Pathophysiologische und therapeutische Bedeutung der a1- und a2-Untereinheiten des GABAA-Rezeptors für Dystonien: Untersuchungen im dtsz Hamstermodell

Der ATP-getriggerte Ionenkanal P2X7 ist als purinerger Oberflächenrezeptor besonders auf Zellen des Immunsystems und auf Gliazellen im Nervensystem exprimiert. Seine Aktivierung führt zur Freisetzung proinflammatorischer Zytokine, zur Bildung reaktiver Sauerstoffspezies sowie zu einer Beeinflussung des Zellzyklus. Zwar konnte eine Beteiligung des Rezeptors an verschiedenen entzündlichen und degenerativen Erkrankungen nachgewiesen werden, allerdings bestehen nach wie vor viele Unstimmigkeiten darüber, ob P2X7 im Einzelfall protektiv oder schadend wirkt. Eine therapeutische Modulation des Rezeptors gestaltet sich daher bis heute schwierig. Weiterhin wurde trotz intensiver Bemühungen um selektive, potente P2X7-Modulatoren bisher kein Wirkstoff über Phase-II-Studien hinaus entwickelt. Der erste Teil der Arbeit beschreibt eine Studie zur Identifikation neuer P2X7-Modulatoren und deren Charakterisierung hinsichtlich Potenz, Bindeverhalten und Speziesspezifität. Ziel dieser Studie war es, die Basis für die Entwicklung möglicher neuer Therapeutika zu legen, für die ein hoher Bedarf besteht. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Beteiligung des P2X7-Rezeptors an den pathophysiologischen Vorgängen nach einem Hirninfarkt untersucht. Besondere Aufmerksamkeit lag dabei auf dem Einfluss, den der Rezeptor auf die Bildung eines begleitenden, oftmals fatalen Hirnödems ausübt. In einer Wirkstoffbibliothek enthaltene zugelassene Pharmaka und Naturstoffe wurden auf ihre Wirksamkeit am rekombinant exprimierten humanen P2X7-Rezeptor (hP2X7) getestet. Dazu wurde gemessen, inwiefern diese Wirkstoffe den P2X7-vermittelten Ca2+-Einstrom modulieren können. Für potenziell selektive Substanzen wurden Konzentrations-Wirkungs-Kurven erstellt. Für den potenten Inhibitor Tanshinon II A-Sulfonat (TIIAS) und den chemisch verwandten Wirkstoff Tanshinon II A (TIIA) erfolgte diese Untersuchung auch an den rekombinant exprimierten P2X7-Rezeptoren von Maus (mP2X7) und Ratte (rP2X7). Weiterhin erfolgte eine detaillierte, auf elektrophysiologischen Untersuchungen basierende Darstellung der pharmakodynamischen Eigenschaften von TIIAS. Die Selektivität der Wirkung gegenüber P2X2 und P2X4 wurde mithilfe entsprechender Zelllinien geprüft. Die Wirkung modulierender Pharmaka am nativen Rezeptor wurde in humanen, aus peripheren Blutmonozyten gereiften Makrophagen überprüft, wozu neben der Darstellung des Ca2+-Einstroms auch ein IL-1β-ELISA eingesetzt wurde. In allen Experimenten wurde die Beteiligung von P2X7 über bekannte Antagonisten verifiziert. Um zu klären, inwiefern P2X7 die pathophysiologischen Abläufe nach Hirninfarkt beeinflusst, wurde bei 20 P2X7-defizienten Mäusen (P2X7-/-) und bei 22 zugehörigen Wildtyp-Mäusen (WT) eine zerebrale Ischämie induziert, indem die mittlere Zerebralarterie mit einem dünnen Faden für 60 Minuten transient verschlossen wurde (middle cerebral artery occlusion, MCAO). In den folgenden 72 Stunden wurde über klinische Methoden und Magnetresonanzuntersuchungen die Entwicklung neurologischer Defizite, der Infarktgröße und des begleitenden Hirnödems evaluiert. Nach schmerzloser Tötung und Hirnentnahme wurden immunhistologisch die Aktivierung und Verteilung von Mikroglia und Astrozyten sowie der Zustand des Gefäßendothels untersucht. Sham-operierte Tiere dienten in allen Experimenten als Kontrollen. TIIAS hemmte hP2X7 mit einer IC50 von 4.3 μM, während die Potenz an mP2X7 geringer war und rP2X7 kaum geblockt wurde. TIIA modulierte P2X7 nicht. TIIAS hemmte als allosterischer Antagonist die Öffnung des Ionenkanals und band vermutlich an eine intrazelluläre Bindestelle. Die Wirkung von TIIAS wurde in humanen Makrophagen bestätigt, in denen der Wirkstoff den Ioneneinstrom und die IL-1β-Freisetzung hemmte. Obwohl die neurologische Untersuchung von P2X7-/-- und WT-Mäusen nach MCAO keine signifikanten Unterschiede ergab, zeigte sich in der bildgebenden Diagnostik, dass P2X7-/--Mäuse binnen 24 Stunden nach der OP ein signifikant stärkeres Hirnödem entwickelten, welches nicht durch Unterschiede in der Infarktgröße bedingt war. Der Infarkt führte in beiden Gruppen zu einer Gliaaktivierung, die im Fall der Mikroglia in Abwesenheit von P2X7 allerdings reduziert war. Differenzen hinsichtlich der Aktivierung von Astrozyten und der Expression von Laminin im Kapillarendothel wurden nicht festgestellt. Im Gegensatz zu TIIA, das häufig als gleichwertiger Wirkstoff eingesetzt wird, blockt TIIAS hP2X7 speziesspezifisch mit einer hohen Potenz. Maus und Ratte scheiden aufgrund der geringen Wirkung von TIIAS leider als Tiermodelle aus, um die Wirkung von TIIAS in vivo zu prüfen. Weitere Arbeiten sind notwendig, um die Potenz von TIIAS in anderen Spezies zu evaluieren oder Alternativen zum Tierversuch zu finden und eine mögliche therapeutische Anwendung bei Erkrankungen mit P2X7-Beteiligung zu testen. P2X7 beeinflusst die