulaires, avec un marquage notamment associé à la surface des corps cellulaires des cellules granulaires et pyramidales, ainsi que dans les couches de neuropile du gyrus dentelé et des secteurs CA3 et CA1. L’intensité du marquage diminue progressivement dans les couches de corps cellulaires, entre P7 et P14, pour devenir faible à P21 et chez l’adulte, tandis qu’elle persiste dans les couches de neuropile, sauf celles qui reçoivent des afférences du cortex entorhinal. En microscopie électronique, après marquage à la peroxydase/DAB, EphA4 décore toute la surface des cellules pyramidales et granulaires, du corps cellulaire jusqu’aux extrémités distales, entre P1 et P14, pour devenir confiné aux extrémités synaptiques, c’est-à-dire les terminaisons axonales et les épines dendritiques, à P21 et chez l’adulte. À la membrane plasmique des astrocytes, EphA4 est redistribué comme dans les neurones, marquant le corps cellulaire et ses prolongements proximaux à distaux, à P1 et P7, pour devenir restreint aux prolongements périsynaptiques distaux, à partir de P14. D’autre part, des axones en cours de myélinisation présentent souvent une forte immunoréactivité punctiforme à leur membrane plasmique, à P14 et P21. En outre, dans les neurones et les astrocytes, le réticulum endoplasmique, l’appareil de Golgi et les vésicules de transport, organelles impliquées dans la synthèse, la modification posttraductionnelle et le transport des protéines glycosylées, sont aussi marqués, et plus intensément chez les jeunes animaux. Enfin, EphA4 est aussi localisé dans le corps cellulaire et les dendrites des cellules granulaires générées chez l’adulte, au stade de maturation où elles expriment la doublecortine (DCX). De plus, des souris adultes knockouts pour EphA4 présentent des cellules granulaires DCX-positives ectopiques, c’est-à-dire positionnées en dehors de la zone sous-granulaire, ce qui suggère un rôle d’EphA4 dans la régulation de leur migration. Ces travaux révèlent ainsi une redistribution d’EphA4 dans les cellules neuronales et gliales en maturation, suivant les sites cellulaires où un remodelage morphologique s’effectue : les corps cellulaires lorsqu’ils s’organisent en couches, les prolongements dendritiques et axonaux pendant leur croissance, guidage et maturation, puis les épines dendritiques, les terminaisons axonales et les prolongements astrocytaires distaux associés aux synapses excitatrices, jusque chez l’adulte, où la formation de nouvelles synapses et le renforcement des connexions synaptiques existantes sont exercés. Ces localisations pourraient ainsi correspondre à différents rôles d’EphA4, par lesquels il contribuerait à la régulation des capacités plastiques du SNC, selon le stade développemental, la région, l’état de santé, ou l’expérience comportementale de l’animal. / To gain more insight into the various functions of EphA4 receptor during the development of the central nervous system (CNS), we have characterized its cellular and subcellular localization in the rat hippocampus, first in the adult, and second during the postnatal development. We have also examined its potential roles in the genesis, migration, or maturation of the granule cells in the adult hippocampus. For that purpose, we have used immunocytochemistry in light, electron, and confocal microscopy. At the light microsocpic level, a strong EphA4 immunoreactivity (peroxidase/DAB) is observed at postnatal days 1 and 7 (P1 and P7) in the cell body layers, with a labeling notably associated with the surface of pyramidal and granule cell bodies, as well as in the neuropil layers of CA3, CA1, and dentate gyrus regions. The intensity of the labeling diminishes progressively in the cell body layers, between P7 and P14, to become weak at P21 and in the adult, while it persists in the neuropil layers, except in those receiving inputs from the entorhinal cortex. At the electron microscopic level, after peroxidase/DAB labeling, EphA4 covers the entire surface of pyramidal and granule cells, from the cell body to the distal extremities, between P1 and P14, but becomes restricted to the synaptic extremities, i.e. the axon terminals and dendritic spines, at P21 and in the adult. At the plasma membrane of astrocytes, EphA4 is redistributed as in neurons, from the cell body and proximal to distal processes, at P1 and P7, to the distal perisynaptic processes, at