Le système kallicréine-kinines est un système peptidergique complexe impliqué dans les processus inflammatoires, le contrôle du tonus et de la perméabilité vasculaire. Les effets biologiques des kinines sont accomplis par l’intermédiaire de deux types de récepteurs couplés aux protéines G, soit le récepteur B1 (B1R) et le récepteur B2 (B2R). Alors que le B2R est un récepteur constitutif, le B1R est faiblement exprimé en situation physiologique; il est induit par le stress oxydatif, les cytokines pro-inflammatoires (interleukine-1β (IL-1β) et le facteur de nécrose tumorale-α (TNF-α)) ou par des endotoxines bactériennes à la fois au niveau systémique et local, notamment dans la rétine. Des études récentes de notre laboratoire ont montré l’implication du B1R dans la pathogenèse et la progression de la rétinopathie diabétique et de la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA). Les objectifs des travaux présentés dans cette thèse consistent à déterminer : 1) le mécanisme par lequel le B1R est impliqué dans la rétinopathie diabétique chez le rat; 2) l’implication de la iNOS en aval dans la cascade inflammatoire activée par le B1R; 3) l’expression et la localisation cellulaire du B1R dans les rétines humaines atteintes de DMLA exsudative et atrophique. Nos résultats ont permis de démontrer une implication du B1R dans la rétinopathie diabétique via l’activation de l’enzyme de synthèse du monoxyde d’azote inductible (iNOS) dans un modèle de diabète de type 1 induit par la streptozotocine (STZ) chez le rat. En plus de sa localisation généralisée dans toute la rétine, le B1R est exprimé dans la couche de l’épithélium pigmentaire qui forme la barrière hémato-rétinienne externe. Les taux d’expression (protéique et ARNm) du B1R, de la iNOS, de la carboxypeptidase M (impliquée dans la biosynthèse des agonistes B1R), de l'IL-1β, du TNF-α, du facteur de croissance de l'endothélium vasculaire A (VEGF-A) et de son récepteur, le VEGF-R2, ainsi que des protéines nitrosylées augmentent à deux semaines dans la rétine diabétique. Ces augmentations ainsi que l’hyperperméabilité vasculaire rétinienne induite par le diabète et par l’injection intravitréenne d’un agoniste du B1R (R-838) sont bloquées par un inhibiteur de la iNOS (1400W) appliqué topiquement à la surface de l’œil pendant 1 semaine (premier article). Les résultats du deuxième article montrent une augmentation significative de l'immunoréactivité du B1R dans les rétines humaines prélevées de patients atteints de DMLA exsudative. Toutefois, les changements d’immunoexpression du B1R ne sont pas significatifs dans les rétines des patients atteints de DMLA atrophique. La réactivité des cellules gliales est plus marquée dans la forme exsudative que dans la forme atrophique de DMLA. Une colocalisation du B1R est observée avec des marqueurs des cellules de Müller, des astrocytes, de la microglie, de la iNOS et de la fibrose, suggérant une implication du B1R dans le processus inflammatoire et la formation de fibrose dans la DMLA exsudative. En revanche, l’expression du B2R demeure stable dans les rétines de DMLA exsudative et atrophique par rapport aux rétines témoins; ce résultat ne supporte pas la possibilité que ce récepteur puisse être impliqué dans la DMLA chez l’humain. / The kallikrein-kinins system is a peptidergic system involved in inflammatory processes, the control of the vascular tone and permeability. These effects are mediated by two G proteincoupled receptors, the Bradykinin type 1 (B1R) and type 2 (B2R) receptors. While the B2R is a constitutive receptor, B1R is almost undetectable in physiological condition; it is, however, induced by oxidative stress, pro-inflammatory cytokines (interleukin-1β (IL-1β) and tumor necrosis factor-α (TNF-α)) or by bacterial endotoxins at both systemic and local levels, notably in the retina. Recent studies from our laboratory supported an implication of B1R in the pathogenesis and progression of diabetic retinopathy and age-related macular degeneration (AMD). This thesis aims at unraveling: 1) the mechanism by which B1R is involved in diabetic retinopathy in rats; 2) the involvement of iNOS in the inflammatory cascade downstream to the B1R; and, 3) the expression and cellular localization of B1R in human retinae with exudative and atrophic AMD. Our results have shown the implication of B1R in diabetic retinopathy via the activation of the inducible nitric oxide synthase (iNOS) in a type 1 model of diabetes induced by streptozotocin (STZ) in rats. In addition to its generalized localization throughout the retina, B1R is expressed in the retinal pigment epithelium which forms the outer blood-retinal barrier. The protein and transcript expression