pathophysiologischen Vorgänge nach einem Hirninfarkt und begrenzt die Entwicklung eines zytotoxischen Hirnödems, nicht aber die des vasogenen Hirnödems, das sich zeitversetzt einstellt. Eine mögliche Erklärung für diesen Sachverhalt bieten die unterschiedlichen Funktionen, die Gliazellen zu verschiedenen Zeitpunkten nach zerebraler Ischämie übernehmen. Unsere Ergebnisse deuten auch darauf hin, dass verschiedene Tiermodelle des zerebralen Infarkts nicht in allen Punkten vergleichbar sind.:Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung........................................................................................................... 1 1.1 Purinerge Signaltransduktion.......................................................................... 1 1.2 P2X-Rezeptoren.............................................................................................. 2 1.3 Pharmakologie des P2X7-Rezeptors............................................................... 3 1.4 Physiologische und pathophysiologische Bedeutung des P2X7-Rezeptor...... 5 1.5 Gegenstand dieser Arbeit............................................................................... 7 2 Veröffentlichungen............................................................................................. 9 2.1 Erste Publikation............................................................................................. 9 2.1.1 Tanshinone II A sulfonate, but not tanshinone II A, acts as potent negative allosteric modulator of the human purinergic receptor P2X7................................. 9 2.1.2 Ergänzende Materialien zur ersten Publikation.......................................... 22 2.2 Zweite Publikation......................................................................................... 30 2.2.1 Lack of functional P2X7 receptor aggravates brain edema development after middle cerebral artery................................................................................. 30 2.2.2 Ergänzende Materialien zur zweiten Publikation......................................... 42 2.2.3 Erratum to: Lack of functional P2X7 receptor aggravates brain edema development after middle cerebral artery occlusion............................................ 46 3 Diskussion........................................................................................................ 49 4 Zusammenfassung........................................................................................... 55 5 Summary.......................................................................................................... 57 6 Literaturverzeichnis.......................................................................................... 59 7 Danksagung..................................................................................................... 66 / ATP-gated ion channel P2X7 is a purinergic cell surface receptor which is mainly expressed on immune and glia cell. Upon activation of P2X7, proinflammatory cytokines are released, reactive oxygen species are generated and the cell cycle may be altered. In this regard, it has been shown that P2X7 plays a role in diseases such as rheumatoid arthritis, Alzheimer’s disease and multiple sclerosis. However, results regarding protective or detrimental effects mediated by P2X7 under particular conditions are often inconsistent. Thus, up to now, any therapeutic modulation of the receptor remains a challenge. Although intensive research has been conducted to find selective, potent P2X7-modulators, no active compound has been developed beyond phase II clinical trials. The first part of this work describes a study realized to identify new P2X7 modulators and to characterize them in terms of pharmacodynamic properties like potency and species specificity. This study was aimed at providing a basis for the development of new therapeutic agents, which are urgently needed. During the second part of this work, the involvement of P2X7 in pathophysiological processes after cerebral infarction was examined. Particular attention was paid to the influence of the receptor on the development of an accompanying and often fatal brain edema. A compound library containing approved drugs and natural compounds was screened for modulators of the recombinantly expressed human P2X7 receptor (hP2X7). Therefor, their effect on P2X7-mediated Ca2+ influx was evaluated. Concentration-response-curves were established for potentially selective compounds. Tanshinone II A sulfonate (TIIAS) turned out to be a potent inhibitor of P2X7. Both TIIAS and tanshinone II A (TIIA), the natural compound TIIAS has been derived from, were also tested on recombinantly expressed mouse and rat P2X7 (mP2X7 and rP2X7, respectively). Furthermore, electrophysiological assays were conducted for a detailed characterization of mechanisms of P2X7 inhibition. Antagonist selectivity was revised using cell lines expressing purinergic receptors P2X2 and P2X4. Human monocyte-derived macrophages were used in fluorometric calcium and dye-uptake