The discovery of resetting human somatic cells via introduction of four transcription factors into an embryonic stem cell-like state that enables the generation of any cell type of the human body has revolutionized the field of medical science. The generation of patient-derived iPSCs and the subsequent differentiation into the cells of interest has been, nowadays, widely used as model system for various inherited diseases. The aim of this thesis was to generate iPSCs and to subsequently derive NPCs which can be differentiated into neurons in order to model the two most common forms of the NCLs: LINCL which is caused by mutations within the TPP1 gene, encoding a lysosomal enzyme, and JNCL which is caused by mutations within the CLN3 gene, affecting a lysosomal transmembrane protein. It was shown that patient-derived fibroblasts can be successfully reprogrammed into iPSCs by using retroviral vectors that introduced the four transcription factors POU5F1, SOX2, KLF4 and MYC. The generated iPSCs were subsequently differentiated into expandable NPCs and finally into mature neurons. Phenotype analysis during the different stages, namely pluripotent iPSCs, multipotent NPCs and finally differentiated neurons, revealed a genotype-specific progression of the disease. The earliest events were observed in organelle disruption such as mitochondria, Golgi and ER which preceded the accumulation of subunit c of the mitochondrial ATPase complex that was only apparent in neurons. However, none of these events led to neurodegeneration in vitro. The established disease models recapitulate phenotypes reported in other NCL disease models such as mouse, dog and sheep model systems. More importantly, the hallmark of the NCLs, accumulation of subunit c in neurons, could be reproduced during the course of disease modeling which demonstrates the suitability of the established system. Moreover, the derived expandable NPC populations can be used for further applications in drug screenings. Their robust phenotypes such as low levels of TPP1 activity in LINCL patient-derived NPCs or cytoplasmic vacuoles, containing storage material, observed in CLN3 mutant NPCs, should serve as possible phenotypic read-outs.

The discovery of resetting human somatic cells via introduction of four transcription factors into an embryonic stem cell-like state that enables the generation of any cell type of the human body has revolutionized the field of medical science. The generation of patient-derived iPSCs and the subsequent differentiation into the cells of interest has been, nowadays, widely used as model system for various inherited diseases. The aim of this thesis was to generate iPSCs and to subsequently derive NPCs which can be differentiated into neurons in order to model the two most common forms of the NCLs: LINCL which is caused by mutations within the TPP1 gene, encoding a lysosomal enzyme, and JNCL which is caused by mutations within the CLN3 gene, affecting a lysosomal transmembrane protein. It was shown that patient-derived fibroblasts can be successfully reprogrammed into iPSCs by using retroviral vectors that introduced the four transcription factors POU5F1, SOX2, KLF4 and MYC. The generated iPSCs were subsequently differentiated into expandable NPCs and finally into mature neurons. Phenotype analysis during the different stages, namely pluripotent iPSCs, multipotent NPCs and finally differentiated neurons, revealed a genotype-specific progression of the disease. The earliest events were observed in organelle disruption such as mitochondria, Golgi and ER which preceded the accumulation of subunit c of the mitochondrial ATPase complex that was only apparent in neurons. However, none of these events led to neurodegeneration in vitro. The established disease models recapitulate phenotypes reported in other NCL disease models such as mouse, dog and sheep model systems. More importantly, the hallmark of the NCLs, accumulation of subunit c in neurons, could be reproduced during the course of disease modeling which demonstrates the suitability of the established system. Moreover, the derived expandable NPC populations can be used for further applications in drug screenings. Their robust phenotypes such as low levels of TPP1 activity in LINCL patient-derived NPCs or cytoplasmic vacuoles, containing storage material, observed in CLN3 mutant NPCs, should serve as possible phenotypic read-outs.

Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) ist eine neurodegenerative Erkrankung, bei welcher speziell erste (kortikospinal) und zweite (spinal) Motorneurone (MN) von Neurodegeneration betroffen sind. Gegenwärtig bleibt ALS eine unheilbare Erkrankung. Der Tod tritt durchschnittlich 2 bis 5 Jahre nach Auftreten der Symptome ein. Circa 90% der Fälle treten sporadisch auf (sALS), während 10% familiär sind (fALS). Es ist von großem Interesse monogenetische Formen der fALS zu untersuchen um zugrundeliegende Pathologien und Mechanismen zu verstehen. Bislang wurden über 20 Gene mit ALS in Verbindung gebracht, einschließlich Fused in sarcoma (FUS) und Chromsosome 9 open reading frame (C9ORF72). Circa 4% der fALS Fälle sind durch dominante Mutationen in FUS verursacht und repräsentieren damit die dritthäufigste Form der fALS in Deutschland. Die G4C2 hexanucleotide repeat expansion (HRE) in C9ORF72 ist die häufigste Ursache für ALS und Frontotemporale Demenz (FTD). ALS Patienten unterscheiden sich erheblich in der Präsentation ihrer klinischen Symptome wie Ausbruchsort, Progressionsrate und Auftreten kognitiver Störungen. Diese Faktoren sind auch stark abhängig von der zugrundeliegenden Mutation in fALS. Ziel dieser Doktorarbeit ist die Modellierung von FUS- und C9ORF72-assozierter ALS in einem krankheits-relevanten in vitro Model von speziell kortikaler Neuropathologie mit Hilfe von Patienten-spezifischen iPSZs. Die Hypothese der vorliegenden Arbeit ist das in einer Zelltyp-abhängigen Art und Weise zugrundeliegende Erkrankungsmechanismen in kortikalen vs. spinalen Neuronen unterschiedlich betroffen sind. Humane iPSZ, generiert von gesunden Kontrollen und ALS Patienten mit FUS oder C9ORF72 Mutation, wurden für die gerichtete kortikale und spinale Differenzierung genutzt. Zusätzlich wurden zwei neue FUS-WT- und FUS-P525L-EGFP-markierte isogene Linien mittels CRISPR/Cas9n Technik generiert. Methoden basierend auf Immunfluoreszenz Färbungen und Lebendzell-Mikroskopie wurden angewendet um Krankheits-relevante Proteine, DNA Schäden und axonale Organell-Mobilität zu analysieren. In diesem Projekt konnte ein deutlicher Zelltyp-abhängiger Effekt auf analysierte Phänotypen beobachtet werden, während ALS-assoziierte Mutationen scheinbar nur geringfügige Effekte zeigten. Dementsprechend wurde ein Zelltyp-abhängiger Anstieg des basalen DNA Schadens in kortikalen Astrozyten vs. Neuronen und spinalen vs. kortikalen Neuronen detektiert. Jedoch konnte in FUS oder C9ORF72 mutierten kortikalen Zellen kein erhöhter DNA Schaden nachgewiesen werden, wie es zuvor in spinalen MN beobachtet wurde. Des Weiteren beeinflussen FUS Mutationen die Rekrutierung von FUS zu DNA-geschädigten Stellen, die Organell-Mobilität und die zytoplasmatische Fehllokalisation des Proteins in Abhängigkeit vom Zelltyp. In kortikalen Neuronen wurde in Bezug auf die Rekrutierung von mutiertem FUS und Organell-Mobilität nur leichte Mutations-abhängige und wesentlich schwächer ausgeprägte Effekte beobachtet als in spinalen MN. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass Patienten-spezifische Zellmodelle ein wichtiges Instrument in der ALS Forschung sind und das vor allem Unterschiede zwischen kortikalen und spinalen MN weiter untersucht werden müssen, um zugrundeliegende Krankheits-relevante Mechanismen zu entschlüsseln und wie diese zum Fortschreiten der Erkrankung beitragen / Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a of neurodegenerative diseases, in which neurodegeneration specifically affects upper (corticospinal) and lower (spinal) motor neurons (MNs). At present, ALS remains an incurable disease. Death occurs on average 2 to 5 years after symptom onset. About 90% are sporadic cases (sALS) and 10% are familial cases (fALS). It is of great interest to investigate monogenetic forms causing fALS to understand its underlying disease pathologies and mechanisms. Over 20 genes have been linked to ALS until now, including Fused in sarcoma (FUS) and Chromosome 9 open reading frame 72 (C9ORF72). About 4% of fALS cases are caused by dominant mutations within FUS, representing the third most common fALS form in Germany. The G4C2 hexanucleotide repeat expansion (HRE) in the C9ORF72 gene is the most common cause for ALS and Frontotemporal dementia (FTD). ALS patients differ significantly in their presentation of clinical symptoms, including site of onset, rate of progression, and presence of cognitive dysfunction. Those factors were also shown to highly depend on the underlying mutation in fALS cases. Aim of this thesis work is the modeling of FUS- and C9ORF72-associated ALS in a disease-related in vitro model of particularly cortical neuropathology using patient-derived iPSCs. The hypothesis of the current work is that underlying disease mechanisms do differentially affect cortical vs. spinal neurons and act in a cell type-dependent manner. Human iPSCs derived from healthy controls and ALS patients carrying mutations within FUS or C9ORF72 were used for directed cortical and spinal differentiation. Additionally, two new FUS-WT- and FUS-P525L-EGFP-tagged isogenic iPSC lines were generated by