of inflammatory markers; iNOS, carboxypeptidase M, IL-1β, TNF-α, vascular endothelium growth factor A (VEGF-A) and its receptor, VEGF-R2, including B1R as well as nitrosylated proteins are increased in the retina of diabetic rats at 2 weeks post-STZ. These upregulations, as well as the retinal vascular hyperpermeability induced by diabetes and by the intravitreal injection of an B1R agonist (R-838) are blocked by a topical one-week treatment by eye-drop with the selective iNOS inhibitor (1400W) (first manuscript). The results of the second manuscript show significant increases in the immunoreactivity of B1R in exudative AMD retinae. Despite a slight increase, B1R immunostaining does not reach statistical significance in the retina of donors with atrophic AMD. The reactivity of glial cells is more impressive in the exudative than in the atrophic form of AMD. B1R is co-expressed with markers of Müller cells, astrocytes, microglia, iNOS and fibrosis, suggesting an involvement of B1R in the inflammatory events and the formation of fibrosis in exudative AMD. On the other hand, the expression of B2R remains stable in the retinae of exudative and atrophic AMD, supporting a secondary role of this receptor in AMD in humans.

L’obstacle majeur à l’éradication du VIH est l’existence de réservoirs cellulaires du VIH, qui échappent au traitement et à la réponse immunitaire de l’hôte. Ce réservoir s’établit très tôt dans l’infection, menant typiquement à la destruction d’un grand nombre de lymphocytes T CD4+. Cependant, une faible proportion de ces cellules retourne à l’état quiescent en ayant intégré le génome viral. La taille et l’évolution du réservoir chez l’adulte ont été bien élucidées. Cependant, on en sait moins sur la taille et la distribution du réservoir du VIH, et sur l’impact de l’initiation précoce de la thérapie antirétrovirale combinée (TARc) sur ces dernières dans la population infantile. Cet essai s’inscrit dans le cadre de l’étude prospective multicentrique EPIC4 (Early Pediatric Initiation, Canada Child Cure Cohort Study), qui a recruté 221 enfants infectés par la voie verticale dans neuf centres pédiatriques canadiens. Nous soumettons l’hypothèse que l'initiation très précoce de la TARc chez l’enfant infecté par le VIH permettrait de réduire le réservoir à ses plus bas niveaux, menant à un meilleur contrôle de la réplication virale suite à une éventuelle interruption de traitement. Nous avons obtenu des corrélations positives entre la taille du réservoir viral lymphocytaire sanguin du VIH-1 et l'âge de l’initiation de la TARc et l'âge à la suppression virale soutenue (SVS). Les niveaux des réservoirs sont négativement corrélés à la proportion de la vie sous TARc efficace et à la proportion de la vie sous SVS et au compte de lymphocytes T CD4+. Nous avons montré également qu’un traitement initié précocement dans les premiers six mois de vie serait un facteur de prédictions d’une suppression virale plus rapide et plus soutenue. Nos résultats confirment que l’initiation précoce de la TARc et le maintien à long terme de la suppression virale stable sont des facteurs clés conduisant à une taille limitée du réservoir viral. Par ailleurs, nous démontrons pour la première fois que la taille du réservoir inductible du VIH-1 mesurée dans les lymphocytes T CD4+ du sang périphérique après stimulation avec un analogue de prostratine corrèle significativement avec celle mesurée en ADN proviral. Ainsi, nous avons validé une nouvelle technique de mesure de réservoir inductible qui est rapide et moins coûteuse et surtout requiert un faible volume de sang donc semble très prometteuse pour des études sur le VIH-1 pédiatrique. / The major barrier to eradicating HIV is the existence of cellular reservoirs of HIV, which escape the treatment and immune response of the host. This reservoir is established very early in the infection, typically leading to the destruction of a large number of CD4+ T cells. However, a small proportion of these cells return to quiescent state after integrating the viral genome. The size and evolution of the reservoir in adults have been well understood. However, we know less about the size and distribution of the HIV reservoir, and the impact of early initiation of combination antiretroviral therapy (cART) on it in the infant population. Our study is a part of the Early Pediatric Initiation Canada, Child Cure Cohort (EPIC4); a prospective, multicenter study, which enrolled 221 vertically HIV-1 infected children in nine Canadian pediatric centers. We hypothesize that very early initiation of cART in HIV-infected children would reduce the reservoir to its lowest levels, leading to better control of viral replication