In der tropischen Rinderproduktion ist Botulismus eine zu hohen Verlusten führende Seuche. In Brasilien gehört Botulismus neben Tollwut und Pflanzenvergiftungen zu den drei verlustreichsten Erkrankungen adulter Rinder. Während in Ländern wie Australien oder Südafrika Botulismus gut kontrollierbar geworden ist, werden in Brasilien die Verluste auf etwa 1% des gesamten brasilianischen Rinderbestandes pro Jahr geschätzt. Da Impfstoffe selbst in entlegenen Regionen erhältlich sind, sollen mit der vorliegenden Arbeit Gründe für die anhaltend hohen Verluste untersucht werden. Die Arbeit untersucht dazu drei unterschiedliche Bereiche: -Die Tierhalterbefragung, bei der geklärt werden sollte, welche Maßnahmen zum Schutz vor Botulismus ergriffen werden. -Die bakteriologische Untersuchung, mit der die in Brasilien vorherrschenden C.-botulinum-Typen bestimmt werden sollten. -Die Impfstoffkontrolle, mit der kommerziell erhältliche Impfstoffe auf ihre Wirksamkeit untersucht werden sollten. Es wurden folgende Ergebnisse erzielt: -Die Tierhalterbefragung zeigte, dass die Prävention durch geeignete Managementmaßnahmen nur eine untergeordnete Rolle spielt. Die Tierbesitzer beschränken sich weitgehend auf die Bekämpfung der bereits ausgebrochenen Erkrankung. Plötzliche Ausbrüche mit hohen Tierverlusten werden dabei in Kauf genommen. -Die bakteriologische Untersuchung ergab, dass C und D die überwiegend vorherrschenden Typen von C. botulinum sind. Bivalente Impfstoffe dagegen wären also potentiell wirksam. Andere endemische Typen, wie der nachgewiesene Typ A, würden dabei allerdings nicht mit abgedeckt. -Die Untersuchung der Impfstoffe zeigte erhebliche Unterschiede zwischen den einzelnen untersuchten Vakzinen in der Höhe der gebildeten Antikörper und in der Persistenz eines hohen Antikörperspiegels. Das gewählte Testsystem ELISA erwies sich dabei als nur bedingt geeignet. Der Immunoblot konnte die im ELISA gefundenen Ergebnisse bestätigen, zeigte aber auch die Schwächen des ELISA auf. Abschließend konnte gezeigt werden, dass die Verluste durch Botulismus weitgehend auf Mängel im Management zurückzuführen sind. Diese sind insbesondere das Fehlen einer Botulismusimpfung im Standardprogramm des Betriebsmanagements. Dazu kommen die Verfütterung kontaminierter Futtermittel und die unzureichende Beseitigung von verendeten Rindern. / Botulism is a disease, which still causes high losses in tropical cattle production systems. In Brazil botulism shows next to rabies and plant poisonings the highest mortalities in adult cattle, whereas in countries like Australia or South Africa botulism has to some extend come under control. Estimated losses in Brazil are in the range of 1 % p.a. of the total cattle population. Since even in remote areas vaccines are available the goal of this investigation was to identify causes for continual high losses. The study is based on three different areas of investigation: -A field survey in order to identify effective management measures to protect cattle against botulism. -A bacteriological analysis to identify the main endemic types of C. botulinum. -A study of the efficacy of commercially available vaccines. Results were as follows: -The field survey showed that preventive herd management is practically only of secondary importance. Cattle owners restrict their activities mainly on the treatment of clinical cases, while outbreaks with high losses of animals are widely tolerated. -The bacteriological analysis showed that the predominant types of C. botulinum are C and D. Therefore bivalent vaccines against these types could be effective. Other existing types, e. g. type A, which was found in one case, would not be covered. -The efficacy of vaccines showed considerable differences regarding production of antibodies and persistence of a high level of protection between the different tested vaccines. As a tool for testing the ELISA proved to be only partly suitable. An additional immunoblot confirmed the ELISAs result, but showed also its shortcomings. Finally it is discussed that losses due to botulism result extensively from deficiencies in herd management. These are especially the absence of a systematic vaccination program against botulism integrated into the regular herd management, furthermore, the use of contaminated feeds like poultry droppings, and an ineffective removal of carcasses and carrion.

