Le protéasome et l’immunoprotéasome possèdent trois activités catalytiques différentes et dégradent une grande variété de protéines. Leur rôle central dans de nombreux processus tels que le contrôle du cycle cellulaire et circadien, la régulation des voies de défense contre le stress font d’eux des cibles majeures dans le processus de vieillissement et dans le traitement des cancers. Aussi, le lien établi entre l'horloge circadienne et les défenses anti-oxydantes suggère que l'homéostasie redox des protéines et leur élimination par le protéasome soient modulées par l'horloge circadienne. L’étude d’inhibiteurs bivalents et non covalents du protéasome a montré que de cibler deux sites actifs à la fois permet d’augmenter l’efficacité et la sélectivité. Nous avons également effectué l'évaluation de la pénétration cellulaire de ces molécules à l’aide de sondes fluorescentes non covalentes conçues par le laboratoire. Nous avons montré que les activités peptidases du protéasome présentent une rythmicité circadienne en antiphase avec le taux de protéines carbonylées. L'expression circadienne de NRF2 et de l'activateur PA28 expliquerait cette stimulation de l'activité du protéasome. De plus, contrairement aux fibroblastes jeunes, aucune modulation circadienne du protéasome et du niveau de ROS n’a été mise en évidence dans les fibroblastes sénescents. Des résultats préliminaires de nos inhibiteurs sur le modèle cellulaire HEK293 synchronisé montrent que leur efficacité varie en fonction du rythme circadien et qu’elle est meilleure lorsque les activités du protéasome sont minimales. Ces résultats suggèrent que le protéasome puisse être une nouvelle cible pour la chronothérapie. / Proteasome and immunoproteasome have three different catalytic activities, and degrade a wide variety of proteins. Their central role in many pathways such as control of cellular and circadian cycles, regulation of the defense pathways against stress make them major targets in the aging process and in the treatment of cancer. Also, the link between the circadian clock and antioxidant defenses suggests that the redox homeostasis of proteins and their removal by the proteasome could be modulated by the circadian clock.Studying non-covalent and bivalent proteasome inhibitors showed that targeting two active sites at the same time results in increasing their efficiency and selectivity. We also carried out the evaluation of the cell penetration of these molecules using non-covalent fluorescent probes designed in the laboratory.We have shown that the peptidase activities of proteasome exhibit circadian rhythmicity in antiphase with protein carbonyl intracellular content. The circadian expression of NRF2 and PA28 activator can explain this stimulation of proteasome activity. Moreover, in contrast to young fibroblasts, no circadian modulation of the proteasome and the level of ROS have been observed in senescent fibroblasts.Preliminary results obtained with our inhibitors on the synchronized HEK293 cell model suggest that their effectiveness varies depending on the circadian rhythm and they are more efficient when proteasome activities are minimal. These results suggest that the proteasome could be a new target for chronotherapy.

Les activités de recherche présentées dans ce document s'articulent en deux parties distinctes. La première partie concerne des travaux réalisés au sein de l'équipe du Pr Guy Serre, à la faculté de Médecine Purpan et portant sur la caractérisation des antigènes cibles d'auto-anticorps associés à une maladie auto-immune, la polyarthrite rhumatoïde. La seconde partie, réalisée au sein de l'Unité Mixte CNRS-Pierre Fabre dirigée par le Pr Jean-Edouard Gairin, est centrée sur l'étude d'un système biologique impliqué dans la dégradation des protéines intracellulaires, le système ubiquitine-protéasome et pouvant générer des cibles d'intérêt thérapeutique dans le domaine du cancer.<br /> <br />1. La polyarthrite rhumatoïde et les auto-anticorps anti-protéines citrullinées :<br /><br />La polyarthrite rhumatoïde est une maladie auto-immune d'étiologie inconnue, caractérisée par une inflammation chronique et destructive des articulations synoviales. Le processus auto-immun rhumatoïde fait l'objet d'intenses recherches et bien que des progrès importants aient été réalisés dans la compréhension de certains mécanismes immuno-pathologiques mis en jeu, il n'a pas été possible d'identifier un élément unique comme responsable du processus inflammatoire auto-immun. Il est donc communément admis aujourd'hui que c'est la combinaison de divers facteurs qui détermine l'apparition et l'entretien de la maladie. <br />La présence dans le sérum des patients, d'anticorps décrits pour leur marquage du Stratum Corneum (ou couche cornée) de l'épithélium d'œsophage de rat et de l'épiderme humain, s'est avérée comme une caractéristique suffisamment fréquente et spécifique de la maladie rhumatoïde pour qu'on puisse les suspecter de jouer un rôle significatif dans les processus responsables de l'inflammation articulaire chronique. Afin de mieux comprendre le rôle