assays as well as an IL-1ß ELISA to evaluate the effects of modulating compounds on native P2X7. In all experiments, involvement of P2X7 was verified using established P2X7 antagonists. In order to evaluate whether modulation of P2X7 may affect the outcome after cerebral infarction, cerebral ischemia was induced in 20 P2X7-deficient mice (P2X7-/-) and 22 mice of their corresponding wild type (WT) by transiently occluding their middle cerebral artery for 60 minutes with a thin filament (middle cerebral artery occlusion, MCAO). During 72 hours following surgery, neurological deficits, infarct size and edema development were monitored, applying clinical examinations and magnetic resonance measurements. After humane killing and brain removal, different antibodies were used in order to evaluate the distribution and activation state of microglia and astrocytes as well as the condition of the vascular endothelium. Sham-operated animals were used as negative controls in all experiments. TIIAS blocked hP2X7 with an IC50 of 4.3 μM, whereas it proved to be less potent at mP2X7 and poorly modulated rP2X7. TIIA did not modulate P2X7. TIIAS acted as an allosteric antagonist and reduced the opening of the ion channel; it presumably bound to an intracellular binding site. The effect of TIIAS could be confirmed in human macrophages. In these cells, TIIAS inhibited the ATP-induced Ca2+ entry, dye-uptake and release of IL-1β. Although neurological examinations did not reveal significant differences between P2X7-/- and WT mice that underwent MCAO, diagnostic imaging revealed that P2X7-/- mice developed significantly more severe brain edema within 24 hours after surgery, a development that was not due to differences in infarct sizes. Both groups displayed clear signs of activation of glia cells, but only microglia activation was attenuated in the absence of P2X7. Differences regarding the activation state of astrocytes or the expression of laminin by capillary endothelial cells could not be detected. TIIAS species specifically blocks hP2X7 with a high potency. TIIA does not convey this effect although both compounds are frequently used interchangeably. Due to the low potency TIIAS displays at mP2X7 and rP2X7, these species unfortunately cannot be used as animal models to evaluate the drug’s effect in vivo. Further research is necessary to evaluate the potency of TIIAS at other species’ P2X7 receptors or to find alternativespurinerge Signaltransduktion, P2X7, Tanshinon II A-Sulfonat, zerebrale Ischämie, Hirnödem to animal testing in order to study possible therapeutic applications of TIIAS in P2X7-related diseases. P2X7 does affect pathophysiological events following cerebral ischemia and restricts cytotoxic brain edema development, but does not limit vasogenic cerebral edema formation, which develops at a later stage of the disease. The different functions fulfilled by glia cells at distinct points in time after infarction may provide an explanation for this interesting fact. The results presented also imply that diverse animal models of cerebral ischemia may not be entirely comparable due to differences regarding the pathogenesis of brain edema.:Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung........................................................................................................... 1 1.1 Purinerge Signaltransduktion.......................................................................... 1 1.2 P2X-Rezeptoren.............................................................................................. 2 1.3 Pharmakologie des P2X7-Rezeptors............................................................... 3 1.4 Physiologische und pathophysiologische Bedeutung des P2X7-Rezeptor...... 5 1.5 Gegenstand dieser Arbeit............................................................................... 7 2 Veröffentlichungen............................................................................................. 9 2.1 Erste Publikation............................................................................................. 9 2.1.1 Tanshinone II A sulfonate, but not tanshinone II A, acts as potent negative allosteric modulator of the human purinergic receptor P2X7................................. 9 2.1.2 Ergänzende Materialien zur ersten Publikation.......................................... 22 2.2 Zweite Publikation......................................................................................... 30 2.2.1 Lack of functional P2X7 receptor aggravates brain edema development after middle cerebral artery................................................................................. 30 2.2.2 Ergänzende Materialien zur zweiten Publikation......................................... 42 2.2.3 Erratum to: Lack of functional P2X7 receptor aggravates brain edema development after middle cerebral artery occlusion............................................ 46 3 Diskussion........................................................................................................ 49 4 Zusammenfassung........................................................................................... 55 5 Summary.......................................................................................................... 57 6 Literaturverzeichnis.......................................................................................... 59 7 Danksagung..................................................................................................... 66