CRISPR/Cas9n gene editing. Immunofluorescence staining and live cell imaging approaches were implemented to analyze disease-associated proteins, DNA damage, and axonal trafficking. Within this project, a clear cell type-dependent effect on analyzed phenotypes was observed, while ALS-associated mutations seemed to have only minor effects. Accordingly, cell type-dependent increased basal DNA damage levels in cortical astrocytes vs. neurons and spinal vs. cortical neurons were detected. However, FUS or C9ORF72 mutant cortical cells do not recapitulate increased DNA damage levels as they have been observed in spinal MNs. Furthermore, FUS mutation affected recruitment to DNA damage sites, axonal trafficking, and cytoplasmic mislocalization differentially, depending on the analyzed cell type. In cortical neurons, recruitment and trafficking of mutant FUS showed only slight mutation-dependent effects and also less pronounced phenotypes than observed in spinal MNs. In conclusion, patient-specific cellular models are an important tool in ALS research and particularly differences between cortical and spinal MNs need to be further investigated to decipher underlying disease mechanisms, the interplay of cell types affected by the disease, and how they participate in disease progression.

Das Verhalten Biologischer Systeme wird durch eine Vielzahl regulatorischer Prozesse beeinflusst, die sich auf verschiedenen Ebenen abspielen. Die Forschung an diesen Regulationen hat stark von den großen Mengen von Hochdurchsatzdaten profitiert, die in den letzten Jahren verfügbar wurden. Um diese Daten zu interpretieren und neue Erkenntnisse aus ihnen zu gewinnen, hat sich die mathematische Modellierung als hilfreich erwiesen. Allerdings müssen die Daten vor der Integration in Modelle aggregiert und analysiert werden. Wir präsentieren vier Studien auf unterschiedlichen zellulären Ebenen und in verschiedenen Organismen. Zusätzlich beschreiben wir zwei Computerprogramme die den Vergleich zwischen Modell und Experimentellen Daten erleichtern. Wir wenden diese Programme in zwei Studien über die MAP Kinase (MAP, engl. mitogen-acticated-protein) Signalwege in Saccharomyces cerevisiae an, um Modellalternativen zu generieren und unsere Vorstellung des Systems an Daten anzupassen. In den zwei verbleibenden Studien nutzen wir bioinformatische Methoden, um Hochdurchsatz-Zeitreihendaten von Protein und mRNA Expression zu analysieren. Um die Daten interpretieren zu können kombinieren wir sie mit Netzwerken und nutzen Annotationen um Module identifizieren, die ihre Expression im Lauf der Zeit ändern. Im Fall der humanen somatischen Zell Reprogrammierung führte diese Analyse zu einem probabilistischen Boolschen Modell des Systems, welches wir nutzen konnten um neue Hypothesen über seine Funktionsweise aufzustellen. Bei der Infektion von Säugerzellen (Canis familiaris) mit dem Influenza A Virus konnten wir neue Verbindungen zwischen dem Virus und seinem Wirt herausfinden und unsere Zeitreihendaten in bestehende Netzwerke einbinden. Zusammenfassend zeigen viele unserer Ergebnisse die Wichtigkeit von Datenintegration in mathematische Modelle, sowie den hohen Grad der Verschaltung zwischen verschiedenen Regulationssystemen. / The behavior of all biological systems is governed by numerous regulatory mechanisms, acting on different levels of time and space. The study of these regulations has greatly benefited from the immense amount of data that has become available from high-throughput experiments in recent years. To interpret this mass of data and gain new knowledge about studied systems, mathematical modeling has proven to be an invaluable method. Nevertheless, before data can be integrated into a model it needs to be aggregated, analyzed, and the most important aspects need to be extracted. We present four Systems Biology studies on different cellular organizational levels and in different organisms. Additionally, we describe two software applications that enable easy comparison of data and model results. We use these in two of our studies on the mitogen-activated-protein (MAP) kinase signaling in Saccharomyces cerevisiae to generate model alternatives and adapt our representation of the system to biological data. In the two remaining studies we apply Bioinformatic methods to analyze two high-throughput time series on proteins and mRNA expression in mammalian cells. We combine the results with network data and use annotations to identify modules and pathways that change in expression over time to be able to interpret the datasets. In case of the human somatic cell reprogramming (SCR) system this analysis leads to the generation of a probabilistic Boolean model which we use to generate new hypotheses about the system. In the last system we examined, the infection of mammalian (Canis familiaris) cells by the influenza A virus, we find new interconnections between host and virus and are able to integrate our data with existing networks. In summary, many of our findings show the importance of data integration into mathematical models and the high degree of connectivity between different levels of regulation.

