O sistema imune inato é organizado por processos complexos que envolvem os diversos tipos celulares que culminam na eliminação de uma variedade de microorganismos a fim de proteger o organismo de infecções. Os neutrófilos são células importantes neste sistema, sendo capazes de migrar rapidamente ao foco da infecção. Estas células reconhecem e fagocitam partículas estranhas e atuam no sentido de elimina-los através da produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), proteínas antimicrobianas e enzimas proteolíticas dos grânulos, que são liberadas no fagossomo e no espaço extracelular. Entretanto, em algumas doenças inflamatórias e autoimunes têm sido encontradas lesões nos tecidos envolvendo a produção excessiva de EROs pelos neutrófilos, desencadeada por imunocomplexos (ICs) via receptores Fc gama (Fc) e de complemento (CR). Assim, a modulação da ativação destes receptores e da produção de EROs é importante na manutenção da homeostasia. Nas últimas décadas, flavonóides são considerados como metabólitos secundários promissores mostrando atividade antioxidante e imunomodulatória. Neste trabalho foi avaliado o efeito modulatório dos flavonóides galangina, kaempferol, quercetina e miricetina em algumas funções efetoras de neutrófilos humanos, como o metabolismo oxidativo estimulado via receptores de membrana Fc e/ou CR, fagocitose e atividade microbicida, além do efeito citotóxico, antioxidante e inibitório dessas substâncias sobre a atividade das enzimas mieloperoxidase (MPO) e NADPH oxidase. Os flavonóides analisados mostraram um efeito modulatório negativo no metabolismo oxidativo dos neutrófilos humanos na seguinte ordem: galangina> kaempferol> quercetina > miricetina. Embora a galangina tenha exercido maior atividade, sua ação antioxidante e inibitória na atividade das enzimas MPO e NADPH oxidase foi a menos efetiva dentre os flavonóides avaliados. Além disso, esta substância inibiu de maneira mais acentuada a resposta celular mediada por ambos os receptores Fc e CR quando comparado a estimulação destes receptores individualmente. As substâncias contendo o grupo catecol, quercetina e miricetina mostraram elevada eficiência na inibição da atividade das enzimas NADPH oxidase e MPO, e na redução do radical livre 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH). De maneira geral, os flavonóides não interferiram no processo fagocítico e no mecanismo microbicida, e não induziram toxicidade e morte celular por apoptose ou necrose. Os resultados apresentados neste trabalho mostram uma possível aplicação destes flavonóides como fármacos de origem natural em doenças inflamatórias que apresentem acúmulo de neutrófilos, sendo uma ferramenta promissora para o tratamento efetivo destas doenças. / The innate immune system is composed of complex biological processes involving a variety of cell types that eliminate invading microorganisms to protect the host against infection. Neutrophils are key effector cells of this system, being able to migrate rapidly to infection sites. These cells recognize and engulf foreign particles by phagocytosis, and act to destroy them through production and release of reactive oxygen species (ROS), antimicrobial proteins and proteolytic granule enzymes, which are delivered to the phagossomes and to the extracellular environment. However, tissue damage related to excessive neutrophil ROS production triggered by immune complexes (ICs) via Fc-gamma (FcR) and complement receptors (CR) has been found in some inflammatory and autoimmune diseases. So, modulation of both the activation of these receptors and ROS generation are important to the maintenance of body homeostasis. In the last decades, flavonoids have been considered promising plant secondary metabolites with antioxidant and immunomodulatory activity. This study evaluated the modulator effect of four flavonoids (galangin, kaempferol, quercetin and myricetin) in some human neutrophil effector functions, such as the oxidative metabolism stimulated via FcR and CR classes of membrane receptors, phagocytosis and microbicidal activity, as well as the cytotoxic, antioxidant and inhibitory effect of these compounds in the MPO and NADPH oxidase activity. The flavonoids studied showed a negative modulator effect in the human neutrophils oxidative metabolism in the following ranking order: galangin > kaempferol > quercetin > myricetin. Although galangin had shown the highest activity, it was the least effective antioxidant and inhibitor of MPO and NADPH oxidase activity among the flavonoids tested herein. Furthermore, this compound inhibited more the cellular response mediated by both Fc and CR receptors than by each one of them individually. The flavonoids bearing the catechol group, quercetin and myricetin, had a high efficiency to inhibit NADPH oxidase and MPO activity, as well as to reduce the 2,2-diphenyl-1-picrylhidrazil (DPPH) free radical. In general, the flavonoids did not interfere in the phagocytic process and microbicidal mechanism, and also did not induce toxicity and cell death by apoptosis or necrosis. The group of results presented here provides a possible application of these flavonoids as drugs of natural source in inflammatory diseases with excessive neutrophil infiltration, being a promising tool for an effective treatment of these illnesses.

Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2014-10-14T17:05:51Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Thaís Domingos Meneses - 2013.pdf: 1894235 bytes, checksum: 41d8ee83924f2c998abe4f713c7f8f16 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Silva (jtas29@gmail.com) on 2014-10-16T18:46:31Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Thaís Domingos Meneses - 2013.pdf: 1894235 bytes, checksum: 41d8ee83924f2c998abe4f713c7f8f16 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-16T18:46:31Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Thaís Domingos Meneses - 2013.pdf: 1894235 bytes, checksum: 41d8ee83924f2c998abe4f713c7f8f16 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2013-10-15 / Studies have shown that periodontal disease affects approximately 85 % of dogs older than three years of age, being responsible for inflammation and destruction of the tooth supporting tissues. This study aimed at evaluating the relationship between periodontal disease and glomerulonephritis in dogs. We evaluated and classified 61 dogs with periodontal disease into groups according to the severity of the case. Clinical evaluation consisted of complete blood count, serum biochemistry (urea, creatinine, total protein, albumin, cholesterol and phosphorus), blood pressure measurement, urinalysis and urinary biochemistry (GGT, ALP, protein and creatinine), and determination of urine protein:creatinine ratio. Of the 14 dogs with glomerulonephritis compatible alterations at the first exam, nine were submitted to a second laboratory evaluation, after periodontal treatment, in order to verify if they continued with persistent proteinuria associated with inactive urinary sediment. Of these, eight dogs continued to show abnormalities suggestive of glomerulonephritis, even after periodontal treatment. The diagnostic tools used in this study allowed to identify and characterize both glomerulonephritis secondary to periodontal disease, establishing a relationship between them and tubular damage and urinary tract infections that occur concurrently with periodontal disease. These findings help to establish the use of early markers of kidney injury in clinical laboratory tests, in order to prevent the process evolution, promoting animal welfare and contributing to increase longevity of dogs. / Estudos mostram que a doença periodontal acomete cerca de 85% de cães acima dos três anos de idade, sendo responsável pela inflamação e destruição dos tecidos de sustentação do dente. Este estudo teve como objetivo avaliar a relação existente entre a doença periodontal e a glomerulonefrite em cães. Sessenta e um cães com doença periodontal foram avaliados e classificados em grupos, conforme a gravidade, além da avaliação clínica foram realizados hemograma, bioquímica sérica (ureia, creatinina, proteínas totais, albumina, colesterol e fósforo), mensuração da pressão arterial, urinálise e bioquímica urinária (GGT, ALP, proteína e creatinina), com determinação da razão proteína:creatinina urinária. Dos 14 cães com alterações compatíveis para glomerulonefrite neste primeiro exame, após o tratamento periodontal, nove deles foram submetidos a uma segunda avaliação laboratorial, com o intuito de verificar se continuavam com a proteinúria persistente associado ao sedimento urinário inativo. Destes, oito cães continuaram apresentando alteração sugestiva de glomerulonefrite, mesmo após a realização do tratamento periodontal. As ferramentas de diagnóstico utilizadas em conjunto neste estudo permitiram identificar e caracterizar a glomerulonefrite secundária à doença periodontal, estabelecendo uma relação entre elas, além dos danos tubulares e infecções do trato urinário que ocorrem concomitantemente à doença periodontal. Esse conhecimento auxilia na instituição do uso de marcadores precoces de lesão renal na prática clínica de exames laboratoriais, com a finalidade de impedir a evolução do processo, promovendo bem-estar animal e contribuindo para o aumentando da longevidade dos cães.