Durch die vorliegende Studie wurde der Einfluss von Strukturelementen auf das Liege- und Aggressionsverhalten von Pferden in Gruppenhaltung untersucht. Die Strukturelemente sollten Rückzugsmöglichkeiten bieten, sowie in ihrem Bereich zur Aufhebung der Individualdistanz führen und dadurch die Fläche relativ vergrößern. Für die Versuche stellte das Haupt- und Landesgestüt Marbach drei unabhängige Pferdegruppen mit verschiedener Herdengröße zur Verfügung, die jeweils in Einraum- Innenlaufställen gehalten wurden. Die Datenerfassung fand zwischen 23 und sieben Uhr statt. Insgesamt wurden 336 Stunden Videomaterial ausgewertet. Beim Ruheverhalten wurden mit Hilfe des event-sampling-Verfahrens die Parameter Gesamtliegedauer, Dauer in Seitenlage, Dauer der Einzelphasen in Seitenlage und Abliegehäufigkeit pro Nacht erfasst. Es wurden Versuchsphasen ohne Strukturelemente und mit hängenden Planen als Strukturierung durchgeführt. Im ersten Stall kamen außerdem über einander gestapelte Strohballen zum Einsatz. Diese Art der Strukturierung stellte sich jedoch als nicht praktikabel heraus und führte im Vergleich zu den Planen zu einer signifikanten Verschlechterung der Gesamtliegedauer. In Stall 1 konnte man eine tendenzielle Verbesserung der Parameter Gesamtliegedauer und Gesamtdauer in Seitenlage durch das Anbringen von Planen sehen. In Stall 3 dagegen verschlechterte sich das Ruheverhalten in den Versuchsphasen mit Planen gegenüber den Versuchsphasen ohne Struktur. Die Werte der Gesamtdauer in Seitenlage nahmen signifikant ab. In Stall 2 zeigten sich keine Unterschiede in den verschiedenen Versuchsphasen. Möglicherweise ist die Wirkung der Strukturelemente auf das Liegeverhalten abhängig von der Flächengröße. Stall 1 hatte bezogen auf die Leitlinien des BMELV die größte und Stall 3 die kleinste Fläche. Bei den anderen Parametern des Liegeverhaltens gab es keine signifikanten Unterschiede in den verschiedenen Versuchsphasen. Mit Hilfe des time-sampling-Verfahrens wurde die Anzahl gleichzeitig liegender Pferde und gleichzeitig liegender Pferde in Seitenlage bestimmt. Auch hier zeigten sich keine Unterschiede in den verschiedenen Versuchsphasen. Bei der Gegenüberstellung der Werte der Gesamtliegedauer und der Gesamtdauer in Seitenlage mit dem Alter der Pferde (Stall 1 und Stall 3) und mit dem Integrationszeitpunkt (Stall 1) konnte kein Zusammenhang festgestellt werden. Beim Aggressionsverhalten wurden mit Hilfe des event-sampling-Verfahrens in den Ställen 2 und 3 verschiedene Arten von Aggressionen erfasst, die dann in die drei Intensitätsgrade Low-Level-, Mid-Level- und High-Level-Aggressionen unterteilt wurden. Neben der Anzahl wurde die Dauer der verschiedenen Aggressionen bewertet. Insgesamt konnte eine positive Wirkung der Planen auf das Aggressionsverhalten beobachtet werden. Die Gesamtanzahl an Aggressionen nahm in beiden Ställen tendenziell in den Versuchsphasen mit Planen ab. In Stall 3 konnte, wenn man die Aggressionen stundenweise betrachtet, ein signifikanter Unterschied festgestellt werden. Auch der Hinterhandschlag und die Aggressionen, welche das Ruheverhalten stören, verringerten sich tendenziell nach dem Anbringen von Strukturelementen. In beiden Ställen nahm die relative Häufigkeit von Mid-Level-Aggressionen nach dem Anbringen von Planen zu. Dagegen konnte bei den High-Level-Aggressionen und in Stall 3 bei den Low-Level-Aggressionen eine relative Abnahme beobachtet werden. Sowohl die Anzahl als auch die Dauer der Mid-Level-Aggressionen verringerten sich in Stall 3 stundenweise betrachtet signifikant in den Versuchsphasen mit Planen. In Stall 2 war bei den High-Level-Aggressionen sowohl bei der Dauer als auch bei der Anzahl eine signifikante Abnahme zu sehen. Wenn man das Aggressionsverhalten in Bezug zu der Fläche in den zwei Ställen betrachtet, schien diese vor allem einen Einfluss auf die High-Level-Aggressionen zu nehmen. Mit Hilfe des Rangindex der Pferde im Stall 3 wurde eine Rangordnung aufgestellt. Zwischen dem Platz der Pferde in der Rangordnung und den Parametern des Ruheverhaltens (Gesamtliegedauer, Gesamtdauer in Seitenlage) sowie dem Alter der Pferde konnte kein Zusammenhang festgestellt werden. Zwischen dem Rangindex und der Gesamtanzahl an Aggressionen bestand dagegen ein hoch signifikanter Zusammenhang. Im Rahmen dieser Studie ist das Anbringen von Strukturelementen in Bezug auf das Aggressionsverhalten in Einraum-Innenlaufställen von Pferden zu empfehlen. Die Wirkung auf das Liegeverhalten der Pferde sollte in weiteren Studien untersucht werden.