Hintergrund Das Aicardi-Goutières Syndrom (AGS) ist eine genetisch bedingte Enzephalopathie, die durch Mutationen in neun verschiedenen Genen verursacht wird und zu einer Neurodegenration mit globaler Entwicklungsverzögerung führt. Die Mutationen führen zu einer Fehlregulation des Metabolismus und der immunologischen Erkennung intrazellulärer Nukleinsäuren sowie einer konstitutiven Aktivierung von Typ 1-Interferon (IFN). Bei AGS-Patienten sind Kalzifizierungen der Basalganglia sowie Demyelinisierungen der weißen Substanz charakteristisch. Fragestellung: Biallele Mutationen in den Genen, TREX1 und SAMHD1, sind Ursache des AGS Typ 1 und AGS Typ 5. Die DNA-Exonuklease TREX1 degradiert intrazelluläre Nukleinsäure-Metabolite, die während zellulärer Prozesse gebildet werden. Die Triphosphohydrolase SAMHD1 spielt vorrangig in der Regulation des intrazellulären dNTP-Pools und des RNA-Metabolismus eine wichtige Rolle. Die Möglichkeit induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC) zu generieren und damit aus somatischen Zellen embryonale Stammzellen nachzubilden, um diese in unterschiedliche Zelltypen zu differenzieren, ermöglicht es, Zelltypen von schwer zugänglichen Geweben wie das Gehirn zu erforschen. Die vorliegende Arbeit untersucht die Auswirkungen einer TREX1- und SAMHD1-Defizienz in neuronalen Zellen. Dazu wurden reprogrammierte neuronale Modelle für das AGS Typ 1 und AGS Typ 5 etabliert. Ziel war hierbei die Aufdeckung bisher unbekannter molekularer Mechanismen, die zur Entstehung einer Typ 1-IFN-induzierten Inflammation und Neurodegeneration bei Patienten mit AGS führt. Material und Methoden: Als Ausgangspunkt dieser Arbeit dienten primäre Fibroblasten und PBMCs, die aus Hautbiopsien bzw. Blutproben von AGS-Patienten mit Mutationen in den Genen, TREX1 und SAMHD1, gewonnen wurden. Durch eine Reprogrammierung dieser patientenspezifischen Zellen wurden pluripotente Stammzellen induziert und anschließend über die Bildung von Embryonalkörperchen und neuronale Vorläuferzellen in neuronale Zellen differenziert. Um die etablierten neuronalen Zelllinien funktionell zu charakterisieren, wurden isogene Zelllinien etabliert. Hierbei wurde mittels Genomeditierung der patientenspezifischen iPS-Zellen die krankheitsassoziierte Mutation behoben und auf diese Weise isogene Zelllinien mit identischem genetischen Hintergrund generiert, die sich lediglich durch die Anwesenheit oder das Fehlen der krankheitsrelevanten Mutation unterscheiden. Unter Nutzung verschiedener molekularbiologischer Methoden wurden die patientenspezifischen neuronalen Zellen näher untersucht. Um die in Patienten-Fibroblasten nachgewiesene erhöhten Typ 1-IFN-Aktivität auch im neuronalen Zellmodell zu untersuchen, wurden in dieser Arbeit AGS-patientenspezifische neuronale Zellen und deren Vorläufer auf eine Erhöhung der IFN-Signatur überprüft. Um die etablierten neuronalen Zellmodelle eines AGS auf zellulären Stress in Form von ROS zu untersuchen, wurden patientenspezifische NPCs im Vergleich zu WT-Linien mittels DHR-Assay analysiert. Weiterhin wurde aus neuronalen Zellen mit AGS-spezifischen Mutationen mittels einer speziellen Kultivierungsmethode zur in vitro Separation von Axonen und Dendriten in proximale und distale Bereiche und einem nachfolgenden Tracking von Lysosomen und Mitochondrien per Live cell imaging die subzelluläre Verteilung dieser Organellen untersucht. Mittels immunhistochemischer Färbungen wurden zudem aus iPSC bzw. NPCs gewonnene neuronale Zellen mit AGS-spezifischen Mutationen die zelluläre Expression von