O sistema imune inato é organizado por processos complexos que envolvem os diversos tipos celulares que culminam na eliminação de uma variedade de microorganismos a fim de proteger o organismo de infecções. Os neutrófilos são células importantes neste sistema, sendo capazes de migrar rapidamente ao foco da infecção. Estas células reconhecem e fagocitam partículas estranhas e atuam no sentido de elimina-los através da produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), proteínas antimicrobianas e enzimas proteolíticas dos grânulos, que são liberadas no fagossomo e no espaço extracelular. Entretanto, em algumas doenças inflamatórias e autoimunes têm sido encontradas lesões nos tecidos envolvendo a produção excessiva de EROs pelos neutrófilos, desencadeada por imunocomplexos (ICs) via receptores Fc gama (Fc) e de complemento (CR). Assim, a modulação da ativação destes receptores e da produção de EROs é importante na manutenção da homeostasia. Nas últimas décadas, flavonóides são considerados como metabólitos secundários promissores mostrando atividade antioxidante e imunomodulatória. Neste trabalho foi avaliado o efeito modulatório dos flavonóides galangina, kaempferol, quercetina e miricetina em algumas funções efetoras de neutrófilos humanos, como o metabolismo oxidativo estimulado via receptores de membrana Fc e/ou CR, fagocitose e atividade microbicida, além do efeito citotóxico, antioxidante e inibitório dessas substâncias sobre a atividade das enzimas mieloperoxidase (MPO) e NADPH oxidase. Os flavonóides analisados mostraram um efeito modulatório negativo no metabolismo oxidativo dos neutrófilos humanos na seguinte ordem: galangina> kaempferol> quercetina > miricetina. Embora a galangina tenha exercido maior atividade, sua ação antioxidante e inibitória na atividade das enzimas MPO e NADPH oxidase foi a menos efetiva dentre os flavonóides avaliados. Além disso, esta substância inibiu de maneira mais acentuada a resposta celular mediada por ambos os receptores Fc e CR quando comparado a estimulação destes receptores individualmente. As substâncias contendo o grupo catecol, quercetina e miricetina mostraram elevada eficiência na inibição da atividade das enzimas NADPH oxidase e MPO, e na redução do radical livre 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH). De maneira geral, os flavonóides não interferiram no processo fagocítico e no mecanismo microbicida, e não induziram toxicidade e morte celular por apoptose ou necrose. Os resultados apresentados neste trabalho mostram uma possível aplicação destes flavonóides como fármacos de origem natural em doenças inflamatórias que apresentem acúmulo de neutrófilos, sendo uma ferramenta promissora para o tratamento efetivo destas doenças. / The innate immune system is composed of complex biological processes involving a variety of cell types that eliminate invading microorganisms to protect the host against infection. Neutrophils are key effector cells of this system, being able to migrate rapidly to infection sites. These cells recognize and engulf foreign particles by phagocytosis, and act to destroy them through production and release of reactive oxygen species (ROS), antimicrobial proteins and proteolytic granule enzymes, which are delivered to the phagossomes and to the extracellular environment. However, tissue damage related to excessive neutrophil ROS production triggered by immune complexes (ICs) via Fc-gamma (FcR) and complement receptors (CR) has been found in some inflammatory and autoimmune diseases. So, modulation of both the activation of these receptors and ROS generation are important to the maintenance of body homeostasis. In the last decades, flavonoids have been considered promising plant secondary metabolites with antioxidant and immunomodulatory activity. This study evaluated the modulator effect of four flavonoids (galangin, kaempferol, quercetin and myricetin) in some human neutrophil effector functions, such as the oxidative metabolism stimulated via FcR and CR classes of membrane receptors, phagocytosis and microbicidal activity, as well as the cytotoxic, antioxidant and inhibitory effect of these compounds in the MPO and NADPH oxidase activity. The flavonoids studied showed a negative modulator effect in the human neutrophils oxidative metabolism in the following ranking order: galangin > kaempferol > quercetin > myricetin. Although galangin had shown the highest activity, it was the least effective antioxidant and inhibitor of MPO and NADPH oxidase activity among the flavonoids tested herein. Furthermore, this compound inhibited more the cellular response mediated by both Fc and CR receptors than by each one of them individually. The flavonoids bearing the catechol group, quercetin and myricetin, had a high efficiency to inhibit NADPH oxidase and MPO activity, as well as to reduce the 2,2-diphenyl-1-picrylhidrazil (DPPH) free radical. In general, the flavonoids did not interfere in the phagocytic process and microbicidal mechanism, and also did not induce toxicity and cell death by apoptosis or necrosis. The group of results presented here provides a possible application of these flavonoids as drugs of natural source in inflammatory diseases with excessive neutrophil infiltration, being a promising tool for an effective treatment of these illnesses.