Einleitung: Die Dystonie ist eine neurologische Bewegungsstörung, bei der durch unwillkürliche anhaltende oder intermittierende Muskelkontraktionen schraubenartige Bewegungen oder Haltungen auftreten. Die häufigste genetische Form ist die DYT1 Dystonie, bei der eine Deletion von drei Basenpaaren im TOR1A-Gen zur Expression eines mutierten TorsinA-Proteins führt. Die unzureichende Aufklärung der Pathophysiologie von Dystonien erschwert die Entwicklung geeigneter Therapien. Studien an Tiermodellen und humanen Patienten deuten darauf hin, dass der Dystonie Fehlfunktionen innerhalb der Basalganglienschleife zugrunde liegen, an denen die Basalganglien, der Cortex, der Thalamus und das Kleinhirn beteiligt sind. Eine anerkannte Hypothese besagt, dass die Dystonie aus einem Ungleichgewicht zwischen Erregung und Hemmung resultiert. Eine abnorme neuronale Plastizität, z.B. eine erhöhte Langzeitpotenzierung und eine verminderte Langzeitdepression im Striatum, der Eingangsstruktur der Basalganglien, ebenso wie eine beeinträchtigte GABAerge Hemmung bei verschiedenen Arten von menschlicher Dystonie stützen die Hypothese des Verlustes der Hemmung im Striatum. Ziele der Untersuchungen: Striatale GABAerge Parvalbumin-reaktive Interneurone (PV+) nehmen eine zentrale Rolle in der hemmenden Kontrolle ein, indem sie die Aktivität striataler Projektionsneurone (MSN) und somit das Gleichgewichts zwischen Erregung und Hemmung im Striatum regulieren. Die Bedeutung eines Hemmungsverlustes im Striatum, ausgelöst durch eine mögliche Fehlfunktion striataler PV+, sollte in einem Tiermodell der DYT1 Dystonie untersucht werden. Mithilfe einer in-vivo-optogenetischen Inhibition striataler PV+ in dem DYT1 Knock-in-Mausmodell (DYT1 KI), ein ätiologisches Mausmodell ohne Ausprägung eines dystonen Phänotyps, wurden die Auswirkungen auf das lokomotorische Verhalten, auf die Entwicklung dystoner Symptome und auf die neuronale Aktivität untersucht. Tiere, Material und Methoden: Zu diesem Zweck wurde eine Mauslinie etabliert, welche die lichtsensitive Chloridionenpumpe Halorhodopsin (eNpHR3.0) in PV+ exprimiert und entweder heterozygot oder Wildtyp (WT) für die DYT1-Mutation ist. Dafür wurden unter Verwendung des Cre-LoxP Systems verschiedene Mauslinien miteinander gekreuzt. Die Untersuchungen wurden an männlichen sechs Monate alten DYT1 KI (n = 7) und WT-Mäusen (n = 8) durchgeführt, da diese geschlechts- und altersabhängig signifikante Verhaltensänderungen zeigten. Die Expression von Halorhodopsin wurde mittels Genotypisierung und Immunhistochemie verifiziert. Durch bilaterale stereotaktische Implantation optischer Fasern in das murine dorsale Striatum konnten Lichtimpulse an das eNpHR3.0 übertragen werden. Anregung mit gelbem Licht führt zur Aktivierung des eNpHR3.0, welches einen Chloridioneneinstrom ermöglicht und zu einer Hyperpolarisation der striatalen PV+ führt. Es wurden verschiedene Stimulationsprotokolle verwendet, welche sich in der Länge und dem Intervall der Lichtimpulse sowie der Dauer der Stimulation unterschieden. Dabei befanden sich die Mäuse im „open field” und ihre lokomotorische Aktivität sowie weitere Parameter, z.B. Thigmotaxis und Putzverhalten, wurden beurteilt. Untersuchungen zur neuronalen Aktivität wurden sowohl an den stimulierten (DYT1 KI n = 7, WT n = 6) als auch an naiven Tieren (DYT1 KI n = 6, WT n = 8) aus derselben Mauslinie durchgeführt. Effekte auf die neuronale Aktivität wurden anhand der Expression des neuronalen Markers c-Fos untersucht. Die gesamte neuronale Aktivität wurde durch stereologisches Zählen c-Fos-positiver Neurone analysiert. Die Aktivität striataler PV+ und cholinerger Interneurone (CIN) wurde durch Doppelmarkierungen mit c-Fos- und eNpHR3.0 bzw. Cholinacetyltransferase (ChAT) beurteilt. Die grafische Darstellung und statistische Auswertung wurde mit SigmaPlot14.0 durchgeführt und erfolgte mittels Varianzanalyse (ein- und zweifaktorielle ANOVA, mit und ohne Messwiederholung) gefolgt von einem Post-Hoc-Test für Mehrfachvergleiche (Holm-Sidak). Das Signifikanzniveau wurde bei p < 0,05 festgesetzt. Ergebnisse: Die optogenetischen Stimulationen mit gelben Lichtimpulsen