A l’heure de la protéomique, la spectrométrie de masse est devenue un outil puissant pour la recherche et l’identification des biomolécules. Depuis une dizaine d’année, une nouvelle application, l’imagerie MALDI, s’est greffée aux méthodes existantes, pour permettre la localisation de biomolécules telles que les peptides, les protéines ou les lipides au sein des tissus. Appliquée à la recherche de biomarqueurs dans le cadre du cancer de l’ovaire, cette technique nous a permis d’identifier plusieurs protéines exprimées dans le cancer en utilisant une analyse différentielle automatique basée sur des outils statistiques tels que l’analyse en composante principale (PCA). Parmi les biomarqueurs identifiés, on trouve un fragment de l’immunoprotéasome 11S. La localisation de ce fragment dans les tissus cancéreux a été validée par IHC. Il est présent dans les cellules épithéliales avec un changement de localisation entre bénin et cancer, du noyau vers le cytoplasme. Une liste des marqueurs spécifiques des tissus de cancer de l'ovaire a été obtenue, la plupart de celles-ci correspondent à des protéines associées à la prolifération cellulaire, impliquées dans la modulation de la réponse immunitaire, la signalisation au niveau du cytosquelette, la progression tumorale et la conversion des cellules épithéliales en cellules mésenchymateuses. Une validation croisée a été réalisée par une nouvelle approche spécifique TAG MASS, par Western Blot et par PCR (utilisant des cellules ovariennes cancéreuses SKOV3). Le deuxième point abordé est l’étude de la présence de la protéine Reg alpha dans les fluides biologiques. Par la suite, avec la mise en évidence d’un grand nombre de biomarqueurs identifiés par MS correspondant à des protéines clivées, une hypothèse d’une étiologie virale a été envisagée pour la suite des travaux. On a pu mettre en évidence des protéines oncovirales de la famille des herpes viridae tel que HHV6, HHV4 et EBV. Enfin, nous avons réussi à développer des nouvelles techniques de quantification par spectrométrie de masse basées sur l’ELISA et la PCR. / At the proteomics’ time, mass spectrometry has become a powerful tool for research and identification of biomolecules. Over the past decade, a new application, MALDI imaging was grafted to the existing methods for the detection of biomolecules such as peptides, proteins and lipids in tissues. Applied to biomarkers research in ovarian cancer, this technique allowed us to identify several proteins expressed in cancer using differential analysis system based on statistical tools such as principal component analysis (PCA). Among the biomarkers identified, we found a fragment of the 11S immunoproteasome. The location of this fragment in cancer tissue has been validated by IHC; it is present in epithelial cells with a change of localization between cancer and Benin, from the nucleus to the cytoplasm. A list of specific tissue markers for ovarian cancer has been obtained, most of them corresponding to a protein associated with cell proliferation, involved in modulating immune response, signaling at the cytoskeleton, the tumor progression and conversion of epithelial cells with mesenchymal cells. A cross validation was performed by a specific new approach TAG MASS, by Western Blot and PCR (using SKOV3 ovarian cancer cells). The second point is the study of the presence of the protein Reg alpha in the fluids. Subsequently, with the discovery of a large number of biomarkers identified by MS corresponding to proteins cleaved, a hypothesis of a viral etiology has been proposed for further work. Were able to identify oncovirales proteins of herpes viridae family as HHV6, HHV4 and EBV. Finally, we managed to develop new quantification techniques using mass spectrometry technique based on the ELISA and PCR.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les cellules souches cancéreuses (CSC) sont impliquées dans les phénomènes de résistance aux traitements et de récidives dans les cancers du sein. Les neurotrophines comprennent le NGF et le BDNF, synthétisés sous forme de pro-neurotrophines. Elles se lient au récepteur commun p75NTR et à TrkA ou TrkB, fixant préférentiellement une (pro)neurotrophine. Récemment, le laboratoire Inserm U908 a démontré que le NGF/proNGF sont capables d’enrichir plusieurs lignées épithéliales cancéreuses de sein en CSC. L’objectif de ma thèse était de comprendre le rôle des neurotrophines dans la régulation des CSC de sein chez l’homme et dans le modèle canin. Nous avons montré que le BDNF/proBDNF peuvent également enrichir des lignées cancéreuses de sein en CSC in vitro. De plus, l’enrichissement en CSC induit par le NGF implique p75NTR et TrkA tandis que les effets du proNGF impliquent également EphA2.Sur 96 tumeurs mammaires canines issues de la biobanque d’OCR (Oncovet Clinical Research, Lille Métropole, France), nous avons montré par immunohistochimie que le phénotype CD44+/CD24- seul n’est pas adapté pour détecter les CSC. CD24 