Pas de résumé / Background: Mendelian mutations causing monogenic enteropathies are identified in an increasing number of genes and are responsible for either chronic inflammatory diseases (frequently called VEO-IBD for very early-onset inflammatory bowel diseases) or for congenital diarrheal disorders (CDD). Management of many patients with monogenic enteropathies requires difficult therapeutic decisions and heavy treatments, such as hematopoietic stem cell transplantation for VEO-IBD patients, or total parenteral nutrition and intestinal transplantation for CDD patients. Early molecular diagnosis is crucial to define the most pertinent treatment and increase life expectancy. During my thesis, I introduced in the laboratory big data management tool (e. g. online dedicated database) and applied next-generation sequencing tools (whole exome sequencing (WES) and targeted gene panel sequencing (TGPS)) to a cohort of patients suffering from monogenic enteropathies in order to characterize them phenotypically and genetically. Methods: My thesis was divided in 4 steps. In Step 1, patients (n=216 in January 2016, n=260 in August 2016) recruited through a French research protocol (Immunobiota, 12 centers) and European network (GENIUS, 33 centers) were phenotypically characterized through an online dedicated database. Following precise phenotyping, molecular diagnoses were obtained by Sanger sequencing of candidate genes suggested by functional tests in Step 2. Step 3 was the adaptation of WES for our cohort of patients (59 patients were sequenced in trio and 11 sequenced by themselves or in duo) and lastly, in Step 4, TGSP was designed and applied to our cohort (173 patients without a molecular diagnosis). Findings: The cohort gathered 57 patients including 22 with a molecular diagnosis in January 2012, and 216 patients including 70 with a diagnosis in January 2016, corresponding to a global diagnosis rate of 1/3. Approximately 50 new patients are recruited each year, with blood samples taken from each patient, both parents and siblings. During this period, 11 diagnoses were obtained by a phenotype-based approach, with identification of mutations notably in IL-10R (4 patients) and XIAP (4 patients). Eleven patients obtained a genetic diagnosis by WES including two siblings with a MALT1 deficiency responsible for an IPEX-like syndrome. Because of the increasing number of genes involved in monogenic enteropathies, we developed, in collaboration with Genomics, Bioinformatics and Translational Genetics platforms from the Institut IMAGINE, a custom-made TGPS gathering 68 genes responsible for either VEO-IBD or CDD. The sequencing of all negative patients (n=173) on this panel allowed to identify 28 new diagnoses (among which 8 were made in patients included before 2012). Interpretation: This work lead to the identification of the genetic diagnosis in 1/3 patients. The close investigations of phenotype-genotype correlations highlighted frequent overlaps among monogenic enteropathies. Following completion of this work, we suggest to use TGPS as a first-line genetic test in addition to a precise phenotyping of the patient. Depending on the results, TGPS will either reach an early molecular diagnosis crucial to optimize treatments in a cost-effective manner, or allow to perform further genetic analysis notably by WES.