P14 and older ages. In addition, axons in the process of myelination present strong punctiform immunoreactivity at their plasma membrane, at P14 and P21. Moreover, in neurons and astrocytes, the endoplamic reticulum, Golgi apparatus, and transport vesicles, organelles involved in the synthesis, post-translational modifications, and transport of glycosylated proteins, are also labeled, and also more intensely in younger animals. Lastly, EphA4 is located in the cell body and dendrites of adult-generated granule cells, at the stage of maturation where they express doublecortin (DCX). In addition, EphA4 adult knockout mice display DCX-positive granule cells in an ectopic position, outside of the subgranular zone, suggesting a role for EphA4 in the regulation of their migration. This work thus reveals a redistribution of EphA4 in neuronal and glial cells, in the cellular sites where cellular motility occurs during their maturation: the cell bodies when they position and organize themselves into layers, the dendritic and axonal processes during their growth, guidance, and maturation, and the dendritic spines, axon terminals, and distal astrocytic processes when synapses are formed or strengthened. These locations could thus reflect different roles for EphA4, similarly associated with the regulation of plasticity in the CNS, according to the stage of development, the region, the CNS integrity, or the behavioural experience of an animal.

EphA7 est un membre de la famille des récepteurs à tyrosine kinase Eph, qui régulent l’adhérence et la motilité cellulaires. EphA7 est hautement conservé chez les vertébrés et largement exprimé durant l'embryogenèse, en particulier pendant le développement du SNC. Dans le cerveau adulte, EphA7 est transcrit principalement dans l'hippocampe, avec de faibles niveaux d'expression ailleurs. Nous avons cartographié sa distribution dans le cerveau du rat et de la souris adultes, par hybridation in situ et immunohistochimie en microscopie photonique et électronique. Les deux méthodes montrent une distribution de marquage très cohérente. Le signal le plus fort a été observé dans l’hippocampe, avec des niveaux moins élevés dans l’habénula, le striatum, l’amygdale, les cortex cingulaire, piriforme et entorhinal, ainsi que le cervelet. Au niveau ultrastructural, dans l’hippocampe, l’immunoréactivité d’EphA7 a été localisée dans le cytoplasme des cellules granulaires (gyrus dentelé) et pyramidales (CA1 et CA3) en ordre décroissant d’intensité. Dans le neuropile de CA1, des épines dendritiques et des prolongements astrocytaires, souvent périsynaptiques, ont été les éléments le plus fréquemment marqués. Plus rarement, nous avons aussi rencontré des dendrites et des terminaisons axonales immunopositives. La localisation préférentielle d’EphA7 dans les épines dendritiques et les prolongements astrocytaires périsynaptiques est conséquente avec un rôle de ce récepteur dans la plasticité synaptique / Abstract: EphA7 is a member of the family of Eph receptor tyrosine kinases, which regulate cell adhesion and motility. EphA7 is highly conserved in vertebrates and widely expressed during embryogenesis, especially during the development of the CNS. In the adult brain, EphA7 is transcribed mainly in the hippocampus, with low expression levels elsewhere. We have mapped its distribution in the adult brain of rat and mice by in situ hybridization and by immunohistochemistry in light and electron microscopy. Both methods show very consistent labelling distribution. The strongest signal was observed in the hippocampus, but modest levels were detected in the habenula, striatum, amygdala, the cingulate, piriform and entorhinal cortex, and the cerebellum. At the ultrastructural level, in the hippocampus, EphA7 immunoreactivity was localized in the cytoplasm of granule (dentate gyrus) and pyramidal cells (CA1 and CA3) in descending order of intensity. In the neuropil of CA1, dendritic spines and astrocytic processes, often perisynaptic were the most frequently labelled. More rarely, we also observed immunopositive dendrites and axon terminals. The preferential localization of EphA7 in dendritic spines and perisynaptic astrocytic processes is consistent with a role of this receptor in synaptic plasticity / Bourse de maîtrise du Groupe de recherche sur le système nerveux central GRSNC, (2009,2010) Bourse d’études supérieures du Canada Frederick Banting et Charles Best, IRSC Instituts de recherche en santé du Canada, (2011)