Os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes na circulação sanguínea, sendo recrutados rapidamente para os locais de infecção e inflamação. Em condições fisiológicas, os neutrófilos circulantes possuem tempo de vida curto, de cerca de 6 a 8 horas, mas a sua sobrevida pode aumentar em condições inflamatórias. O papel dos neutrófilos em diversas doenças foi negligenciado por muito tempo, em parte devido àsdificuldades em seu estudo e manipulação, pois os mesmos são facilmente ativados e difíceis de serem mantidos em cultura. Nos últimos anos, o advento de novas técnicas e o aprimoramento de condições laboratoriais têm possibilitado uma investigação mais ampla da fisiopatologia dos neutrófilos e revelado a diversidade de funções e interações dessas células. Para dar continuidade aos estudos visando o entendimento de como as funções efetoras dos neutrófilos podem ser moduladas por produtos naturais e sintéticos, e a aplicação desse conhecimento no tratamento de patologias nas quais tais leucócitos participam, o presente trabalho estabeleceu, primeiramente, as condições experimentais para a cultura de neutrófilos humanos. As células mantiveram-se viáveis e em estado de repouso por até 24 horas, tanto em solução balanceada de Hank\'s quanto em meio RPMI. A funcionalidade dos neutrófilos foi avaliada através da sua capacidade de produzir espécies reativas de oxigênio (ERO), medida por quimioluminescência dependente de luminol (QLlum). Diferentemente do meio RPMI, a solução balanceada de Hank\'s não interferiu no ensaio de QLlum, possibilitando a análise da funcionalidade das células. Durante o período de cultura celular de 24 horas, os neutrófilos mantiveram a sua capacidade de produzir ERO em quantidades suficientes para serem detectadas e permitirem a avaliação do efeito inibitório de substâncias antioxidantes. Em seguida, este trabalho avaliou o efeito de dois antioxidantes - a 3-fenilcumarina 6,7-diidroxi-3-(3\',4\'-metilenodioxifenil)-cumarina (C13) e o flavonol galangina - na produção de ERO pelos neutrófilos. Ambas as substâncias inibiram esta função efetora dos neutrófilos durante todo o período de cultura analisado, indicando que as mesmas não foram degradadas a ponto de perderem a sua atividade antioxidante. As condições de cultura padronizadas possibilitaram também a avaliação do efeito da galangina e da C13 na viabilidade celular. Na maior concentração analisada (20 ?M), ambas as substâncias não alteraram a porcentagem de células viáveis (aproximadamente 80%), mas modularam os estágios de sobrevivência dos neutrófilos, reduzindo a porcentagem de células em apoptose e aumentando a porcentagem de células em necrose, principalmente após 18 horas de cultura. Portanto, a solução balanceada de Hank´s é adequada para manter neutrófilos humanos em cultura por até 24 horas, possibilitando a avaliação do efeito de substâncias antioxidantes na produção de ERO por estas células e na sua viabilidade. / Neutrophils are the most abundant leukocytes in blood, which are rapidly recruited to sites of infection and inflammation. Circulating neutrophils have a short lifetime of about 6 to 8 hours under physiological conditions, but their survival can be increased under inflammatory conditions. The role that neutrophils play in various diseases was long neglected, partially due to the difficulties to study and manipulate these cells, which are easy to activate and hard to maintain in culture. In recent years, the development of new techniques and improvement of laboratory conditions have broadened the investigation of neutrophil physiopathology and revealed the variety of functions and interactions of these cells. To continue the studies to understand how the effector functions of neutrophils can be modulated by natural and synthetic products, and to apply such knowledge to treat diseases in which these leukocytes participate, the first part of the present work established the experimental conditions to culture human neutrophils. Cells cultured in either Hank\'s balanced solution or RPMI medium remained viable and in the resting state