Le microenvironnement des tumeurs est composé de cellules immunitaires, de fibroblastes et de cellules endothéliales, ainsi que d’autres cellules non-malignes. Son étude a permis d’établir des classifications qui ont une valeur pronostique et théranostique, ainsi que de développer des traitements modulant la composition et l’orientation fonctionnelle du microenvironnement. En parallèle, des classifications moléculaires des tumeurs ont proposé des taxonomies stratifiant les cancers humains en sous-groupes associés à des différences de survie des patients et leur réponse aux traitements. Des études récentes suggèrent que le phénotype de la cellule cancéreuse est un facteur critique dans le façonnement du microenvironnement tumoral, suggérant un possible consensus entre les classifications immunitaires et moléculaires. Le but de cette thèse était donc de caractériser le microenvironnement des sous-groupes moléculaires de tumeurs humaines. Le cancer colorectal a été le premier cancer humain dans lequel il a été mis en évidence qu’une réponse immunitaire adaptative était associée à un contrôle de la croissance tumorale, et représente ainsi un exemple type pour l’immunologie des tumeurs. A l’inverse, le carcinome du rein à cellules claires est une exception vis-à-vis de l’immunologie des tumeurs, puisqu’une forte réponse immunitaire adaptative y est associée à des tumeurs plus agressives. Des classifications transcriptomiques ont été récemment établies pour ces deux cancers, qu’à première vue tout oppose sur le plan immunitaire. Dans ce travail, je propose une méthode permettant l’étude du microenvironnement tumoral à partir de données transcriptomiques, et décris son application à l’étude du contexte immunitaire des cancers colorectaux et du rein à cellules claires. Ces analyses suggèrent qu’une unification des classifications moléculaires et immunitaires des tumeurs humaines est possible, remettent en cause notre conceptualisation des liens entre la composition du microenvironnement tumoral et le pronostic du patient, et évoque des pistes immunothérapeutiques potentiellement adaptées à certains sous-groupes de patients dans ces cancers. / Tumors grow within a complex microenvironment composed of immune cells, fibroblasts, endothelial cells and other non-malignant cells. The study of the composition of tumor microenvironments has led to classifications with prognostic and theranostic values, as well as the discovery of treatments modulating the composition and the functional orientation of the microenvironment. Concurrently, molecular classifications of tumors have proposed taxonomies within cancers that define groups of patients with different prognoses and are associated with response to treatments. Recent evidence suggest that the phenotype of the malignant cell is a critical determinant in the shaping of its microenvironment, suggesting potential correlations between immune and molecular classifications. The goal of this PhD project was therefore to analyze the microenvironment of molecularly-classified human tumors. Colorectal cancer represents a paradigm for tumor immunology, as it is the humancancer in which it was exemplified that an adaptive immune response can control tumor Growth and metastasis. Conversely, clear-cell renal cell carcinoma represents an exception in tumor immunology, as an extensive adaptive immune response is associated with more aggressive diseases. Molecular transcriptomic classifications were recently proposed for both of these apparently immunologically contrasted cancers. In this work, I propose a methodology that enables the characterization of the tumor microenvironment using transcriptomic data, and apply it to describe the immune contexture of molecular subgroups of colorectal and clear-cell renal cell carcinomas. These analyses argue in favor of the unification of molecular and immune classifications of human cancers, challenge our current views of the relationship between the composition of the tumor microenvironment and patient’s prognosis, and suggest immunotherapeutic approaches that could benefit subgroups of patients in these two cancers.

Au cours du développement d’un cancer, la tumeur se forme dans un environnement adapté à sa croissance appelé microenvironnement tumoral. Celui-ci est constitué d’un réseau complexe qui orchestre la progression tumorale et dans lequel sont présents différents types cellulaires, des facteurs solubles ainsi que des composants de la matrice extracellulaire. Parmi les cellules du microenvironnement tumoral, on trouve les cellules du système immunitaire. Certaines ont la capacité de reconnaître et d’éliminer directement les cellules cancéreuses, tandis que d’autres promeuvent la croissance tumorale et la dissémination métastatique. Les lymphocytes T γδ ont longtemps été considérés uniquement comme des acteurs anti-tumoraux, agissant grâce à leur fonction cytotoxique et à leur sécrétion précoce d’interféron (IFN)-γ. Dans de plus en plus de travaux récents, l’idée que les lymphocytes T γδ soient, également, des acteurs pro-tumoraux