bei unterschiedlichen Impulsdauern und Intervalllängen und mit einer Stimulationsdauer von bis zu 60 Minuten lösten in den Mäusen keine abnormalen Bewegungen, wie dystone Symptome, aus. Weiterhin waren sowohl das lokomotorische Verhalten als auch die weiteren analysierten Parameter unter Stimulation unverändert. Dagegen zeigten immunhistochemische Untersuchungen Genotyp-abhängige Unterschiede zur neuronalen Aktivität. Im Gegensatz zu stimulierten WT-Mäusen zeigten stimulierte DYT1 KI eine verringerte striatale neuronale Gesamtaktivität (p = 0,002), d.h. weniger c-Fos reaktive Neurone, welches sich über das gesamte Striatum erstreckt. Weiterhin zeigten stimulierte DYT1 KI-Mäuse eine geringere Aktivität eNpHR3.0-positiver Neurone als stimulierte WT (p = 0,31), also eine anhaltende Hemmung der PV+, sowie eine erhöhte Aktivierung cholinerger Interneurone nach optogenetischer Hemmung von PV+ (vs. WT p < 0,001, vs. naive DYT1 KI p < 0,001). Schlussfolgerungen: Da die in-vivo-optogenetische Hemmung striataler PV+ nicht ausreichte, um in DYT1 KI-Mäusen dystone Symptome hervorzurufen, scheinen zumindest kürzere hemmende Defizite über PV+ für die Ausprägung der DYT1 Dystonie keine zentrale Rolle zu spielen. Ebenso hatte die optogenetische Hemmung von PV+ keinen Einfluss auf das lokomotorische Verhalten von WT und DYT1 KI-Mäusen. Dennoch deuten die Genotyp-bezogenen Unterschiede in der neuronalen Aktivität zwischen stimulierten Mäusen auf eine abnorme Reaktion auf die optogenetische Hemmung von PV+ und eine striatale Fehlfunktion bei den DYT1 KI-Mäusen hin. Weiterführende Studien aus einer Kombination von optogenetischen Manipulationen von PV+ und elektrophysiologischen Untersuchungen bzw. Neurotransmittermessungen können Erklärungsansätze für Veränderungen in der neuronalen Aktivität liefern und Einblicke in Neurotransmitterimbalancen, die der Dystonie zugrunde liegen, geben.:Abkürzungsverzeichnis 1. Einleitung 2. Literaturübersicht 2.1 Definition und Einteilung von Dystonien 2.1.1 Die primäre DYT1 Torsionsdystonie 2.2 Diagnose und Therapieoptionen von Dystonien 2.3 Tiermodelle primärer Dystonien 2.3.1 Das DYT1 Knock-in-Mausmodell 2.4 Die Basalganglien: Neuroanatomie und Physiologie 2.4.1 Nervenzellen des Striatums 2.4.1.1 Striatale Projektionsneurone 2.4.1.2 Striatale Interneurone 2.4.2 Basalganglien und Dystonie: pathophysiologische Veränderungen 2.4.3 Striatale Parvalbumin-reaktive Interneurone 2.4.3.1 Physiologische Eigenschaften 2.4.3.2 Bedeutung für Verhalten, Motorik und Dystonien 2.4.3.3 Inhibition Parvalbumin-reaktiver Interneurone mithilfe der In-vivo-Optogenetik 3. Fragestellung 4. Publikation 5. Diskussion 5.1 Methodische Aspekte 5.2 Ergebnisse 5.2.1 Verhaltensuntersuchungen 5.2.2 Neuronale Aktivität 5.3 Schlussfolgerungen und Ausblick 6. Zusammenfassung 7. Summary 8. Literaturverzeichnis 9. Danksagung / Introduction: Dystonia is a movement disorder characterized by abnormal involuntary movements or postures due to sustained or intermittent muscle contractions. The most common inherited form is DYT1 dystonia, in which a deletion of three base pairs in the TOR1A gene leads to the expression of a mutant torsinA protein. The insufficient elucidation of the pathophysiology of dystonia hampers the development of effective treatments. Studies in animal models and in human patients suggest that dystonia underlies dysfunction within the basal ganglia loop involving the basal ganglia, cortex, thalamus and cerebellum. An accepted hypothesis is that dystonia results from an imbalance between excitation and inhibition. Abnormal neuronal plasticity, e.g., increased long-term potentiation and decreased long-term depression in the striatum, the input structure of the basal ganglia, as well as impaired GABAergic inhibition in various types of human dystonia support the hypothesis of a loss of inhibition in the striatum. Aim: Striatal GABAergic parvalbumin-reactive interneurons (PV+) play a central role in inhibitory control by regulating the activity of striatal projection neurons (MSN) and consequently the balance between excitation and inhibition in the striatum. The importance of