Proteins are the actual actors in the (normal or disrupted) physiological processes and immunohistochemistry (IHC) is a very efficient mean of visualizing and locating protein expression in tissue samples. By comparing pathologic and normal tissue, IHC is thus able to evidence protein expression alterations. This is the reason why IHC plays a grow- ing role to evidence tissue-based biomarkers in clinical pathology for diagnosing var- ious diseases and directing personalized therapy. Therefore, IHC biomarker evaluation significantly impacts the adequacy of the therapeutic choices for patients with serious pathologies, such as cancer. However, this evaluation may be time-consuming and dif- ficult to apply in practice due to the absence of precise positive cut-off values as well as staining (i.e. protein expression) heterogeneity intra- and inter-samples. Quantifying IHC staining patterns has thus become a crucial need in histopathology. For this task, automated image analysis has multiple advantages, such as avoiding the evidenced ef- fects of human subjectivity. The recent introduction of whole-slide scanners opened a wide range of possibilities for addressing challenging image analysis problems, includ- ing the identification of tissue-based biomarkers. Whole-slide scanners are devices that are able to image whole tissue slides at resolutions up to 0.1 micrometers per pixels, often referred to as virtual slides. In addition to quantification of IHC staining patterns, virtual slides are invaluable tools for the implementation of digital pathology work- flows. The present work aims to make several contributions towards this current digital shift in pathology. Our first contribution was to propose an automated virtual slide sharpness assessment tool. Although modern whole-slide scanner devices resolve most image standardization problems, focusing errors are still likely to be observed, requiring a sharpness assessment procedure. Our proposed tool will ensure that images provided to subsequent pathologist examination and image analysis are correctly focused. Virtual slides also enable the characterization of biomarker expression heterogeneity. Our sec- ond contribution was to propose a method to characterize the distribution of densely stained regions in the case of nuclear IHC biomarkers, with a focus on the identification of highly proliferative tumor regions by analyzing Ki67-stained tissue slides. Finally, as a third contribution, we propose an efficient mean to register virtual slides in order to characterize biomarker colocalization on adjacent tissue slides. This latter contribution opens new prospects for the analysis of more complex questions at the tissue level and for finely characterizing disease processes and/or treatment responses./Les protéines sont les véritables acteurs des processus physiologiques (normaux ou per- turbés) et l’immunohistochimie (IHC) est un moyen efficace pour visualiser et localiser leur expression au sein d’échantillons histologiques. En comparant des échantillons de tissus pathologiques et normaux, l’IHC permet de révéler des altérations dans des pro- fils d’expression protéique. C’est pourquoi l’IHC joue un rôle de plus en plus important pour mettre en évidence des biomarqueurs histologiques intervenant dans le diagnos- tic de diverses pathologies et dans le choix de thérapies personnalisées. L’évaluation de l’expression de biomarqueurs révélés par IHC a donc des répercussions importantes sur l’adéquation des choix thérapeutiques pour les patients souffrant de pathologies graves, comme le cancer. Cependant, cette évaluation peut être chronophage et difficile à appliquer en pratique, d’une part, à cause de l’hétérogénéité de l’expression protéique intra- et inter-échantillon, d’autre part, du fait de l’absence de critères de positivité bien définis. Il est donc devenu crucial de quantifier les profils d’expression de marquages IHC en histopathologie. A cette fin, l’analyse d’image automatisée possède de multiples avantages, comme celui d’éviter les effets de la subjectivité humaine, déjà démontrés par ailleurs. L’apparition récente des numériseurs de lames histologiques complètes, ou scanners de lames, a permis l’émergence d’un large éventail de possibilités