Proteinen, die eine Rolle bei neurodegenerativen Krankheiten spielen, untersucht. Ergebnisse Die Nutzung der iPSC-Technologie eröffnet besonders für neurodegenerative Krankheiten die Möglichkeit, geeignete zelluläre Krankheitsmodelle zu schaffen. So existieren bereits eine Reihe iPSC-basierter Studien für Alzheimer, Parkinson, Chorea Huntington oder amyotropher Lateralsklerose. Mit der vorliegenden Arbeit wurden iPSC-basierte Modelle für das AGS entwickelt. Als Grundstein dieser Arbeit konnten aus somatischen Zellen von AGS-Patienten pluripotente Stammzellen erzeugt und als iPSCLinien etabliert werden. Die funktionelle Charakterisierung der patientenspezifischen Zellen erfolgte durch die Etablierung isogener Kontrollen mit identischem genetischen Hintergrund, um phänotypische Unterschiede direkt auf die krankheitsspezifischen Mutationen zurückzuführen. Die vorhandenen SAMHD1- und TREX1-Mutationen in den iPS-Zellen der Patienten wurden zunächst mittels Genomeditierung korrigiert. Anschließend wurden iPSC-Linien etabliert. Die patientenspezifischen iPS-Zellen sowie die isogenen Kontrollen wurden über neuronale Vorläuferzellen zu Neuronen differenziert, validiert und funktionell untersucht. Insgesamt konnte gezeigt werden, dass die etablierten Zellmodelle teilweise den Phänotyp eines AGS rekapitulieren. So entsprach die im AGS-Modell neuronaler Vorläuferzellen untersuchte Expression von IFN-stimulierten Genen (ISGs) weitgehend dem typischen Bild einer Interferonopathie und konnte durch den Vergleich mit isogenen Zelllinien auf die TREX1-Mutation der neuronalen Vorläuferzellen zurückgeführt werden. Eine Variabilität der ISG-Expression in ausdifferenzierten neuronalen Zellen könnte verschiedene Ursachen haben. Die Untersuchungen auf zellulären Stress in Form von ROS konnten zeigen, dass sowohl in TREX1- als auch SAMHD1-defizienten neuronalen Vorläuferzellen ein erhöhtes zelluläres Level an ROS vorliegt. Möglicherweise ist dies mit dem festgestellten langsamen Zellwachstum der patientenspezifischen Vorläuferzellen assoziiert. Weiterhin konnte mittels Live cell imaging ein verringertes Mobilitätsverhalten von Lysosomen und Mitochondrien in patienten- spezifischen neuronalen Zellen festgestellt werden, was die Vermutung nahelegt, dass die untersuchten AGS-verursachenden Mutationen in TREX1 und SAMHD1 ursächlich an der Neurodegeneration bei AGS-Patienten beteiligt sind. Ausblick: Die in dieser Arbeit erfolgreich etablierten reprogrammierten neuronalen AGS-Modelle können zukünftig dazu dienen, pathogenetische Prozesse im Gehirn zu untersuchen. Es konnten Grundlagen zur Aufklärung bisher unbekannter molekularer Mechanismen der Neurodegeneration bei AGS-Patienten geschaffen werden. Weiterführend kann das etablierte Modell zur Untersuchung weiterer Aspekte wie der Messung von transkriptomweiten Expressionsprofilen verwendet werden und somit neue Einblicke in die zellintrinsische Aktivierung der Typ 1-IFN-Achse von AGS-Patienten liefen. Um die Rolle von neuronal vorkommenden Proteinen oder Vesikeln bei neuronalen Erkrankungen, insbesondere bei AGS,zu untersuchen, stellt das patientenspezifische AGS-Modell eine wichtige Grundlage dar. Die hier aufgeführten immunhistochemischen Untersuchungen neuronaler Proteine können vertieft und in einem größeren Umfang ausgewertet werden. Die vorteilhaften Eigenschaften der iPSC-basierten neurodegenerativen Modelle ermöglichen neben grundlagenwissenschaftlichen Untersuchungen zur Krankheitsursache auch die Bearbeitung von Fragestellungen zur Behandlung von AGS-Patienten.