joué par ces auto-anticorps qualifiés alors d'anticorps « anti-kératines » dans la pathogénie rhumatoïde, il était essentiel d'identifier leur cible antigénique. L'analyse par immunotransfert, à l'aide de sérums rhumatoïdes, d'extraits d'épithélium d'œsophage de rat a permis de détecter, comme cibles murines des auto-anticorps, trois antigènes solubles dans des tampons de faible force ionique. Ces trois protéines ne correspondent pas à des cytokératines mais à de nouvelles protéines spécifiques des étapes tardives du programme de différenciation de l'épithélium d'œsophage de rat. D'autre part, l'antigène ciblé dans l'épiderme humain a été identifié à un variant acide de la filaggrine, protéine jouant un rôle physiologique dans l'agrégation des filaments de kératines de l'épiderme. Ces formes acides sont générées in situ par modification post-traductionnelle des résidus arginine basiques en résidus citrulline par une enzyme, la peptidyl arginine déiminase, exprimée dans l'épiderme. Cette modification a pu être reproduite in vitro après action de la peptidyl-arginine déiminase (PAD) sur divers polypeptides dérivés de la séquence de la filaggrine et il a été ainsi montré que les épitopes reconnus par les auto-anticorps pouvaient être générés par la déimination post-traductionnelle des filaggrines.<br /> Toutefois, la filaggrine n'étant pas exprimée dans les tissus osseux et synoviaux, nous avons recherché une cible articulaire de ces anticorps portant des épitopes déiminés et immunologiquement apparentée à la filaggrine. Ayant à disposition des tissus synoviaux provenant d'une série de patients, deux protéines, p55-61 et p64-78, portant toutes deux des résidus citrullines ont été extraites des membranes synoviales et reconnues spécifiquement par les sérums rhumatoïdes; ces protéines ont été identifiées aux chaînes a et b de la fibrine. Le fait que ces deux protéines ne soient ciblées par les sérums rhumatoïdes qu'après déimination par une PAD, soulignait soulignait le rôle émergent d'une « immunité anti-citrulline » reconnue aujourd'hui comme pouvant être à la base de certains dérèglements impliqués dans diverses maladies auto-immunes.<br /><br />2- Le système ubiquitine-protéasome et ses implications dans le cancer :<br /><br />Le protéasome est un complexe multicatalytique présent dans le cytoplasme et le noyau de toutes les cellules eucaryotes. Il constitue la machinerie protéolytique de la voie ubiquitine-protéasome, voie majeure responsable de la dégradation des protéines intracellulaires. Cette voie détermine la durée de vie et la concentration de nombreuses enzymes et protéines régulatrices dont beaucoup jouent un rôle dans les processus de cancérisation.<br /> Afin de mieux connaître le fonctionnement de cette machinerie protéolytique, nous avons étudié les mécanismes moléculaires intervenant dans la régulation du protéasome 20S qui constitue le cœur catalytique du système. L'analyse protéomique du protéasome 20S préparé à partir de cellules humaines non pathologiques a permis l'identification de l'ensemble des sous-unités constitutives du protéasome 20S et a révélé l'existence de modifications post-traductionnelles de type phosphorylation. Deux nouvelles sous-unités phosphorylées , les sous-unités b2 et b7, ont pu être identifiées posant ainsi la question du rôle joué par ces phosphorylations dans la régulation fonctionnelle du protéasome 20S. <br /> L'analyse similaire des protéasomes exprimés dans diverses lignées tumorales a révélé une complexité structurale importante avec en particulier la co-expression de deux formes de protéasomes : le protéasome dit standard et l'immunoprotéasome. L'étude fonctionnelle de ces protéasomes a montré une sensibilité différente de ces deux formes à certaines molécules de la chimiothèque de substances naturelles purifiées dans l'UMS de Chimie CNRS-Pierre Fabre. En accord avec ceci, l'analyse comparative des protéasomes présents dans les cellules normales comparées à ceux présents dans les cellules tumorales d'un même patient a confirmé la surexpression de l'immunoprotéasome dans les cellules cancéreuses. Le système ubiquitine-protéasome est un système cellulaire particulièrement sensible aux facteurs micro-environnementaux et l'induction de l'immunoprotéasome témoigne de ce processus. Dans ce contexte, nos résultats font émerger la question de l'impact de l'immunoprotéasome sur la dérégulation du système ubiquitine-protéasome dans la cellule tumorale. Afin de répondre à cette question, des lignées de lymphomes surexprimant l'immunoprotéasome ont été développées ainsi que des substrats peptidiques fluorescents spécifiques de l'immunoprotéasome ou du protéasome.<br />Outre une meilleure connaissance de cette machinerie protéolytique, la continuité de ce travail devrait aboutir à l'identification de nouveaux agents pharmacologiques anti-tumoraux. Enfin, il s'intègre pleinement dans la logique de l'UMR 2587 CNRS-Pierre Fabre en témoignant d'un effort de recherche focalisé sur des systèmes biologiques pouvant générer des cibles d'intérêt thérapeutique dans le domaine du cancer.