a loss of inhibition in the striatum, triggered by possible dysfunction of striatal PV+, should be investigated in an animal model of DYT1 dystonia. Using in vivo optogenetic inhibition of striatal PV+ in the DYT1 knock-in mouse model (DYT1 KI), a genetic mouse model without manifestation of a dystonic phenotype, the effects on locomotor behavior, on the development of dystonic symptoms and on neuronal activity were investigated. Animals, material and methods: A mouse line expressing the light-sensitive chloride ion pump halorhodopsin (eNpHR3.0) in PV+ and either heterozygous or wildtype (wt) for the DYT1 mutation was established. For this, different mouse lines were crossed using the Cre-LoxP system. Studies were performed in male six-month-old DYT1 KI (n = 7) and wt mice (n = 8), as they showed significant behavioral abnormalities in a sex- and age-dependent manner. Halorhodopsin expression was verified by genotyping and immunohistochemistry. After bilateral stereotactic implantation of optical fibers into the murine dorsal striatum, light pulses could be transmitted to eNpHR3.0. Excitation with yellow light leads to activation of eNpHR3.0, which leads to chloride ion influx and results in hyperpolarization of striatal PV+. Different stimulation protocols were used, differing in the length and interval of light pulses and the duration of stimulation. During optogenetic stimulation, mice were in the 'open field' and their locomotor activity and other parameters, e.g., thigmotaxis and grooming behavior, were assessed. Studies on neuronal activity were performed on both stimulated (DYT1 KI n = 7, WT n = 6) and naive animals (DYT1 KI n = 6, WT n = 8) from the same mouse line. For neuronal activity studies, the expression of the neuronal marker c-Fos was examined. Overall neuronal activity was analyzed by stereological counting of c-Fos-positive neurons. Activity of striatal PV+ and cholinergic interneurons (CIN) was determined by colabeling with c-Fos- and eNpHR3.0 or choline acetyltransferase (ChAT). All plots and statistical analyses were performed using SigmaPlot14.0 and analyzed by analysis of variance (one-way and two-way ANOVA, with and without repeated measures) followed by a multiple comparison post-hoc test (Holm-Sidak). Significance was assigned at p < 0.05. Results: In stimulated mice, optogenetic inhibition using yellow light pulses at different pulse durations and interval lengths and with a stimulation duration up to 60 minutes did not induce abnormal movements, such as dystonic signs. Furthermore, both locomotor behavior and other parameters analyzed remained unchanged under stimulation. In contrast, immunohistochemical studies revealed genotype-dependent differences in neuronal activity. In contrast to stimulated wt mice, stimulated DYT1 KI showed reduced overall striatal neuronal activity (p = 0.002), i.e., fewer c-Fos reactive neurons, spreading over the entire striatum. Likewise, stimulated DYT1 KI mice showed decreased activity of eNpHR3.0-positive neurons than stimulated wt (p = 0.31), indicating lasting inhibition of PV+, as well as increased activation of cholinergic interneurons after optogenetic inhibition of PV+ (vs. WT p < 0.001, vs. naive DYT1 KI p < 0.001). Conclusions: Since in vivo optogenetic inhibition of striatal PV+ was not sufficient to elicit dystonic symptoms in DYT1 KI mice, at least short-time inhibition seems not to play a central role in the manifestation of DYT1 dystonia. Similarly, optogenetic inhibition of PV+ had no effect on locomotor behavior in wt and DYT1 KI mice. Despite this, genotype differences in neuronal activity between stimulated mice suggest an abnormal response to optogenetic inhibition of PV+ and striatal dysfunction in the DYT1 KI mice. Further studies combining optogenetic manipulations of PV+ and electrophysiological or neurotransmitter measurements may provide explanatory approaches to changes in neuronal activity and give insights into neurotransmitter imbalances underlying dystonia.:Abkürzungsverzeichnis 1. Einleitung 2. Literaturübersicht 2.1 Definition und Einteilung von Dystonien 2.1.1 Die primäre DYT1 