pour traiter des problèmes d’analyse d’image difficiles menant à l’identification de biomar- queurs histologiques. Les scanners de lames sont des dispositifs capables de numériser des lames histologiques à une résolution pouvant atteindre 0,1 micromètre par pixel, expliquant la dénomination de "lames virtuelles" des images ainsi acquises. En plus de permettre la quantification des marquages IHC, les lames virtuelles sont des outils indis- pensables pour la mise en place d’un flux de travail numérique en pathologie. Le travail présenté ici vise à fournir plusieurs contributions au récent changement de cap vers une numérisation de la discipline médicale qu’est l’anatomie pathologique. Notre première contribution consiste en un outil permettant d’évaluer automatiquement la netteté des lames virtuelles. En effet, bien que les scanners de lames résolvent la plupart des pro- blèmes liés à la standardisation de l’acquisition, les erreurs de focus restent fréquentes, ce qui nécessite la mise en place d’une procédure de vérification de la netteté. L’outil que nous proposons assurera la netteté des images fournies à l’examen du pathologiste et à l’analyse d’image. Les lames virtuelles permettent aussi de caractériser l’hétérogénéité de l’expression de biomarqueurs. Ainsi, la deuxième contribution de ce travail repose sur une méthode permettant de caractériser la distribution de régions densément marquées par des biomarqueurs IHC nucléaires. Pour ce travail, nous nous sommes concentrés sur l’identification de régions tumorales présentant une forte activité proliférative en analysant des lames virtuelles révélant l’expression de la protéine Ki67. Finalement, la troisième contribution de ce travail fut de proposer un moyen efficace de recaler des lames virtuelles dans le but de caractériser la colocalisation de biomarqueurs IHC révé- lés sur des coupes de tissu adjacentes. Cette dernière contribution ouvre de nouvelles perspectives pour l’analyse de questions complexes au niveau histologique ainsi que la caractérisation fine de processus pathologiques et de réponses thérapeutiques. / Doctorat en Sciences de l'ingénieur / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La récente remise en question de l'usage de la thérapie hormonale de substitution, dû au risque accru de cancer du sein et de maladie coronarienne, renforce l'intérêt de l'utilisation des modulateurs spécifiques du récepteur des estrogènes (« SERMs »), composés dont l'action antiestrogénique tissu-spécifique peut protéger le sein et l'utérus alors que la composante estrogénique peut prévenir l'ostéoporose. D'autre part, on observe actuellement un intérêt grandissant pour le remplacement des androgènes, suite à l'observation de séquelles physiques et psychologiques imputables au déficit androgénique chez un certain nombre de femmes ménopausées, et de-là pour le remplacement de la DHEA, dont les niveaux très diminués à la ménopause mènent à la réduction des androgènes produits par conversion intracrine périphérique, cette diminution contribuant pour une bonne partie au déficit androgénique de la ménopause. Nos études histomorphologiques et immunohistochimiques examinant les effets de la combinaison d'un SERM à activité antiestrogénique pure, l'Acolbifène, avec l'estradiol, chez un modèle animal de déprivation hormonale complète, soit la rate ovariectomisée, ont confirmé l'efficacité de l'action antiestrogénique au niveau mammaire et utérin, s'ajoutant à l'action combinée bénéfique au niveau de la densité osseuse et du cholestérol et, possiblement, à l'action estrogénique bénéfique de l'estradiol au niveau du cerveau. Avec la même approche, nous avons étudié les effets de l'administration de la DHEA à dose pharmacologique en application topique à long terme sur la peau de la rate OVX au niveau de deux organes affectés en ménopause, soit la peau elle-même et le vagin. Ces travaux ont démontré que la DHEA exerce plusieurs effets bénéfiques, principalement androgéniques, au niveau des différentes couches tissulaires chez les deux organes étudiés. Finalement, par la mise au point d'une formulation permettant d'appliquer la DHEA en intravaginal, nous avons démontré la faisabilité de l'application locale de doses physiologiques de DHEA pouvant renverser l'atrophie vaginale induite par l'ovariectomie chez la rate, et ce, avec peu ou pas d'effets systémiques.