Le protéasome (CP) contrôle la majorité des fonctions cellulaires par la dégradation des protéines intracellulaires. En plus d’exprimer le CP, les vertébrés expriment également l’immunoprotéasome (IP), caractérisé par des préférences de dégradation distinctes. Le rôle le mieux caractérisé pour l’IP est la génération d’antigènes adaptés pour la liaison au complexe majeur d’histocomptabilité de classe I (CMH-I). Cependant, les nombreux phénotypes observés au niveau de cellules déficientes en IP ou avec une mutation révèlent que l’IP influence des fonctions immunitaires indépendamment de la génération d’antigènes et peut atténuer le stress présent au niveau de cellules non-immunitaires. L’objectif de cette thèse était de caractériser les rôles de l’IP qui ne sont pas reliés à la génération d’antigènes associés au CMH-I. L’analyse du transcriptome de cellules dendritiques IP-déficientes en cours de maturation révèle que l’IP affecte l’expression de plus de 8 000 transcrits. L’IP affecte l’expression génique principalement au niveau transcriptionnel en contrôlant l’abondance de régulateurs de transcriptions tels que NF-κB et les membres des familles IRF et STAT. Les cellules dendritiques IP-déficientes sont également moins efficaces pour activer des lymphocytes T CD8+, même chargées artificiellement avec des quantités optimales d’antigènes associés au CMH-I. En outre, nos études montrent que l’IP est fortement exprimé au niveau de cellules de patients atteints de leucémie myéloïde aigue. L’expression de l’IP est intrinsèque aux leucémies, puisque qu’elle n’est pas corrélée à la présence de lymphocytes sécréteurs d’IFN-γ. De plus, l’expression d’IP est particulièrement élevée au niveau de leucémies monocytaires et/ou possédant un réarrangement MLL. Notamment, des analyses de corrélation montrent que l’IP est connecté à des gènes impliqués dans le métabolisme, l’activité mitochondriale et la réponse au stress. En effet l’inhibition de la sous-unité PSMB8 de l’IP mène à l’accumulation de protéines ubiquitinées et la mort de cellules leucémiques monocytaires. Globalement, nos travaux montrent que le rôle de l’IP n’est pas limité à la génération d’antigènes, mais qu’il peut contrôler l’expression génique et la survie des leucémies. / By regulating protein degradation, constitutive proteasomes (CP) control practically all cellular functions. In addition to CP, vertebrates express immunoproteasomes (IP), which display distinct substrate preferences. The first non-redundant role ascribed to IP is its enhanced ability to generate MHC I-associated antigens. However, deletion or inhibition of IP subunits can affect several immune cell functions independently of MHC-I antigen generation. Moreover, recent work has shown that IP can be expressed in non-immune cells to deal with cell stress. Thus, we wished to investigate the roles of IP that are not related to antigen generation and that are not redundant with the CP. Based on profiling of WT and IP-deficient maturing mouse dendritic cells (DCs), we report that IP regulate the expression of more than 8,000 transcripts. The broad impact of IP on gene expression is cell-autonomous, mediated mainly at the transcriptional level, and involves major signaling pathways including IRFs, NF-kB and STATs. Moreover, even when engineered to present optimal amounts of antigenic peptides, IP-deficient DCs are inefficient for in vivo T-cell priming. In addition, consistent with the fact that cancer cells endure proteotoxic stress, we report that acute myeloid leukemia (AML) cells from patients express high levels of IP genes. Expression of IP genes in AML is a cell-autonomous and IFN-independent feature that correlates with the methylation status of IP genes, and is particularly high in AML with a monocytic phenotype and/or MLL rearrangement. Notably, IP inhibition leads to accumulation of polyubiquitinated proteins and cell death in IPhigh but not IPlow AML cells. Co-clustering analysis reveals that genes correlated with IP subunits in monocytic AMLs are primarily implicated in cell metabolism and proliferation, mitochondrial activity and stress responses. Overall, our studies show that the role of IP is not limited to antigen processing and reveals major non-redundant roles for IP in transcription regulation and resistance to cell stress in AML.