Die Detektion sogenannter Vitalitäts-assoziierte molekularer Muster (vita-PAMPs), signalisiert dem Immunsystem die Präsenz lebender Mikroorganismen und ruft verstärkte Immunantworten hervor. Die vorliegende Studie untersuchte die Erkennung bakterieller Vitalität durch humane Antigen-präsentierenden Zellen (APC), sowie die Effekte auf die adaptive Immunität. Transkriptomanalysen von humanen Monozyten zeigten eine selektive transkriptionelle Antwort auf lebendige im Vergleich zu hitzegetöteten Bakterien. Die inflammatorischen Zytokine IL-12 und TNF wurden nahezu ausschließlich in Reaktion auf lebende Bakterien exprimiert. Die Detektion bakterieller Vitalität ist in Menschen, Schweinen, Mäusen und Fischen konserviert. In Mäusen wurde bakterielle RNA als bakterielles vita-PAMP identifiziert. In menschlichen Monozyten führte die Supplementierung toter Bakterien mit bakterieller RNA oder mit synthetischen Liganden des Toll-like-Rezeptors (TLR) 7 und TLR8, jedoch nicht mit anderen TLR-Liganden, zur Rekonstitution der TNF- und IL-12-Antwort. Umgekehrt hemmte silencing von TLR8- vita-PAMP-induzierte Zytokinproduktion. T-follikuläre Helferzellen (TFH) spielen eine zentrale Rolle in der Initiierung humoraler Immunantworten. Hier wurde die Erkennung lebender Bakterien, bakterieller RNA oder synthetischer TLR8-Liganden durch APC als Stimulus für robuste TFH-Zelldifferenzierung identifiziert. Die TFH-Differenzierung ist abhängig von der Erkennung bakterieller RNA über TLR8 und der Produktion von IL-12. Immunisierung von Schweinen mit einem bakteriellen Lebendimpfstoff löste deutlich robustere TFH-Zell- und Antikörperreaktionen als eine Immunisierung mit der hitzegetöteten Version des gleichen Impfstoffs aus. Zusammenfassend haben wir TLR8 als den ersten bekannten vita-PAMP-Rezeptor identifiziert und seine zentrale Rolle für TLR8-vermittelte “Vitalitätserkennung” für die Induktion von TFH-Zellen und Impfreaktionen demonstriert. / The detection of the so-called vitality-associated molecular patterns (vita-PAMPs) signals to the immune system the presence of living microorganisms and triggers an increased immune response. The present study investigated the detection of bacterial vitality by human antigen-presenting cells (APC), as well as the effects of this recognition events on adaptive immunity. Transcriptome analysis of human monocytes showed a selective transcriptional response to live versus heat-killed bacteria. Among others, the inflammatory cytokines IL-12 and TNF were expressed almost exclusively in response to live bacteria. Moreover, the detection of bacterial vitality is conserved in humans, pigs, mice and fish. In mice, bacterial RNA was identified as a bacterial vita-PAMP. In human monocytes, supplementation of dead bacteria with bacterial RNA or with synthetic ligands of toll-like receptor (TLR) 7 and TLR8, but not with other TLR ligands, resulted in the reconstitution of the TNF and IL-12 responses. Conversely, silencing of TLR8 inhibited vita-PAMP-dependent cytokine production. T-follicular helper cells (TFH) play a central role in the initiation of humoral immune responses. Here, the recognition of living bacteria, bacterial RNA or synthetic TLR8 ligands by APCs was identified as a stimulus for robust TFH cell differentiation. TFH differentiation is dependent on the recognition of bacterial RNA via TLR8 and the production of IL-12. Immunization of pigs with a live bacterial vaccine elicited significantly more robust TFH cell and antibody responses than immunization with the heat-killed version of the same vaccine. In summary, we identified TLR8 as the first known vita-PAMP receptor in human and demonstrated its pivotal role in TLR8-mediated “viability recognition” for the induction of TFH cells and vaccine reactions.