Une sous-population des neurones à dopamine (DA) du mésencéphale ventral du rat et de la souris étant connue pour exprimer l'ARN messager du transporteur vésiculaire 2 du glutamate (VGLUT2), nous avons eu recours à l'immunocytochimie en microscopie électronique, après simple ou double marquage de l'enzyme de synthèse tyrosine hydroxylase (TH) et de VGLUT2, pour déterminer la présence de l'une et/ou l'autre protéine dans les terminaisons (varicosités) axonales de ces neurones et caractériser leur morphologie ultrastructurale dans diverses conditions expérimentales. Dans un premier temps, des rats jeunes (P15) ou adultes (P90), ainsi que des rats des deux âges soumis à l'administration intraventriculaire cérébrale de la cytotoxine 6-hydroxydopamine (6-OHDA) dans les jours suivant la naissance, ont été examinés, afin d'étayer l'hypothèse d'un rôle de VGLUT2 au sein des neurones DA, au cours du développement normal ou pathologique de ces neurones. Chez le jeune rat, ces études ont montré: i) la présence de VGLUT2 dans une fraction importante des varicosités axonales TH immunoréactives du coeur du noyau accumbens ainsi que du néostriatum; ii) une augmentation de la proportion de ces terminaisons doublement marquées dans le noyau accumbens par suite de la lésion 6-OHDA néonatale; iii) le double marquage fréquent des varicosités axonales appartenant à l'innervation DA aberrante (néoinnervation), qui se développe dans la substance noire, par suite de la lésion 6-OHDA néonatale. Des différences significatives ont aussi été notées quant à la dimension des terminaisons axonales marquées pour la TH seulement, VGLUT2 seulement ou TH et VGLUT2. Enfin, à cet âge (P15), toutes les terminaisons doublement marquées sont apparues dotées d'une spécialisation membranaire synaptique, contrairement aux terminaisons marquées pour la TH ou pour VGLUT2 seulement. Dans un deuxième temps, nous avons voulu déterminer le devenir du double phénotype chez le rat adulte (P90) soumis ou non à la lésion 6-OHDA néonatale. Contrairement aux observations recueillies chez le jeune rat, nous avons alors constaté: i) l'absence complète de terminaisons doublement marquées dans le coeur du noyau accumbens et le néostriatum d'animaux intacts, de même que dans les restes de la substance noire des animaux 6-OHDA lésés; ii) une très forte baisse de leurnombre dans le coeur du noyau accumbens des animaux 6-OHDA lésés. Ces observations, suggérant une régression du double phénotype TH/VGLUT2 avec l'âge, sont venues renforcer l'hypothèse d'un rôle particulier d'une co-libération de glutamate par les neurones mésencéphaliques DA au cours du développement. Dans ces conditions, il est apparu des plus intéressants d'examiner l'innervation DA méso-striatale chez deux lignées de souris dont le gène Vglut2 avait été sélectivement invalidé dans les neurones DA du cerveau, ainsi que leurs témoins et des souris sauvages. D'autant que malgré l'utilisation croissante de la souris en neurobiologie, cette innervation DA n'avait jamais fait l'objet d’une caractérisation systématique en microscopie électronique. En raison de possibles différences entre le coeur et la coque du noyau accumbens, l'étude a donc porté sur les deux parties de ce noyau ainsi que le néostriatum et des souris jeunes (P15) et adultes (P70-90) de chaque lignée, préparées pour l'immunocytochimie de la TH, mais aussi pour le double marquage TH et VGLUT2, selon le protocole précédemment utilisé chez le rat. Les résultats ont surpris. Aux deux âges et quel que soit le génotype, les terminaisons axonales TH immunoréactives des trois régions sont apparues comparables quant à leur taille, leur contenu vésiculaire, le pourcentage contenant une mitochondrie et une très faible incidence synaptique (5% des varicosités, en moyenne). Ainsi, chez la souris, la régression du double phénotype pourrait être encore plus précoce que chez le rat, à moins que les deux protéines ne soient très tôt ségréguées dans des varicosités axonales distinctes des mêmes