est mise en évidence. Leurs fonctions pro-tumorales sont principalement attribuées à leur production d’interleukine (IL)-17, favorisant l’angiogenèse et le recrutement de cellules myéloïdes suppressives (MDSCs). Le mécanisme induisant la polarisation des T γδ vers la production d’IL-17 plutôt que d’IFN-γ restait à préciser. Nous avons identifié la synthétase de l’oxyde nitrique de type 2 (NOS2) comme candidat potentiel étant donné son action exercée sur la production d’IL-17 par les lymphocytes T αβ CD4+ (Th17). Nous montrons que les cellules T γδ expriment NOS2 dans les tumeurs primaires de mélanome chez les patients et également chez la souris, dans un modèle de développement spontané de mélanome. Nous avons identifié que l’expression de NOS2 endogène était un inducteur clé de la sécrétion d’IL-17 par les T γδ dans le mélanome, ce qui a pour conséquence de recruter les MDSCs dans la tumeur primaire et d’induire la dissémination métastatique. En parallèle, les T γδ exprimant NOS2 produisent moins d’IFN-γ et présentent, in vitro, des capacités de lyse des cellules tumorales réduites en comparaison avec les T γδ déficients pour NOS2. Nous émettons l’hypothèse que le microenvironnement tumoral puisse fournir les facteurs nécessaires à l’activation des T γδ (comme l’IL-1β, l’IL-6 et ou la reconnaissance d’un antigène par le TCR) pour permettre l’expression endogène de NOS2 par les cellules T γδ. En plus de favoriser la polarisation des T γδ en effecteurs pro-tumoraux, nous montrons que NOS2 favorise leur expansion par un mécanisme dépendant de l’IL-2. En effet, les T γδ déficients pour NOS2 montrent des capacités de prolifération et un métabolisme glycolytique réduits qui sont restaurés par l’ajout d’IL-2 exogène. / Consequences of the expression of nitric oxide synthetase type 2 (NOS2) on the functions of γδ T lymphocytes during the development of melanoma

Le carcinome du nasopharynx (CNP) est un cancer des voies aérodigestives supérieures qui est associé à une infection par le virus d’Epstein Barr (EBV) dans près de 100% des cas. Le microenvironnement dans le CNP se caractérise par la présence massive de lymphocytes T régulateurs (Treg) et d’exosomes tumoraux (exoCNP) aux propriétés immunosuppressives. Notre équipe a montré que ces exosomes synergisent avec les Treg et contribuent à l’échappement à l’immunosurveillance du CNP. Notre hypothèse est que les exoCNP isolés de la tumeur puissent induire des cellules dendritiques (DC) tolérogènes qui favorisent la tolérance en induisant des Treg. Des premiers résultats dévoilent que les exoCNP favorisent l’émergence de DC semi-matures (smDC). Outre le phénotype, des études fonctionnelles de l’enzyme immunosuppressive indoléamine 2,3-dioxygénase 1 (IDO1) ainsi que de la sécrétion de cytokines régulatrices (IL-10 et TGF-β) montrent que les smDC générées mettent en place un microenvironnement immunosuppressif. Des résultats encourageants témoignent de l’activité tolérogène des smDC, capables d’induire des Treg fonctionnels et d’inhiber la prolifération des lymphocytes T effecteurs. Enfin, nous avons également montré que les exoCNP sont à même d’attirer préférentiellement les DC tolérogènes vers le site tumoral par la chimiokine CCL20. Nos résultats prometteurs semblent confirmer que les exoCNP induisent des DC tolérogènes contribuant à l’échappement immunitaire de la tumeur. Notre projet devrait ainsi ouvrir de nouvelles voies d’immunothérapies anti-tumorales ciblant des facteurs impliqués dans l’émergence des Treg et donc de la progression du cancer. / Nasopharyngeal carcinoma (NPC) is a cancer of the upper aerodigestive tract that is associated in almost 100% of cases with an infection by the Epstein Barr virus (EBV). The tumour microenvironment is characterized by the overwhelming presence of regulatory T cells (Tregs) and tumour exosomes (NPCexo) that both have immunosuppressive properties. Our team has shown that these exosomes synergize with the Tregs and contribute to the escape of NPC to immune surveillance. Our hypothesis is that NPCexo secreted by the tumour can induce tolerogenic dendritic cells (DCs) that promote tolerance by inducing Tregs. First results reveal that NPCexo favour the emergence of semi-mature DCs (smDC). In addition to the phenotype, functional studies of the immunosuppressive enzyme indolamine 2,3-dioxygenase 1 (IDO1) as well as the secretion of regulatory cytokines (IL-10 and TGF-β) show that the generated smDCs establish an immunosuppressive microenvironment. Encouraging results demonstrate the tolerogenic nature of smDCs, capable of inducing functional Tregs and inhibiting the proliferation of effector T cells. Finally, we have also shown that NPCexo are able to preferentially attract tolerogenic DC to the tumour site in CCL20-dependant manner. Our promising results seem to confirm that NPCexo induce tolerogenic DCs that contribute to the tumour’s immune escape. Our project should open new leads for anti-tumour immunotherapy by targeting factors involved in the emergence of Tregs and thus the progression of cancer.