Le système ubiquitine-protéasome est le principal mécanisme par lequel les protéines intracellulaires sont dégradées. Le protéasome dit constitutif (PC) est donc essentiel à l’homéostasie mais aussi à la régulation de la majorité des processus cellulaires importants. La découverte d’un deuxième type de protéasome, appelé immunoprotéasome (IP), soulève toutefois de nouvelles questions. Pourquoi existe-t-il plus d’un type de protéasome ? L’IP a-t-il des rôles redondants ou complémentaires avec le PC ? L’IP étant présent principalement dans les cellules immunitaires ou stimulées par des cytokines, plusieurs groupes ont tenté de définir son rôle dans la réponse immunitaire. Or, l’implication de son homologue constitutif dans un éventail de processus non spécifiquement immunitaires nous laisse croire que l’IP pourrait lui aussi avoir un impact beaucoup plus large. L’objectif de cette thèse était donc de caractériser certains rôles cellulaires de l’IP dans les cellules dendritiques. Nous avons d’abord étudié l’impact global de l’IP sur la présentation antigénique de classe I. Ce faisant, nous avons pu déterminer ses deux contributions principales, soit l’augmentation drastique du nombre et de la diversité des peptides présentés sur les complexes majeurs d’histocompatibilité de classe I. Les différences de clivage entre le PC et l’IP pourraient expliquer en partie cette diversité du répertoire peptidique, notamment par l’affinité apparente de l’IP pour les régions protéiques non structurées. Dans un deuxième temps, nous avons dévoilé un nouveau rôle de l’IP sur un processus dépassant le cadre immunitaire : la transcription. Nous avons découvert que l’IP modifie l’abondance des ARNm en agissant principalement au niveau de leur synthèse. L’impact de l’IP sur le transcriptome est majeur et serait dû en partie à une dégradation différente de facteurs de transcription des familles IRF, STAT et NF-kB. Les cellules dendritiques IP-déficientes activent moins efficacement les lymphocytes T CD8+ et nous croyons que cette défaillance est causée (du moins en partie) par la perturbation transcriptomique provoquée par l’absence d’IP. Il importe donc de comprendre les différents rôles moléculaires de l’IP afin de mieux définir sa contribution globale au fonctionnement de la cellule et comprendre l’avantage évolutif, au niveau de l’organisme, procuré par une telle plasticité du système ubiquitine-protéasome. / The ubiquitin-proteasome system is the major mechanism by which intracellular proteins get degraded. Constitutive proteasomes (CPs) are thus essential for cellular homeostasis but also to regulate the majority of important cellular processes. However, the discovery of a second type of proteasome, named immunoproteasome (IP), raises new questions. Why are there more than one type of proteasome? Does the IP perform redundant or complementary roles with the CP? The IP is predominantly expressed in immune or cytokine-stimulated cells and several groups worked at defining its role during the immune response. Yet, the implication of its constitutive homolog in a variety of processes suggests that the IP may also have a much broader impact. The objective was to characterize cellular roles of the IP in dendritic cells. We first studied the global impact of the IP on class I antigen presentation. We discovered that the IP drastically increases the number and the diversity of peptide presented by class I major histocompatibility complexes. Cleavage differences between the CP and the IP are likely part of the explanation for this peptide repertoire diversity, notably due to IP’s apparent affinity for unstructured protein regions. Second, we discovered a new role for the IP in a process unrestricted to the immune system: transcription. We found that the IP affects transcript abundance mostly at the level of mRNA synthesis. The impact of IPs on the transcriptome is major and would be partly based on a different degradation of IRF, STAT and NF-kB transcription factor family members by the two types of proteasomes. IP-deficient dendritic cells are less potent activators of CD8+ T cells and we believe that this defect is at least partly caused by the transcriptome alterations induced by the absence of IPs. It is therefore important to understand the different molecular roles of the IP in order to better define its global contribution to cellular functions and to understand the evolutionary advantage, at the level of the organism, brought by such plasticity of the ubiquitin- proteasome system.