neurones DA. Ces données renforcent aussi l’hypothèse d’une transmission diffuse (volumique) et d’un niveau ambiant de DA comme élément déterminant du fonctionnement du système mésostriatal DA chez la souris comme chez le rat. / Knowing that a subset of rat and mouse mesencephalic dopamine (DA) neurons expresses the mRNA of the vesicular glutamate transporter type 2 (VGLUT2), we used electron microscopic immunocytochemistry, after single or double labeling of the biosynthetic enzyme tyrosine hydroxylase (TH) and of VGLUT2, to determine the presence of one and/or both proteins in axon terminals (varicosities) of these neurons and characterize their ultrastructural morphology under various experimental conditions. At first, young (P15) or adult (P90) rats, subjected or not to cerebro-ventricular administration of the cytotoxin 6-hydroxydopamine (6-OHDA) a few days after birth, were examined in order to investigate the role of VGLUT2 in DA neurons during normal and pathological development of these neurons. In the young rats, these studies revealed: i) the presence of VGLUT2 in a significant fraction of TH immunoreactive varicosities in the core of the nucleus accumbens and the neostriatum; ii) an increase in the proportion of dually labeled terminals in the nucleus accumbens following neonatal 6-OHDA lesion; iii) frequent double labeling of TH varicosities belonging to the aberrant DA innervation (neoinnervation) which develops in the substantia nigra following neonatal 6-OHDA lesion. Significant differences were also noted in the size of the axon terminals labeled for TH only, VGLUT2 only, or TH and VGLUT2. Finally, at this age (P15), all the dually labeled terminals appeared equipped with a synaptic membrane specialization, unlike the terminals labeled for TH or for VGLUT2 only. In a second step, we sought to determine the fate of the dual phenotype in adult rats (P90) subjected or not to the neonatal 6-OHDA lesion. In contrast with the observations made in young rats, we found: i) a complete absence of dually labeled terminals in the core of the nucleus accumbens and striatum of intact animals, as well as in the remains of the substantia nigra after neonatal 6-OHDA lesion; ii) a sharp decline of their number in the core of the nucleus accumbens of 6-OHDA-lesioned animals. These findings, suggesting a regression of the dual TH/VGLUT2 phenotype with age, reinforced the hypothesis of a specific role of the co-release of glutamate from midbrain DA neurons during development. Under these conditions, it was of considerable interest to examine the DA meso-striatal innervation in two strains of mice whose Vglut2 gene has been selectively invalidated in DA neurons, as well as in their control littermates and wild-type mice. This issue was particularly relevant with the increasing use of genetically modified mice in neurobiology; indeed, this DA innervation had never been systematically characterized by electron microscopy. Because of possible differences between the core and shell of the nucleus accumbens, the study included both parts of this nucleux as well as the striatum of young (P15) and adult (P70-90) mice of each strain, prepared for TH immunocytochemistry, and also for double labeling of TH and VGLUT2, according to the protocol previously used in rats. The results were surprising. At both ages, regardless of the genotype, the TH immunoreactive axon terminals of the three regions appeared comparable in size, vesicle content, percent with mitochondria, and exceeding low frequency of synaptic membrane specialization (5% of varicosities, on average). Thus, in mice, the regression of the dual phenotype might be even more precocious than in rats, unless the two proteins are segregated very early in different axon terminals of the same DA neurons. These data also strenghten the hypothesis of a diffuse (volume) transmission and of an ambient level of DA as determinant elements in the functioning of the meso-striatal DA system in mice as well as rats.