for up to 24 hours. Neutrophil functionality was evaluated through its ability to produce reactive oxygen species (ROS), assessed by the luminol-enhanced chemiluminescence assay (CL-lum). In contrast to RPMI medium, Hank\'s balanced solution did not interfere in the CL-lum assay and thereby allowed analysis of neutrophil functionality. During the 24-hour cell culture period, neutrophils maintained their capacity to produce ROS in detectable amounts that were sufficient to assess the inhibitory effect of antioxidant compounds. Next, this work examined the effect of two antioxidants - the 3-phenylcoumarin 6,7-dihydroxy-3-[3\',4\'-methylenedioxyphenyl]-coumarin (C13) and the flavonol galangin - on ROS production by neutrophils. Both compounds suppressed this effector function of neutrophils during the whole culture period studied, indicating that they were not degraded to the point of losing their antioxidant activity. The standardized culture conditions also allowed assessing whether galangin and C13 affected cell viability. At the highest concentration tested (20 ?M), both compounds did not alter the cell viability percentage (around 80%) but modulated the neutrophil survival stages by reducing the percentage of apoptotic cells and increasing the percentage of necrotic cells, particularly after 18 hours of culture. Therefore, Hank\'s balanced solution is suitable to culture human neutrophils for up to 24 hours, and enables to assess the effect of antioxidant compounds on neutrophil ROS production and viability.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The definitive diagnosis of strongyloidiasis is normally done by detection of larvae on faecal samples; however, the number of parasites is limited in most cases and the elimination of larvae is irregular. Thus, developing reliable serological methods for the diagnosis of strongyloidiasis becomes imperative. The aim of this study was to establish a coproantigen ,antigen, antibody and immune complex detection by enzyme-linked immunosorbent assay in serum and bronchoalveolar lavage fluid (BALF) samples of non immunosuppressed or immunosuppressed rats experimentally infected with Strongyloides venezuelensis. For kinetics of coproantigen detection (0 and 5, 8, 13 and 21 days post-infection (d.p.i)), we used an anti-L3 polyclonal antibody produced in rabbits. For antigen and immune complex detection in serum and BALF samples (0 and 2, 5, 8, 13 and 21d.p.i), the microtitre plates were coated with IgG anti-S. venezuelensis and with alkaline parasite extract for antibody detection. The statistical analysis were analyzed using Two Way ANOVA, followed by the Bonferroni test. The criterion for statistical significance was set at p<0,05. The number of eggs/g of faeces recovered at 8 d.p.i was significantly higher for non immunosuppressed and immunosuppressed animals (p<0.01). The coproantigen detection was significantly higher at 13° d.p.i in non immunosuppressed (p<0.05) and in immunosuppressed it was anticipated to the 5th d.p.i. It was observed that antigen detection in serum samples was not a good approache for evaluating the infection however in BALF samples it showed superior results. In immunosuppressed animals, IgG specific for S. venezuelensis was preferentially detected during the 5° and 13° d.p.i and in immunosuppressed animals, during the entire experimental kinetics. In BALF samples, antibodies detection was observed from the 8° to the 21° d.p.i in non immunosuppressed animals and in immunosuppressed animals it was anticipatedto the 2° d.p.i, with higher reactivity at 5° d.p.i (p<0.05). The immune complex detection in serum samples of the non immunosuppressed animals was observed from the 5° to the 13° d.p.i and in immunosuppressed animals, during the entire kinetics. In BALF samples, immune complex detection was higher in non immunosuppressed animals. In conclusion, coproantigen and immune complex detection in serum and BALF samples are alternatives for early strongyloidiasis diagnosis, mainly in immunocompromised cases. / O diagnóstico definitivo da estrongiloidíase normalmente