In der tropischen Rinderproduktion ist Botulismus eine zu hohen Verlusten führende Seuche. In Brasilien gehört Botulismus neben Tollwut und Pflanzenvergiftungen zu den drei verlustreichsten Erkrankungen adulter Rinder. Während in Ländern wie Australien oder Südafrika Botulismus gut kontrollierbar geworden ist, werden in Brasilien die Verluste auf etwa 1% des gesamten brasilianischen Rinderbestandes pro Jahr geschätzt. Da Impfstoffe selbst in entlegenen Regionen erhältlich sind, sollen mit der vorliegenden Arbeit Gründe für die anhaltend hohen Verluste untersucht werden. Die Arbeit untersucht dazu drei unterschiedliche Bereiche: -Die Tierhalterbefragung, bei der geklärt werden sollte, welche Maßnahmen zum Schutz vor Botulismus ergriffen werden. -Die bakteriologische Untersuchung, mit der die in Brasilien vorherrschenden C.-botulinum-Typen bestimmt werden sollten. -Die Impfstoffkontrolle, mit der kommerziell erhältliche Impfstoffe auf ihre Wirksamkeit untersucht werden sollten. Es wurden folgende Ergebnisse erzielt: -Die Tierhalterbefragung zeigte, dass die Prävention durch geeignete Managementmaßnahmen nur eine untergeordnete Rolle spielt. Die Tierbesitzer beschränken sich weitgehend auf die Bekämpfung der bereits ausgebrochenen Erkrankung. Plötzliche Ausbrüche mit hohen Tierverlusten werden dabei in Kauf genommen. -Die bakteriologische Untersuchung ergab, dass C und D die überwiegend vorherrschenden Typen von C. botulinum sind. Bivalente Impfstoffe dagegen wären also potentiell wirksam. Andere endemische Typen, wie der nachgewiesene Typ A, würden dabei allerdings nicht mit abgedeckt. -Die Untersuchung der Impfstoffe zeigte erhebliche Unterschiede zwischen den einzelnen untersuchten Vakzinen in der Höhe der gebildeten Antikörper und in der Persistenz eines hohen Antikörperspiegels. Das gewählte Testsystem ELISA erwies sich dabei als nur bedingt geeignet. Der Immunoblot konnte die im ELISA gefundenen Ergebnisse bestätigen, zeigte aber auch die Schwächen des ELISA auf. Abschließend konnte gezeigt werden, dass die Verluste durch Botulismus weitgehend auf Mängel im Management zurückzuführen sind. Diese sind insbesondere das Fehlen einer Botulismusimpfung im Standardprogramm des Betriebsmanagements. Dazu kommen die Verfütterung kontaminierter Futtermittel und die unzureichende Beseitigung von verendeten Rindern. / Botulism is a disease, which still causes high losses in tropical cattle production systems. In Brazil botulism shows next to rabies and plant poisonings the highest mortalities in adult cattle, whereas in countries like Australia or South Africa botulism has to some extend come under control. Estimated losses in Brazil are in the range of 1 % p.a. of the total cattle population. Since even in remote areas vaccines are available the goal of this investigation was to identify causes for continual high losses. The study is based on three different areas of investigation: -A field survey in order to identify effective management measures to protect cattle against botulism. -A bacteriological analysis to identify the main endemic types of C. botulinum. -A study of the efficacy of commercially available vaccines. Results were as follows: -The field survey showed that preventive herd management is practically only of secondary importance. Cattle owners restrict their activities mainly on the treatment of clinical cases, while outbreaks with high losses of animals are widely tolerated. -The bacteriological analysis showed that the predominant types of C. botulinum are C and D. Therefore bivalent vaccines against these types could be effective. Other existing types, e. g. type A, which was found in one case, would not be covered. -The efficacy of vaccines showed considerable differences regarding production of antibodies and persistence of a high level of protection between the different tested vaccines. As a tool for testing the ELISA proved to be only partly suitable. An additional immunoblot confirmed the ELISAs result, but showed also its shortcomings. Finally it is discussed that losses due to botulism result extensively from deficiencies in herd management. These are especially the absence of a systematic vaccination program against botulism integrated into the regular herd management, furthermore, the use of contaminated feeds like poultry droppings, and an ineffective removal of carcasses and carrion.