Une sous-population des neurones à dopamine (DA) du mésencéphale ventral du rat et de la souris étant connue pour exprimer l'ARN messager du transporteur vésiculaire 2 du glutamate (VGLUT2), nous avons eu recours à l'immunocytochimie en microscopie électronique, après simple ou double marquage de l'enzyme de synthèse tyrosine hydroxylase (TH) et de VGLUT2, pour déterminer la présence de l'une et/ou l'autre protéine dans les terminaisons (varicosités) axonales de ces neurones et caractériser leur morphologie ultrastructurale dans diverses conditions expérimentales. Dans un premier temps, des rats jeunes (P15) ou adultes (P90), ainsi que des rats des deux âges soumis à l'administration intraventriculaire cérébrale de la cytotoxine 6-hydroxydopamine (6-OHDA) dans les jours suivant la naissance, ont été examinés, afin d'étayer l'hypothèse d'un rôle de VGLUT2 au sein des neurones DA, au cours du développement normal ou pathologique de ces neurones. Chez le jeune rat, ces études ont montré: i) la présence de VGLUT2 dans une fraction importante des varicosités axonales TH immunoréactives du coeur du noyau accumbens ainsi que du néostriatum; ii) une augmentation de la proportion de ces terminaisons doublement marquées dans le noyau accumbens par suite de la lésion 6-OHDA néonatale; iii) le double marquage fréquent des varicosités axonales appartenant à l'innervation DA aberrante (néoinnervation), qui se développe dans la substance noire, par suite de la lésion 6-OHDA néonatale. Des différences significatives ont aussi été notées quant à la dimension des terminaisons axonales marquées pour la TH seulement, VGLUT2 seulement ou TH et VGLUT2. Enfin, à cet âge (P15), toutes les terminaisons doublement marquées sont apparues dotées d'une spécialisation membranaire synaptique, contrairement aux terminaisons marquées pour la TH ou pour VGLUT2 seulement. Dans un deuxième temps, nous avons voulu déterminer le devenir du double phénotype chez le rat adulte (P90) soumis ou non à la lésion 6-OHDA néonatale. Contrairement aux observations recueillies chez le jeune rat, nous avons alors constaté: i) l'absence complète de terminaisons doublement marquées dans le coeur du noyau accumbens et le néostriatum d'animaux intacts, de même que dans les restes de la substance noire des animaux 6-OHDA lésés; ii) une très forte baisse de leurnombre dans le coeur du noyau accumbens des animaux 6-OHDA lésés. Ces observations, suggérant une régression du double phénotype TH/VGLUT2 avec l'âge, sont venues renforcer l'hypothèse d'un rôle particulier d'une co-libération de glutamate par les neurones mésencéphaliques DA au cours du développement. Dans ces conditions, il est apparu des plus intéressants d'examiner l'innervation DA méso-striatale chez deux lignées de souris dont le gène Vglut2 avait été sélectivement invalidé dans les neurones DA du cerveau, ainsi que leurs témoins et des souris sauvages. D'autant que malgré l'utilisation croissante de la souris en neurobiologie, cette innervation DA n'avait jamais fait l'objet d’une caractérisation systématique en microscopie électronique. En raison de possibles différences entre le coeur et la coque du noyau accumbens, l'étude a donc porté sur les deux parties de ce noyau ainsi que le néostriatum et des souris jeunes (P15) et adultes (P70-90) de chaque lignée, préparées pour l'immunocytochimie de la TH, mais aussi pour le double marquage TH et VGLUT2, selon le protocole précédemment utilisé chez le rat. Les résultats ont surpris. Aux deux âges et quel que soit le génotype, les terminaisons axonales TH immunoréactives des trois régions sont apparues comparables quant à leur taille, leur contenu vésiculaire, le pourcentage contenant une mitochondrie et une très faible incidence synaptique (5% des varicosités, en moyenne). Ainsi, chez la souris, la régression du double phénotype pourrait être encore plus précoce que chez le rat, à moins que les deux protéines ne soient très tôt ségréguées dans des varicosités axonales distinctes des mêmes