é realizado mediante a detecção de larvas nas fezes; porém a quantidade de parasitos é limitada e a eliminação de larvas é reduzida e irregular. Sendo assim, o desenvolvimento de testes sorológicos confiáveis para o diagnóstico da estrongiloidíase torna-se uma alternativa necessária. O objetivo deste estudo foi demonstrar a cinética de detecção de coproantígenos e de antígenos, anticorpos e imunocomplexos circulantes em amostras de soro e de lavado bronco alveolar (LBA) de ratos imunossuprimidos e experimentalmente infectados por Strongyloides venezuelensis. Para a cinética (0 e 5, 8, 13 e 21 dias pós-infecção (d.p.i)) de coproantígenos utilizou-se anticorpo policlonal anti-L3 produzido em coelhos. Para a detecção de antígenos e de imunocomplexos em amostras de soro e de LBA (0 e 2, 5, 8, 13 e 21 d.p.i), placas de microtitulação foram sensibilizadas com IgG anti-S. venezuelensis e com extrato alcalino de larvas para a detecção de anticorpos. A análise estatística foi realizada por Two Way ANOVA, seguida pela teste de Bonferroni, considerando p<0,05 significativo. A cinética de eliminação de ovos/g de fezes mostrou que o pico ocorre no 8° d.p.i sendo significativamente maior nos animais imunossuprimidos (p<0,01). O pico de detecção de coproantígenos nos animais não imunossuprimidos foi no 13° d.p.i (p<0,05), sendo que nos animais imunossuprimidos a detecção foi antecipada para o 5° d.p.i. A detecção de antígeno em amostras de soro não foi uma boa ferramenta diagnóstica para avaliar a infecção enquanto que em amostras de LBA mostrou ser ferramenta auxiliar. A detecção de IgG específica para S. venezuelensis em amostras de soro de animais não imunossuprimidos foi preferencialmente durante o 5° e o 8° d.p.i. e em animais imunossuprimidos, durante toda a cinética experimental. Nas amostras de LBA, a detecção de anticorpos ocorreu do 8° ao 21° d.p.i em animais não imunossuprimidos e em animais imunossuprimidos, foi antecipada para o 2° d.p.i, como pico de reatividade no 5° d.p.i (p<0,05). A detecção de imunocomplexos em amostras de soro de animais não imunossuprimidos foi possível do 5° aos 13° d.p.i e em animais imunossuprimidos, durante toda a cinética. Em amostras de LBA, a detecção de imunocomplexo foi maior em animais não imunossuprimidos. Concluiu-se que a detecção de coproantígeno e de imunocomplexos circulantes em amostra de soro e em amostras de LBA são uma alternativa para o diagnóstico precoce da estrongiloidíase principalmente nos casos de imunossupressão. / Doutor em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

Os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes na circulação sanguínea, sendo recrutados rapidamente para os locais de infecção e inflamação. Em condições fisiológicas, os neutrófilos circulantes possuem tempo de vida curto, de cerca de 6 a 8 horas, mas a sua sobrevida pode aumentar em condições inflamatórias. O papel dos neutrófilos em diversas doenças foi negligenciado por muito tempo, em parte devido àsdificuldades em seu estudo e manipulação, pois os mesmos são facilmente ativados e difíceis de serem mantidos em cultura. Nos últimos anos, o advento de novas técnicas e o aprimoramento de condições laboratoriais têm possibilitado uma investigação mais ampla da fisiopatologia dos neutrófilos e revelado a diversidade de funções e interações dessas células. Para dar continuidade aos estudos visando o entendimento de como as funções efetoras dos neutrófilos podem ser moduladas por produtos naturais e sintéticos, e a aplicação desse conhecimento no tratamento de patologias nas quais tais leucócitos participam, o presente trabalho estabeleceu, primeiramente, as condições experimentais para a cultura de neutrófilos humanos. As células mantiveram-se viáveis e em estado de repouso por até 24 horas, tanto em solução balanceada de Hank\'s quanto em meio RPMI. A funcionalidade dos neutrófilos foi avaliada através da sua capacidade de produzir espécies reativas de oxigênio (ERO), medida por quimioluminescência dependente de luminol (QLlum). Diferentemente do meio RPMI, a solução balanceada de Hank\'s não