Le rôle des neutrophiles dans la réponse immunitaire innée est bien connu. Ils résident dans le sang et ont une durée de vie limitée à quelques heures. Suite à une infection, ils quittent le flux sanguin et se dirigent vers les sites inflammatoires en réponse à des chimiokines produites par des cellules endothéliales et des fibroblastes. Au niveau du site d’inflammation, les neutrophiles phagocytent et éliminent les pathogènes extracellulaires, et produisent des cytokines inflammatoires. Des travaux récents montrent que les neutrophiles peuvent également jouer un rôle dans l’immunité adaptative. En effet, ils ont la capacité de transporter des antigènes vers les ganglions lymphatiques, d’induire la différenciation des lymphocytes et d’influencer la réponse immune adaptative par la production de cytokines. La fonction des neutrophiles dans l’induction et/ou la régulation de la réponse adaptative requiert l’interaction entre ceux-ci et d’autres populations cellulaires, telles que les cellules dendritiques et les lymphocytes. Nous avons donc examiné la localisation des neutrophiles au niveau de la rate dans des conditions basales ou inflammatoires. D’une manière générale, nos résultats montrent que, en cas d’infection, les neutrophiles migrent vers la pulpe blanche de la rate et se localisent en contact étroit avec les lymphocytes T. Ce phénomène de migration est dépendant des molécules CD14 et MyD88 et corrèle avec l’augmentation de l’expression des chimiokines CXCL1 et 2, ainsi qu’avec la diminution de l’expression du récepteur CXCR2 à la surface des neutrophiles. Cependant, au niveau de la cavité péritonéale, le recrutement des neutrophiles est augmenté en absence de la molécule CD14. Nos résultats montrent que la migration des neutrophiles, dans les organes lymphoïdes et non lymphoïdes, est dirigée par des mécanismes différents.

Les nucléotides, et tout particulièrement l’ATP, sont capables de moduler la fonction de l’un des principaux acteurs de la réponse immunitaire à savoir les cellules dendritiques (DC). Les DC expriment à leur surface de nombreux récepteurs P2X et P2Y dont le P2Y11, couplé à la voie de l’AMP cyclique (AMPc) et impliqué dans l’immunomodulation. L’ATP est capable, par son action sur le P2Y11, d’induire une semi-maturation des DC caractérisée entre autre par une diminution de la sécrétion d’IL-12 et une augmentation de la sécrétion d’IL-10. De plus, des données antérieures obtenues au laboratoire montrent que l’ATP confère également des propriétés immunosuppressives aux DC en stimulant l’expression de la thrombospondine-1 (TSP-1) et de l’indoléamine-2,3-dioxygénase (IDO). Dans ce contexte, notre projet visait à établir un profil d’expression génique en réponse à l’ATP dans des DC humaines issues de monocytes (MoDC) afin d’avoir une vue globale de l’action de l’ATP sur les DC. Dans un premier temps, nous avons donc réalisé une étude cinétique comparant les profils d’expression génique en réponse à l’ATPγS, un agoniste plus stable que l’ATP, et à la prostaglandine E2 (PGE2), un activateur de l’AMPc induisant une semi-maturation des DC, par la technique de microarray. L’analyse de ces profils a mis en évidence une action précoce et large de l’ATPγS sur les MoDC. Un grand nombre de régulations obtenues ont confirmé les effets déjà connus de l’ATP sur les DC. Par ailleurs, nous avons confirmé par différentes techniques plusieurs nouvelles cibles de l’ATP impliquées dans l’inflammation et la réponse immunitaire (ex. CSF-1, NRP-1, VEGF). En analysant plus en détail ces profils, nous avons observés la régulation de plusieurs gènes dont VEGF, AREG, EREG et HB-EGF, intervenant dans les processus d’angiogenèse et de tumorigenèse. Parmi ceux-ci, le gène AREG codant pour l’amphiréguline, un ligand de l’EGF récepteur (EGFR) était le gène le plus régulé dans notre