est associé à des paramètres clinicopathologiques défavorables. Le proNGF, TrkA, et le BDNF sont exprimés dans une majorité des tumeurs, mais ne sont pas associés avec des paramètres clinicopathologiques. P75NTR et TrkB sont associés à des paramètres clinicopathologiques favorables et à une meilleure survie globale. De plus, p75NTR semble être un marqueur de cellules myoépithéliales. Ces résultats sont en accord avec les données obtenues dans le cancer du sein, soulignant la pertinence du modèle canin dans le développement de nouvelles thérapies ciblées. / Cancer stem cells (CSC) are implied in resistance to treatment and recurrences in breast cancer. Neurotrophins include NGF and BDNF, synthetized as proneurotrophins. They bind to common receptor p75NTR and to TrkA or TrkB, which bind specifically one (pro)neurotrophin. Recently, INSERM U908 demonstrated that NGF/proNGF are able to enrich several breast cancer cell lines in CSC. The objective of my PhD was to better understand the role of neurotrophins in the regulation of breast cancer stem cells both in human breast cancer and in the canine model.We showed that BDNF/proBDNF could also enrich the pool of CSC in several breast cancer cell lines in vitro. Furthermore, the action of NGF on the enrichment of CSC pool is mediated by p75NTR and TrkA, while the effects of proNGF also depend on EphA2. On 96 paraffin-embedded canine mammary tumors samples coming from the biobank of OCR (Oncovet Clinical Research, Lille Métropole, France), we showed by immunohistochemistry that the phenotype CD44+/CD24- alone is not suitable to detect CSC. CD24 is associated with poor clinicopathological parameters. ProNGF, TrkA and BDNF are expressed in a majority of tumors, but are not associated with clinicopathological parameters. Positive correlation between P75NTR and TrkB expression and favorable clinicopathological parameters as well as better overall survival has been observed. Moreover, p75NTR seems to be a marker of myoepithelial cells. These results are consistent with the results obtained in human breast cancer, which underlines the relevance of the canine model in the development of new targeted therapies.

Les lymphomes hodgkiniens(LH) représentent 30% des lymphomes. 90 % des patients en sont gueris mais parfois au prix d'importants effets secondaires(cancers secondaires notamment). L'enjeu actuel consiste à identifier les patients susceptibles de bénéficier d'une déescalade thérapeutique(même résultat thérapeutique obtenu au prix d'un traitement moins lourd)Actuellemnt les facteurs pronostiques utilisé en routine(stade Ann Arbor et index pronostic internationnal) ne permettent qu'une stratification imparfaite des patients notamment pour les stades localisés. Dans le but d'identifier de nouveaux facteurs pronostiques des LH nous avons mené une étude d'expression génétique sur puces Affimetrix. Nous identifions une signature moléculaire reliée à un bon pronostic et enrichie en gènes lymphocytaires B comprenant BCL11A, un facteur de transcription exprimé par les lymphocytes B et les cellules dendritiques plasmocytoïdes. Nous validons ce résultats en immunohistochimie sur TMA et retrouvons un meilleur pronostic associé aux tumeurs dont le microenvironnement est riche en cellules BCL11A+ et CD20+. Nous mettons également en évidence dans les cas EBV+ une signature d'expression génique enrichie en gènes caractéristiques d'une réponse immunitaire Th1 et anti-virale. Ces résultats peuvent fournir un rationnel scientifique à de nouvelle stratégies thérapeutiques. Il sera intéressant d'évaluer le bénéfice d'une déescalade thérapeutique chez les patients dont la tumeur présente un microenvironnement riche en lympocytesB. / The outcome of classical Hodgkin lymphoma(cHL)patients may be related to the tumor microenvironment, which in turn may be influenced by Epstein-Barr virus(EBV)infection. To characterize the cHL microenvironment, a set of 63 cHL tissue samples was profiled using DNA microarrays. Their gene expression profile differed from that of histiocyte T-cell-richB-cell lymphoma(H/TCRBCL)samples that were used as controls, mainly du to high expression of PDCD1/PD-1 in H/TCRBCL. EBV-cHLtissues could be distinguished from EBV+samples by a gene signature characteristic ofTh1 and antiviral responses. Samples from cHL patients with favourable outcome overexpressed genes specific for B cells and genes involved in apoptotic pathways. An independent set of 146 cHL samples was analyzed using immunohistochemistry. It showed a significiant adverse value in case of high percentage of either TIA-1+-reactive cells or topoisomerase-2+tumor cells, whereas high numbers of BCL11A+, FOXP3+, or CD20+ reactive cells had a favorable influence. Our results suggest an antitumoral role for B cells in the cHL microenvironment and a stronger stromal influence of the strategies.120