following a possible interruption of treatment. A strong positive correlation was observed between reservoir size in peripheral blood and both the age at initiation of cART and the age at which sustained viral suppression (SVS) was achieved. We found a strong negative correlation between the size of the viral reservoir and the proportion of life spent on effective cART or the proportion of life with SVS and CD4+ T lymphocytes count. This study shows that starting cART within 6 months from birth is a predictor of faster and more sustained virological suppression in infants. Our findings suggest that early cART initiation in infants and long-term viral suppression are key factors leading to limited viral reservoir size. Furthermore, we established for the first time that the size of the inducible HIV-1 reservoir in peripheral blood CD4+ T lymphocytes of children, quantified by the prostratin analogue stimulation test, correlates with the size obtained using proviral DNA measurement. Thus, we have validated a new inducible reservoir measurement technique that is fast, less expensive, and, importantly requires a lower blood volume. This assay could be very promissing for evaluating inducible HIV-1 reservoirs in pediatric HIV-1 studies.

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Les cellules souches embryonnaires (cellules ES) sont pluripotentes et ont donc le potentiel de se différencier en cellules des trois feuillets embryonnaires, ainsi qu’en cellules de la lignée germinale. Ces propriétés en font un modèle pour l’étude des mécanismes de prolifération et de différenciation. Le facteur de transcription Lmx1b est impliqué dans la maintenance du phénotype différencié des neurones dopaminergiques mésencéphaliques. Et il a aussi été montré comme un facteur clef dans la différenciation et la maintenance des neurones sérotoninergiques du rhombencéphale générés dans les noyaux du Raphé. Dans ce travail, nous nous sommes intéressés aux capacités de Lmx1b d’influencer la différenciation des cellules ES de souris en neurones sérotoninergiques. La première stratégie adoptée a résulté en une expression ectopique stable de Lmx1b dans les cellules ES et leurs dérivés. Le niveau d’expression de Lmx1b a fortement influencé les capacités de différenciation neuronale des cellules. Puis, l’analyse de marqueurs de différenciation spécifiques a montré une augmentation de l’expression des marqueurs sérotoninergiques, au contraire des marqueurs dopaminergiques ou de neurones moteur. La seconde stratégie a consisté en une surexpression inductible de Lmx1b dans les précurseurs neuraux dérivés de cellules ES pour mimer l’expression physiologique de Lmx1b. Après induction, Lmx1b était bien exprimé dans les cellules durant toutes les étapes de différenciation neuronale. L’activation de l’expression de Lmx1b au stade des colonies neuroépithéliales a aussi résulté en une amélioration de la différenciation sérotoninergique. Les résultats de ce travail soulignent les capacités de Lmx1b à diriger la différenciation des précurseurs neuraux dérivés de cellules ES vers la voie sérotoninergique in vitro. / Pluripotent Embryonic Stem Cells (ESC) have the potential to develop into cells of the three germ layers and of the germ line. Therefore, they are used as a model to study the proliferation and differentiation mechanisms. The LIM homeodomain transcription factor Lmx1b is involved in the maintenance of the differentiated phenotype of midbrain dopaminergic neurons. And it has been also demonstrated to be a key factor in differentiation and maintenance of hindbrain serotonergic neurons generated in the Raphe Nuclei. Here, we explored the capacity of Lmx1b to direct differentiation of mouse ESC (mESC) into serotonergic neurons. In the first approach, stable ectopic expression of Lmx1b was achieved. First, the level of Lmx1b expression was found to strongly influence the capacity of mESC to accomplish neuronal differentiation. Then, analysis of lineage-specific differentiation markers showed an increase in serotonergic markers’ expression by contrast to dopaminergic or motor neurons markers. In the second approach, Lmx1b was over-expressed in mESC-derived neural precursors by an inducible system in order to mimic the physiological onset of Lmx1b expression. After induction, Lmx1b was found to be stably expressed throughout neuronal differentiation. Activation of Lmx1b expression in neuroepithelial colonies resulted in enhancement of serotonergic differentiation, consistently with the stable system results. The results of this work highlight the capacity of Lmx1b to promote the shift of mESC-derived neural precursors toward a serotonergic fate in vitro.