profil microarray. Pour la première fois, nous avons démontré que les DC traitées à l’ATPγS en présence de LPS constituaient une importante source d’amphiréguline capable de stimuler la croissance de cellules musculaires lisses et de cellules tumorales LLC (Lewis Lung Carcinoma) in vitro. Parallèlement, nous avons étudié l’implication des cellules dendritiques traitées à l’ATPγS sur la croissance tumorale in vivo. Pour ce faire, nous avons coinjecté, à des souris C57 black/6, des cellules tumorales LLC avec des surnageants issus de BMDC traitées au LPS ou au LPS+ATPγS. De cette façon, nous avons mis en évidence que des surnageants issus de BMDC traitées au LPS+ATPγS induisaient une augmentation significative de la masse tumorale par rapport aux surnageants issus de BMDC traités au LPS seul. Au moyen d’un anticorps bloquant anti-amphiréguline, nous avons démontré que cette augmentation de la masse tumorale était due à l’importante sécrétion d’amphiréguline par les BMDC traitées au LPS+ATPγS. De plus, nous avons observé une augmentation du nombre de vaisseaux positifs pour l’α-SMA, un des marqueurs des cellules musculaires lisses, dans les tumeurs issues de la coinjection de cellules LLC avec des surnageants de BMDC traitées au LPS+ATPγS. Pour finir, nous avons montré que les DC au sein des tumeurs LLC expriment non seulement le récepteur EGFR mais également l’amphiréguline. Ces différents résultats observés mettent en avant l’importance de l’ATP extracellulaire dans la croissance tumorale par son action sur les DC.

Thèse de doctorat : Médecine. Immunologie : Université de Nantes : 2006. / Bibliogr.

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La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie neuromusculaire récessive liée au chromosome X. Elle se manifeste par une dégénérescence musculaire progressive, menant finalement à la perte de la marche et à la mort. Elle est causée par une mutation au niveau du gène dmd codant pour une protéine, la dystrophine. Cette mutation altère le cadre de lecture normal du gène causant la perte de l’expression de la dystrophine, essentielle pour la protection des muscles contre la dégénérescence suite à l’effort. Par contre, la majorité des patients DMD ainsi que la souris mdx (modèle animal de la DMD), expriment de rares fibres musculaires révertantes qui expriment la dystrophine. Cette expression est due à une mutation somatique qui restore le cadre de lecture normal du gène et mène à la synthèse d’une dystrophine recombinante. Il a été suggéré que la dystrophine exprimée par les fibres révertante puisse induire une tolérance immunologique, conduisant à l’accumulation des fibres révertantes. Alternativement, ces rares fibres révertantes peuvent provoquer une réponse auto-immune qui limiterait les approches thérapeutiques visant à réexprimer la dystrophine. Dans mon étude, j’ai cherché à vérifier si la dystrophine néoformée provoque une réponse immunitaire dans la souris mdx. Tout d’abord, j’ai examiné, par immunohistochimie, les Tibialis antérieurs (TA) de souris mdx (souris dystrophiques) et Rag/mdx (dystrophiques et lymphopéniques) afin de comparer le nombre de fibres révertantes entre les souris immunocompétentes et les souris immunodéficientes. Cette étude permettait donc d’évaluer l’influence du système immunitaire sur la présence des fibres révertantes. Ensuite, j’ai tenté de vérifier, in vivo, la présence d’une réaction immunitaire cellulaire envers la dystrophine. Des splénocytes de souris mdx et 10J ont alors été transférés par injection intra-veineuse dans des souris Rag et Rag/mdx. Les muscles de ces dernières ont été examinés par marquage immunohistochimique afin de détecter la présence d’infiltration de cellules immunitaires autour des fibres révertantes. iii Enfin, pour étudier la réponse humorale, j’ai examiné