interferiu no ensaio de QLlum, possibilitando a análise da funcionalidade das células. Durante o período de cultura celular de 24 horas, os neutrófilos mantiveram a sua capacidade de produzir ERO em quantidades suficientes para serem detectadas e permitirem a avaliação do efeito inibitório de substâncias antioxidantes. Em seguida, este trabalho avaliou o efeito de dois antioxidantes - a 3-fenilcumarina 6,7-diidroxi-3-(3\',4\'-metilenodioxifenil)-cumarina (C13) e o flavonol galangina - na produção de ERO pelos neutrófilos. Ambas as substâncias inibiram esta função efetora dos neutrófilos durante todo o período de cultura analisado, indicando que as mesmas não foram degradadas a ponto de perderem a sua atividade antioxidante. As condições de cultura padronizadas possibilitaram também a avaliação do efeito da galangina e da C13 na viabilidade celular. Na maior concentração analisada (20 ?M), ambas as substâncias não alteraram a porcentagem de células viáveis (aproximadamente 80%), mas modularam os estágios de sobrevivência dos neutrófilos, reduzindo a porcentagem de células em apoptose e aumentando a porcentagem de células em necrose, principalmente após 18 horas de cultura. Portanto, a solução balanceada de Hank´s é adequada para manter neutrófilos humanos em cultura por até 24 horas, possibilitando a avaliação do efeito de substâncias antioxidantes na produção de ERO por estas células e na sua viabilidade. / Neutrophils are the most abundant leukocytes in blood, which are rapidly recruited to sites of infection and inflammation. Circulating neutrophils have a short lifetime of about 6 to 8 hours under physiological conditions, but their survival can be increased under inflammatory conditions. The role that neutrophils play in various diseases was long neglected, partially due to the difficulties to study and manipulate these cells, which are easy to activate and hard to maintain in culture. In recent years, the development of new techniques and improvement of laboratory conditions have broadened the investigation of neutrophil physiopathology and revealed the variety of functions and interactions of these cells. To continue the studies to understand how the effector functions of neutrophils can be modulated by natural and synthetic products, and to apply such knowledge to treat diseases in which these leukocytes participate, the first part of the present work established the experimental conditions to culture human neutrophils. Cells cultured in either Hank\'s balanced solution or RPMI medium remained viable and in the resting state for up to 24 hours. Neutrophil functionality was evaluated through its ability to produce reactive oxygen species (ROS), assessed by the luminol-enhanced chemiluminescence assay (CL-lum). In contrast to RPMI medium, Hank\'s balanced solution did not interfere in the CL-lum assay and thereby allowed analysis of neutrophil functionality. During the 24-hour cell culture period, neutrophils maintained their capacity to produce ROS in detectable amounts that were sufficient to assess the inhibitory effect of antioxidant compounds. Next, this work examined the effect of two antioxidants - the 3-phenylcoumarin 6,7-dihydroxy-3-[3\',4\'-methylenedioxyphenyl]-coumarin (C13) and the flavonol galangin - on ROS production by neutrophils. Both compounds suppressed this effector function of neutrophils during the whole culture period studied, indicating that they were not degraded to the point of losing their antioxidant activity. The standardized culture conditions also allowed assessing whether galangin and C13 affected cell viability. At the highest concentration tested (20 ?M), both compounds did not alter the cell viability percentage (around 80%) but modulated the neutrophil survival stages by reducing the percentage of apoptotic cells and increasing the percentage of necrotic cells, particularly after 18 hours of culture. Therefore, Hank\'s balanced solution is suitable to culture human neutrophils for up to 24 hours, and enables to assess the effect of antioxidant compounds on neutrophil ROS production and viability.