Inducible T-cell co-stimulator (ICOS) is a member of the CD28 family of T cell costimulatory receptors that is induced upon activation in CD4+ and CD8+ T cells. It has been established that ICOS plays a critical role in humoral immunity by supporting the generation and function of T follicular helper cells. Thus, ICOS deficiency in humans and mice leads to immunodeficiency due to impaired germinal center reaction and antibody production. ICOS can also promote expansion, survival, and cytokine expression of inflammatory T cells. However, given that ICOS is also constitutively expressed in Foxp3+ regulatory T (Treg) cells, interruption of ICOS signaling may lead to different outcomes depending on the context of immune reactions. Due to the potential opposing roles of ICOS in overall T cell immune response, the T cell subsetspecific role of ICOS needs to be clarified. In order to address the intrinsic roles of ICOS in Treg homeostasis and function, we generated mice (termed ICOS FC) in which Icos gene is specifically deficient in Foxp3+ T regulatory cells. Using flow cytometry and single-cell transcriptome analysis, we show that ICOS FC mice do not have any severe alterations in the Tcon cell activation status and subset compositions of Treg cells under a steady state condition. Consistently, no spontaneous autoimmune symptoms developed in aged ICOS FC mice. In contrast, when the mice were challenged with chemically induced skin inflammation, ICOS FC mice mounted more severe inflammatory responses. In parallel, the number of Treg cells was reduced allowing increase of inflammatory CD4+ and CD8+ T cells in the draining lymph nodes and the skin. Although very small, our single-cell transcriptome analysis identified a cluster of Treg cells coexpressing T-bet and CXCR3 (termed Th1-Treg) in the draining lymph nodes in an ICOS-dependent manner. Therefore, Treg-intrinsic ICOS deficiency had minimal impact on the overall Treg homeostasis, but weakened Treg cells’ capacity to control Th1-driven skin inflammation likely due to the impaired differentiation of Th1-Treg cells. A dual role of ICOS in T cell-driven autoimmune disease has been modeled in NOD mice. In pure NOD mice in which polyclonal T cells control the disease, ICOS germline deficiency reduced disease progression by dampening activation of pathogenic autoreactive T cells. In contrast, when the TCR repertoire was highly restricted to autoantigens in BDC2.5 TCR transgenic III NOD line, ICOS-expressing Treg cells appear to play a dominant role by halting progression of insulitis to overt diabetes. However, previous studies could not exclude the possibility of altered TCR repertoire by ICOS deficiency in germline. In this study, we tested the impact of Icos gene deletion in adult NOD mice using an inducible ubiquitous Cre system once peripheral T cell repertoire had been established. We observed reduced incidence of diabetes in pure NOD mice but accelerated disease in BDC2.5-NOD mice, very similar to germline ICOS-deficiency. These results support the prevailing view that the main function of ICOS is to regulate effector and regulatory T cells in the periphery. In sum, we demonstrated that ICOS-deficient Treg cells retain the capacity to prevent spontaneous autoimmune disease but have a compromised ability to dampen Th1-driven skin inflammation. We further confirm the notion that ICOS mainly regulates mature T cells as opposed to thymic selection process. / Le co-stimulateur inductible des lymphocytes T (ICOS) est un membre de la famille CD28 des récepteurs co-stimulateurs qui est induit suite à l'activation des lymphocytes T CD4+ et CD8+. Il a été établi que ICOS joue un rôle essentiel dans l'immunité humorale en soutenant la génération et la fonction des cellules T auxiliaires folliculaires. Le déficit en ICOS chez l'homme et la souris conduit à une immunodéficience due