Malaria Impfstoffkandidaten, welche Sicherheit und Wirksamkeit gegen prä-erythrozytische Stadien bieten, sind nach wie vor in der Entwicklung. Experimentelle Immunisierungsstudien mit genetisch attenuierten Parasiten (GAP), welche die Entwicklung über das klinisch asymptomatische Leberstadium hinaus verhindern, erwiesen sich als sicher und effizient. ΔSLARP GAP-Sporozoiten arretieren vollständig in der Leber, bieten jedoch keinen langanhaltenden Schutz. Hingegen zeigen Immunisierungen mit ΔP36p/P36 Sporozoiten einen langanhaltenden Schutz, führen jedoch während der Immunisierung gelegentlich zu Blutstadieninfektionen. Diese Studie liefert eine systematische vorklinische Bewertung eines dreifachen KO GAP-Parasiten, durch die Kombination von ΔSLARP und ΔP36p/P36. KO Parasiten arretierten vollständig in vitro und in vivo, aber der zeitnahe Blutinfektionsbeginn nach einer Sporozoiteninfektion in Mäusen zeigte eine verminderte Wirksamkeit des Impfstoffs. Während ein besserer Schutz durch einen späten Leberstadien Entwicklungsstillstand erreicht werden kann, bleiben die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen unklar. Eine Vorrausetzung für die Leberzellen Antigenpräsentation ist die Präsenz von parasitären Antigenen im hepatozyten Zytoplasma. Der Proteinexportkomplex PTEX ist in Leberstadien nicht vollständig funktionstüchtig, da das essentielle Hitzeschockprotein 101 (HSP101) nicht exprimiert wird. Um die Rolle von HSP101 für den Leberproteinexport zu klären, wurden transgene HSP101 exprimierende Parasiten erzeugt. Transgene Parasiten weisen in vitro und in vivo schwere Wachstumsstörungen im Leberstadium auf und bieten keinen Impfschutz. Die Ergebnisse legen nahe, dass die Expression von HSP101 streng kontrolliert wird und der Export im frühen Leberstadien nicht wiederhergestellt werden kann. Insgesamt können prä-klinische Studien und die Weiterentwicklung von GAP-basierten Impfstoffkandidaten die laufenden humanen Impfstoffstudien beeinflussen und vorantreiben. / Malaria vaccine candidates providing both safety and efficacy against pre-erythrocytic stages remain largely elusive. Experimental immunizations with live genetically attenuated parasites (GAPs) preventing the development beyond the clinically silent liver stage have proven safe and efficacious. GAP vaccine candidate ΔSLARP, provides the most robust life cycle arrest, however, immunizations do not elicit long-lasting immunity. In contrast, ΔP36p/P36 sporozoites elicit long-lasting immunity, but lead to breakthrough infections during immunizations. This study gives a systematic pre-clinical evaluation of a triple knockout (tKO) GAP by combining ΔSLARP and ΔP36p/P36. Complete arrest of tKO parasites in cultured hepatoma cells and sporozoite-infected mice was confirmed, but time to blood infection after a sporozoite challenge revealed reduced efficacy of the tKO vaccine. While superior immunity can be achieved by a late developmental arrest at liver-to-blood stage conversion, the underlying molecular mechanisms remain elusive. An important question is whether parasite antigens are exposed to the hepatocyte cytoplasm. Protein translocation into the host cell cytoplasm mediated by PTEX, a protein translocon, is absent during liver stage maturation as a core component of PTEX, Heat-shock-protein 101 (HSP101), is not expressed. To clarify the role of HSP101 in liver stage protein export transgenic HSP101 expressing Plasmodium berghei parasites were generated. Parasites expressing elevated levels of HSP101 show severe liver stage growth defects in vitro and in vivo, lack early liver stage export and inferior protection in immunized animals. Our results suggest that HSP101 expression is tightly controlled and PTEX dependent early liver stage export cannot be restored solely by HSP101 overexpression. Overall, pre-clinical analysis and improvement of GAP-based vaccine candidates can inform on-going human vaccine trials and boost malaria vaccine development.