les sérums de souris mdx par immunohistochimie et Western-Blot, afin de vérifier si des anticorps contre la dystrophine étaient présents. Mes travaux ont montré que les souris immunodéficientes avaient un nombre plus élevé de fibres dystrophine-positives, ce qui suggère que le système immunitaire est impliqué dans l’élimination des fibres révertantes chez les souris mdx immunocompétentes. En plus, la détection d’une infiltration de lymphocytes T dans les muscles de souris Rag/mdx, contenant des fibres révertantes, vient appuyer notre hypothèse. Cependant, le sérum de souris mdx ne contenait pas d’anticorps contre la dystrophine. Ces résultats suggèrent que les fibres révertantes n’induisent pas une tolérance immunitaire envers la dystrophine néoformée et qu’au contraire, elles induisent l’activation du système immunitaire. Cette activation se traduit par une réponse à médiation cellulaire et n’implique probablement pas une réponse à médiation humorale. / Duchenne muscular dystrophy (DMD) is an X-linked recessive neuromuscular disease. It is characterized by progressive muscle degeneration, eventually leading to loss of ambulation and death. It is caused by a mutation in the dmd gene which encodes for the dystrophin protein. This mutation alters the normal reading frame of the gene causing the loss of dystrophin expression, essential for the protection of muscles from degeneration, following an effort. However, the majority of DMD patients and mdx mice (animal model of DMD) have rare revertant muscle fibers that express dystrophin. This expression is due to a somatic mutation, which restores of the normal reading frame of the gene and leads to the synthesis of a recombinant dystrophin. It was suggested that the dystrophine expressed by the revertant fibers could induce immunological tolerance, leading to the accumulation of revertant fibers. Alternatively, these rare revertant fibers could induce an autoimmune response that limits the success of therapeutical approaches to induce the expression of dystrophin. The aim of my study was to verify whether the newly formed dystrophin triggers an immune response in the mdx mouse. The Tibialis anterior (TA) muscle of mdx (dystrophic) and Rag/mdx (dystrophic, lymphopenic) mice were first examined by immunohistochemical staining to compare the number of revertant fibers present in immunocompetent and immunodeficient mice. This study allowed us to evaluate the influence of the immune system on the presence of revertant fibers. The presence of a potential cellular immune response against dystrophin was then investigated in vivo. Splenocytes from mdx and 10J mice were transferred intravenously into Rag and Rag/mdx. The muscules of these mice were examined by immunohistochemical staining to detect the presence of immune cellular infiltration around the revertant fibers. Finally, to study the humoral response, I examined sera from mdx mice using immunohistochemical staining and Western blotting to check for antibodies against dystrophin. My research showed that immunodeficient mice had a significantly higher number v of dystrophin-positive fibers, suggesting that the immune system is involved in the elimination of revertant fibers in immunocompetent mdx mice. In addition, T cells obtained from mdx mice and injected in Rag/mdx mice infiltrated muscles of Rag/mdx mice containing revertant fibers supporting the hypothesis that mdx mice do make a cellular immune response against the dystrophin revertant fibers. However, the mdx mouse serum did not contain any antibodies against dystrophin. These results suggest that revertant fibers do not induce an immune tolerance to the newly formed dystrophin, but on the contrary, they trigger the activation of the immune system. This activation results in a cell-mediated immunity but not a humoral immunity.