Die Reprogrammierung somatischer Zellen hat sich kürlich als leistungsfähige Technik für die Herstellung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS Zellen) aus terminal differenzierten Zellen bewährt. Trotz der großen Hoffnung, die sie speziell im Bezug auf patientenspezifische Stammzelltherapie darstellt, gibt es viele Hindernisse auf dem Weg zur Anwendung in der Humanmedizin, die sich von niedrigen Effizienzen bei der technischen Umsetzung bis hin zur unerwünschten Integration von Onkogenen in das menschliche Genom erstrecken. Aus diesem Grund ist es unabdingbar, unser Verständnis der zugrundeliegenden Prozesse und Mechanismen zu vertiefen. Durch neue Datengewinnungsmethoden und stetig wachsende biologische Komplexität hat sich der Denkansatz der Systembiologie in den letzten Jahrzehnten stark etabliert und erfährt eine fortwährende Entwicklung seiner Anwendbarkeit auf komplexe biologische und biochemische Zusammenhänge. Verschiedene mathematische Modellierungsmethoden werden auf den Reprogrammierungsprozess angewendet um Engpässe und mögliche Effizienz-Optimierungen zu erforschen. Es werden topologische Merkmale eines Pluripotenznetzwerkes untersucht, um Unterschiede zu zufällig generierten Netzen und so topologische Einschränkungen des biologisch relevanten Netzwerkes zu finden. Die Optimierung eines Booleschen Modells aus einem selbst kuratierten Netzwerk in Bezug auf Genexpressionsdaten aus Reprogrammierungsexperimenten gewährt tiefgreifende Einblicke in die ersten Schritte und wichtigsten Faktoren des Prozesses. Der Transkriptionsfaktor SP1 spielt hierbei eine wichtige Rolle zur Induktion eines intermediären, transkriptionell inaktiven Zustands. Ein probabilistisches Boole''sches Modell verdeutlicht das Zusammenspiel epigenetischer und transkriptioneller Kontrollprozesse zusammen, um Pluripotenz- und Zelllinien-Entscheidungen in Reprogrammierung und Differenzierung zu treffen. Erklärungen für die geringe Effizienz werden versucht. / Somatic Cell Reprogramming has emerged as a powerful technique for the generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from terminally differentiated cells in recent years. Although holding great promises for future clinical development, especially in patient specific stem cell therapy, the barriers on the way to a human application are manifold ranging from low technical efficiencies to undesirable integration of oncogenes into the genome. It is thus indispensable to further our understanding of the underlying processes involved in this technique. With the advent of new data acquisition technologies and an ever-growing complexity of biological knowledge, the Systems Biology approach has seen an evolution of its applicability to the elaborate questions and problems of researchers. Using different mathematical modeling approaches the process of somatic cell reprogramming is examined to find out bottlenecks and possible enhancements of its efficiency. I analyze the topological characteristics of a pluripotency network in order to find differences to randomly generated networks and thus deduce constraints of the biologically relevant network. The optimization of a Boolean model from a curated network against early reprogramming gene expression profiles reveals profound insights into the first steps and most important factors of the process. The transcription factor SP1 emerges to play an important role in the induction of an intermediate, transcriptionally inactive state. A probabilistic Boolean network (PBN) illustrates the interplay of transcriptional and epigenetic regulatory processes in order to explain pluripotency and cell lineage decisions in reprogramming and differentiation. Explanations for the low reprogramming efficiencies are tried.