Bisher gibt es keine effektive Impfung gegen Malaria und der beste immunologische Schutz wird durch wiederholte intravenöse Injektion von nicht-vermehrungsfähigen Sporozoiten erreicht. Im Gegensatz dazu bietet die Infektion im Blutstadium nur eine Teilimmunität gegen schwere Verläufe der Krankheit. Um beide Prozesse besser zu verstehen, ist eine tiefgehende Untersuchung der Reaktion des angeborenen Immunsystems auf Sporozoiten, sowie Parasiten im Blutstadium erforderlich. Erkenntnisse hieraus können dabei helfen, die Überlegenheit des Sporozoiten-Impfstoffs zu verstehen und, letztendlich, seine Wirksamkeit in einem sichereren, kostengünstigeren und skalierbaren Impfstoff zu rekapitulieren. Um sterile Sporozoiten aus Mückenprärationen für in-vitro experimente zu gewinnen, wurden die Parasiten FACS sortiert und anschließend mit Makrophagen co-kultivert. RNA Sequenzierung der Makrophagen, zeigte ein von Sporozoiten induziertes Expressionsprofil, das durch die Expression von inflammatorischen Genen gekennzeichnet ist. Insbesondere CD201 wurde auf Makrophagen stark hochreguliert und könnte eine Rolle bei der gamma-delta T-Zell-Aktivierung spielen. Darüber hinaus kann gezeigt werden, dass die Aktivierung von Makrophagen durch Sporozoiten teilweise von TLR2 und MyD88 abhängig ist. Interessanterweise waren die genetischen Signaturen „Reaktion auf Verwundung" und „Makroautophagie" in Makrophagen überrepräsentiert die mit Sporozoiten co-kultiviert wurden und sind wahrscheinlich Folgen von aktiver Sporozoiten-Traversierung durch Makrophagen. In der Tat zeigten Mäuse, die mit Traversierungs-defizienten Sporozoiten geimpft wurden stark reduzierte CD8 T-Zell Antworten. Dies deutet auf eine mögliche Rolle der Zelltraversion bei der Induktion effektiver adaptiver Immunantworten hin. Insgesamt tragen diese Ergebnisse zu dem Verständnis der angeborenen Immunantwort auf Plasmodium-Parasiten bei und bieten weitere Möglichkeiten zur zukünftigen Forschung. / Effective vaccination against malaria remains a critical element in the effort to eradicate the disease. So far, best protection is induced by repeated intravenous injection of irradiated, non-replicating sporozoites. In contrast, blood stage infection only affords semi-immunity after several disease episodes are endured. Therefore, in-depth analyses of innate immune responses to sporozoite and blood stage parasites are needed to understand the superiority of the attenuated sporozoite vaccine and ultimately, to recapitulate its efficacy in a safer, cheaper and more practical vaccine. To probe sporozoite-induced innate cell activation, parasites were flow sorted from salivary gland extracts. In a reductionist system, sorted P. berghei sporozoites were co-cultured with primary mouse macrophages. Transcriptomic analysis of sporozoite-experienced macrophages revealed a distinct expression profile characterized by NF-κB driven expression of inflammatory mediators. In particular, CD201, a CD1d-like transmembrane receptor with lipid presentation capabilities, was strongly upregulated on macrophages and might play a role in gamma-delta T-cell activation. In addition, first evidence is provided that macrophage activation by sporozoites is partly dependent on TLR2 and MyD88. Intriguingly, ‘response to wounding’ and ‘macroautophagy’ signatures were enriched in sporozoite-stimulated macrophages and are likely consequences of active sporozoite traversal through innate cells. Indeed, in vivo vaccination with spect1 knockout sporozoites, which are deficient in cell traversal, induced a defective CD8 T-cell response, showcasing a potential role for cell traversal in the induction of effective adaptive responses. Taken together, these findings open up several interesting avenues for future research which will paint a clearer picture of innate immune responses to Plasmodium parasites.