La cytogénétique est une branche de la génétique qui étudie les chromosomes et leur intégrité ainsi que les conséquences de leur transmission et de leur expression. Plusieurs syndromes et maladies ont pu être expliqués par cette discipline. Certaines anomalies chromosomiques de structure ont d'ailleurs contribué à identifier des gènes, des fonctions de gènes ou à caractériser des structures chromosomiques. Dans cet ordre d'idées, nous avons utilisé deux isodicentriques du bras long du chromosome Y (idic(Y)(p11.3)) pour étudier la fonction d'une protéine du kinétochore, CENP-B, dans le mécanisme d'inactivation de kinétochore. Pour ce faire, nous avons premièrement fait une caractérisation cytogénétique des deux idic(Y)(p11.3) à l'aide des techniques de cytogénétique classique et de cytogénétique moléculaire. Nous avons ainsi déterminé approximativement le point de cassure des deux isodicentriques, soit en Yp11.3. Comme les deux chromosomes avaient une structure très semblable, mais que les patients présentaient un phénotype clinique très différent, nous avons investigué les niveaux de mosaïcisme dans différents tissus chez les deux patients. Il est connu qu'un chromosome possédant deux centromères capables de former le kinétochore peut être très instable lors des divisions cellulaires. Ainsi, la cellule a mis au point un mécanisme permettant d'inactiver un des kinétochores du chromosome dicentrique. Une récente revue a proposé que la protéine CENP-B jouerait un rôle dans ce mécanisme. Cependant, comme le chromosome Y ne possède pas la séquence d'ADN liant cette protéine, il était intéressant de vérifier si une inactivation des kinétochores avait eu lieu dans nos idic(Y)(p11.3). À l'aide d'un anticorps dirigé contre la protéine CENP-C, connue comme un marqueur de kinétochore actif, nous avons montré que plus de 40% des chromosomes dicentriques avaient subi une inactivation d'un de leur kinétochore. Enfin, la présence de la protéine CENP-B dans ces kinétochores a été étudiée. Nous avons montré que la protéine CENP-B était présente à tous les autres centromères, sauf ceux de l'idic(Y)(p11.3). Ainsi, nous proposons que la protéine CENP-B n'est pas impliquée directement dans le mécanisme d'inactivation de kinétochore du chromosome Y. Par contre, nous ne pouvons pas exclure qu'elle joue un rôle indirect, soit par une interaction protéine/protéine, soit à une étape en amont dans le mécanisme d'inactivation.

Dans le monde actuel, il demeure encore que le cancer colorectal soit une des premières causes de mortalité par cancer. Le développement et la progression de ce cancer fait intervenir des événements complexes comme les mutations oncogéniques mais aussi la surexpression de différents récepteurs membranaires dont les intégrines. Dans l'intestin grêle, l'intégrine α1β1 est exprimée uniquement par les cellules prolifératives de la crypte. Ce profil supporte le rôle rapporté pour cette intégrine dans le recrutement de la cavéoline-1 et l’activation en aval, via Shc, de la voie proliférative Ras/ERK dans les fibroblastes. L’expression de la sous-unité α1 n’a pas été décrite dans le tissu colique normal et tumoral. Chez la souris, l'intégrine α1β1 soutient la motilité des cellules tumorales mammaires et, de concert avec le facteur oncogénique Kras, elle potentialise la croissance et l’invasion tumorales. Ces rôles ne sont pas connus dans le cancer colorectal. L’objectif dans cette étude est d’analyser l’expression de la sous-unité α1 dans le cancer colorectal, de définir les facteurs de régulation de son expression et d’identifier les rôles de l’intégrine α1β1 dans la progression du cancer colorectal. Mes expériences de recherche ont permis de montrer que la sous-unité α1 est présente dans 65% des adénocarcinomes colorectaux et que son expression est observée non seulement dans les cellules épithéliales mais aussi dans les cellules du microenvironnement de la tumeur. Mes résultats ont contribué à l’identification de la sous-unité α1 comme une nouvelle cible directe de l’oncogène MYC dans le cancer colorectal. J’ai démontré que MYC se lie directement au promoteur du gène ITGA1 au niveau de deux éléments de réponse spécifiques. Ce contrôle s’est reflété par une corrélation significative entre l’expression des deux protéines MYC et α1 dans 72% des adénocarcinomes étudiés. J’ai pu également montrer pour la première fois que l’intégrine α1β1 est importante pour la prolifération des cellules tumorales colorectales ainsi que pour leur migration et leur survie. De plus, en utilisant des modèles de xénogreffes, j’ai observé que cette intégrine est importante pour la croissance des tumeurs colorectales, et son absence induit également une importante nécrose tumorale. Mes découvertes apportent de nouvelles connaissances dans la compréhension de l’implication de l’intégrine α1β1 dans la carcinogenèse colorectale. Cette intégrine pourrait représenter une cible thérapeutique intéressante dans le traitement du cancer colorectal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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