neurones DA. Ces données renforcent aussi l’hypothèse d’une transmission diffuse (volumique) et d’un niveau ambiant de DA comme élément déterminant du fonctionnement du système mésostriatal DA chez la souris comme chez le rat. / Knowing that a subset of rat and mouse mesencephalic dopamine (DA) neurons expresses the mRNA of the vesicular glutamate transporter type 2 (VGLUT2), we used electron microscopic immunocytochemistry, after single or double labeling of the biosynthetic enzyme tyrosine hydroxylase (TH) and of VGLUT2, to determine the presence of one and/or both proteins in axon terminals (varicosities) of these neurons and characterize their ultrastructural morphology under various experimental conditions. At first, young (P15) or adult (P90) rats, subjected or not to cerebro-ventricular administration of the cytotoxin 6-hydroxydopamine (6-OHDA) a few days after birth, were examined in order to investigate the role of VGLUT2 in DA neurons during normal and pathological development of these neurons. In the young rats, these studies revealed: i) the presence of VGLUT2 in a significant fraction of TH immunoreactive varicosities in the core of the nucleus accumbens and the neostriatum; ii) an increase in the proportion of dually labeled terminals in the nucleus accumbens following neonatal 6-OHDA lesion; iii) frequent double labeling of TH varicosities belonging to the aberrant DA innervation (neoinnervation) which develops in the substantia nigra following neonatal 6-OHDA lesion. Significant differences were also noted in the size of the axon terminals labeled for TH only, VGLUT2 only, or TH and VGLUT2. Finally, at this age (P15), all the dually labeled terminals appeared equipped with a synaptic membrane specialization, unlike the terminals labeled for TH or for VGLUT2 only. In a second step, we sought to determine the fate of the dual phenotype in adult rats (P90) subjected or not to the neonatal 6-OHDA lesion. In contrast with the observations made in young rats, we found: i) a complete absence of dually labeled terminals in the core of the nucleus accumbens and striatum of intact animals, as well as in the remains of the substantia nigra after neonatal 6-OHDA lesion; ii) a sharp decline of their number in the core of the nucleus accumbens of 6-OHDA-lesioned animals. These findings, suggesting a regression of the dual TH/VGLUT2 phenotype with age, reinforced the hypothesis of a specific role of the co-release of glutamate from midbrain DA neurons during development. Under these conditions, it was of considerable interest to examine the DA meso-striatal innervation in two strains of mice whose Vglut2 gene has been selectively invalidated in DA neurons, as well as in their control littermates and wild-type mice. This issue was particularly relevant with the increasing use of genetically modified mice in neurobiology; indeed, this DA innervation had never been systematically characterized by electron microscopy. Because of possible differences between the core and shell of the nucleus accumbens, the study included both parts of this nucleux as well as the striatum of young (P15) and adult (P70-90) mice of each strain, prepared for TH immunocytochemistry, and also for double labeling of TH and VGLUT2, according to the protocol previously used in rats. The results were surprising. At both ages, regardless of the genotype, the TH immunoreactive axon terminals of the three regions appeared comparable in size, vesicle content, percent with mitochondria, and exceeding low frequency of synaptic membrane specialization (5% of varicosities, on average). Thus, in mice, the regression of the dual phenotype might be even more precocious than in rats, unless the two proteins are segregated very early in different axon terminals of the same DA neurons. These data also strenghten the hypothesis of a diffuse (volume) transmission and of an ambient level of DA as determinant elements in the functioning of the meso-striatal DA system in mice as well as rats.