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Le système ubiquitine-protéasome est le principal mécanisme par lequel les protéines intracellulaires sont dégradées. Le protéasome dit constitutif (PC) est donc essentiel à l’homéostasie mais aussi à la régulation de la majorité des processus cellulaires importants. La découverte d’un deuxième type de protéasome, appelé immunoprotéasome (IP), soulève toutefois de nouvelles questions. Pourquoi existe-t-il plus d’un type de protéasome ? L’IP a-t-il des rôles redondants ou complémentaires avec le PC ? L’IP étant présent principalement dans les cellules immunitaires ou stimulées par des cytokines, plusieurs groupes ont tenté de définir son rôle dans la réponse immunitaire. Or, l’implication de son homologue constitutif dans un éventail de processus non spécifiquement immunitaires nous laisse croire que l’IP pourrait lui aussi avoir un impact beaucoup plus large. L’objectif de cette thèse était donc de caractériser certains rôles cellulaires de l’IP dans les cellules dendritiques. Nous avons d’abord étudié l’impact global de l’IP sur la présentation antigénique de classe I. Ce faisant, nous avons pu déterminer ses deux contributions principales, soit l’augmentation drastique du nombre et de la diversité des peptides présentés sur les complexes majeurs d’histocompatibilité de classe I. Les différences de clivage entre le PC et l’IP pourraient expliquer en partie cette diversité du répertoire peptidique, notamment par l’affinité apparente de l’IP pour les régions protéiques non structurées. Dans un deuxième temps, nous avons dévoilé un nouveau rôle de l’IP sur un processus dépassant le cadre immunitaire : la transcription. Nous avons découvert que l’IP modifie l’abondance des ARNm en agissant principalement au niveau de leur synthèse. L’impact de l’IP sur le transcriptome est majeur et serait dû en partie à une dégradation différente de facteurs de transcription des familles IRF, STAT et NF-kB. Les cellules dendritiques IP-déficientes activent moins efficacement les lymphocytes T CD8+ et nous croyons que cette défaillance est causée (du moins en partie) par la perturbation transcriptomique provoquée par l’absence d’IP. Il importe donc de comprendre les différents rôles moléculaires de l’IP afin de mieux définir sa contribution globale au fonctionnement de la cellule et comprendre l’avantage évolutif, au niveau de l’organisme, procuré par une telle plasticité du système ubiquitine-protéasome. / The ubiquitin-proteasome system is the major mechanism by which intracellular proteins get degraded. Constitutive proteasomes (CPs) are thus essential for cellular homeostasis but also to regulate the majority of important cellular processes. However, the discovery of a second type of proteasome, named immunoproteasome (IP), raises new questions. Why are there more than one type of proteasome? Does the IP perform redundant or complementary roles with the CP? The IP is predominantly expressed in immune or cytokine-stimulated cells and several groups worked at defining its role during the immune response. Yet, the implication of its constitutive homolog in a variety of processes suggests that the IP may also have a much broader impact. The objective was to characterize cellular roles of the IP in dendritic cells. We first studied the global impact of the IP on class I antigen presentation. We discovered that the IP drastically increases the number and the diversity of peptide presented by class I major histocompatibility complexes. Cleavage differences between the CP and the IP are likely part of the explanation for this peptide repertoire diversity, notably due to IP’s apparent affinity for unstructured protein regions. Second, we discovered a new role for the IP in a process unrestricted to the immune system: transcription. We found that the IP affects transcript abundance mostly at the level of mRNA synthesis. The impact of IPs on the transcriptome is major and would be partly based on a different degradation of IRF, STAT and NF-kB transcription factor family members by the two types of proteasomes. IP-deficient dendritic cells are less potent activators of CD8+ T cells and we believe that this defect is at least partly caused by the transcriptome alterations induced by the absence of IPs. It is therefore important to understand the different molecular roles of the IP in order to better define its global contribution to cellular functions and to understand the evolutionary advantage, at the level of the organism, brought by such plasticity of the ubiquitin- proteasome system.