à une altération de la réaction du centre germinatif et de la production d'anticorps. ICOS peut également favoriser l'expansion, la survie et l'expression des cytokines des cellules T inflammatoires. Cependant, étant donné que ICOS est également exprimé de manière constitutive dans les cellules T régulatrices Foxp3+ (Treg), l'interruption de la signalisation ICOS peut conduire à des résultats différents selon le contexte des réactions immunitaires. En raison des rôles potentiellement opposés de ICOS dans la réponse immunitaire globale des lymphocytes T, le rôle spécifique de ICOS chez les sous-ensembles de lymphocytes T doit être clarifié. Afin d'étudier les rôles intrinsèques de ICOS dans l'homéostasie et la fonction des Tregs, nous avons généré des souris (appelées ICOS FC) dans lesquelles le gène Icos est spécifiquement aboli chez les cellules T régulatrices Foxp3+. À l'aide de la cytométrie en flux et de l'analyse du transcriptome unicellulaire, nous démontrons que les souris ICOS FC ne présentent aucune altération grave de l'état d'activation des cellules Tcon et des compositions de sous-ensembles de cellules Treg dans des conditions d'équilibre. De plus, aucun symptôme auto-immun spontané ne s'est développé chez les souris ICOS FC âgées. En revanche, lorsque les souris ont été confrontées à une inflammation cutanée induite chimiquement, les souris ICOS FC ont présenté des réponses inflammatoires plus sévères. En parallèle, le nombre de cellules Treg a été réduits permettant une augmentation des cellules T CD4+ et CD8+ inflammatoires dans les ganglions lymphatiques drainants et la peau. Notre analyse du transcriptome unicellulaire a identifié un petit groupe de cellules Treg coexprimant T-bet et CXCR3 (appelé Th1-Treg) dans les ganglions lymphatiques drainants d'une manière ICOS-dépendante. Par conséquent, le déficit en ICOS intrinsèque aux Tregs a eu un impact minimal sur l'homéostasie globale des Tregs, mais a affaibli la capacité des cellules Treg à contrôler l'inflammation cutanée induite par les cellules Th1, probablement en raison de la différenciation altérée des cellules Th1-Treg. V Un double rôle de ICOS dans les maladies auto-immunes induites par les cellules T a été modélisé chez les souris NOD. Dans les souris NOD pures chez lesquelles des cellules T polyclonales contrôlent l’apparition du diabète auto-immun, un déficit de ICOS réduit la progression de la maladie en atténuant l'activation des cellules T autoréactives pathogènes. En revanche, dans un contexte où le répertoire du TCR est fortement restreint aux auto-antigènes (lignée NOD transgénique BDC2.5 TCR), les cellules Treg exprimant ICOS semblent jouer un rôle dominant en arrêtant la progression vers le diabète manifeste. Cependant, des études antérieures n'ont pas pu exclure la possibilité d'un répertoire de TCR altéré par un déficit en ICOS dans la lignée germinale. Dans cette étude, nous avons testé l'impact de la délétion inductible du gène Icos chez des souris NOD adultes à l’aide d’un système Cre ubiquitaire une fois que le répertoire des cellules T périphériques a été établi. Nous avons observé une incidence réduite du diabète chez les souris NOD pures, mais une accélération de la maladie chez les souris NOD BDC2.5 très similaire au phénotype causé par une ablation de Icos de la lignée germinale. Ces résultats soutiennent l'opinion dominante selon laquelle la fonction principale de ICOS est de réguler les cellules T effectrices et régulatrices dans la périphérie. En résumé, nous avons démontré que les cellules Treg déficientes en ICOS conservent la capacité de prévenir les maladies auto-immunes spontanées, mais démontrent une capacité réduite à atténuer l'inflammation cutanée provoquée par les cellules Th1. Nous confirmons de plus l’hypothèse que ICOS régule principalement les cellules T matures au lieu du processus de sélection thymique.