Torsionsdystonie 2.2 Diagnose und Therapieoptionen von Dystonien 2.3 Tiermodelle primärer Dystonien 2.3.1 Das DYT1 Knock-in-Mausmodell 2.4 Die Basalganglien: Neuroanatomie und Physiologie 2.4.1 Nervenzellen des Striatums 2.4.1.1 Striatale Projektionsneurone 2.4.1.2 Striatale Interneurone 2.4.2 Basalganglien und Dystonie: pathophysiologische Veränderungen 2.4.3 Striatale Parvalbumin-reaktive Interneurone 2.4.3.1 Physiologische Eigenschaften 2.4.3.2 Bedeutung für Verhalten, Motorik und Dystonien 2.4.3.3 Inhibition Parvalbumin-reaktiver Interneurone mithilfe der In-vivo-Optogenetik 3. Fragestellung 4. Publikation 5. Diskussion 5.1 Methodische Aspekte 5.2 Ergebnisse 5.2.1 Verhaltensuntersuchungen 5.2.2 Neuronale Aktivität 5.3 Schlussfolgerungen und Ausblick 6. Zusammenfassung 7. Summary 8. Literaturverzeichnis 9. Danksagung

Dynamik histomorphologischer Veränderungen in der Leber von Milchkühen im peripartalen Zeitraum Einleitung Das Lipomobilisationssydrom verursacht bei Milchkühen vielfältige Produktionskrankheiten und hohe ökonomische Verluste. Aus der Humanmedizin ist bekannt, dass chronische Leberverfettungen zu Steatohepatitiden und im Weiteren zu Leberzirrhosen führen können. Ziel der Untersuchung Ziel der Untersuchung war es, Schädigungen des Lebergewebes unter Betrachtung der Dynamik verschiedener Einzelmerkmale (Fett- und Glykogeneinlagerung, Hepatitis, Fibrose) histopathologisch vergleichend darzustellen und dabei auf Parallelen zur nichtalkoholischen Steatohepatitis (NASH) des Menschen zu untersuchen. Weiterhin sollen Einflüsse des Temperatur-Feuchtigkeits-Indexes (THI) auf die Dynamik histomorphologischer Leberveränderungen untersucht werden. Material und Methoden In die Studie wurden 80 Deutsch Holstein Kühe einbezogen. Zwei Gruppen (je n = 20) erhielten (5 oder 10 ml / 100 kg Körpergewicht) Butaphosphan und Cyanocobalamin (BCC) und eine Gruppe (n = 40) ein Placebo. Leberbioptate wurden 14 Tage (d) ante partum (a.p.) sowie 7, 28, 42 d post partum (p.p.) entnommen. Sie wurden mittels vier verschiedener Verfahren (Hämalaun-Eosin, Sudan III, Periodsäure-Schiff-Reaktion und Pikrosiriusrot) aufgearbeitet und auf Fett- und Glykogeneinlagerungen sowie degenerative, entzündliche, fibrotische und proliferative Lebergewebsveränderungen semiquantitativ untersucht. In der statistischen Auswertung wurden Effekte aus den Leberbiopsiezeitpunkten, der Laktationsanzahl, der metaphylaktischen BCC Behandlung, des THIs und der Metabotypen (Massenspektrometrie von Leberproben) ausgewertet. Mittels einer Metabolomanalyse wurden drei verschiedene Metabotypen identifiziert. Ergebnisse Bereits in den ersten Wochen vor der Abkalbung wiesen die Kühe 37 % ggr. bis mgr. Fetteinlagerungen in der Leber auf. Bis zur ersten Woche p.p. konnte ein deutlicher Anstieg des Leberfettgehaltes beobachtet werden (66 % mgr. bis hgr.), der bis einschließlich der sechsten Woche p.p. wieder abfiel (ca. 25 % mgr. bis hgr.). Der Grad der Leberverfettung korrelierte positiv mit dem Anteil an Leberzelldegenerationen und negativ mit den Glykogeneinlagerungen. Trotz hgr. Leberverfettungen kam es zu keinem Zeitpunkt zu einer vollständigen Glykogendepletion in den Leberzellen. Bei 39 % der Tiere wurde während der gesamten Transitperiode eine mgr. bis hgr. lymphozytäre Hepatitis nachgewiesen. Kühe ab der fünften Laktation wiesen signifikant häufiger perisinusoidale Fibrosen auf. In keinem Fall wurden hgr. Fibrosen diagnostiziert. Kühe einer der drei Metabotypengruppen wiesen eine höhere Chance für vermehrte Fettinfiltrationen, geringere Glykogeneinlagerungen und vermehrte degenerative, entzündlich-fibrotische sowie proliferative Leberparenchymveränderungen auf. Die Auswertung der Fütterungsdaten lässt einen Zusammenhang zwischen der Fütterung von Grassilage mit einer verminderten Qualität (hoher Rohascheanteil, erhebliche Schwankungen in Trockensubstanz- und Nährstoffgehalten), dem Lebermetabolom und histomorphologischen Veränderungen der Kühe dieser Metabotypengruppe vermuten. Für die Behandlung mit BCC konnten keine signifikanten Effekte festgestellt werden. Der THI hatte einen positiven Einfluss auf den Grad der Fetteinlagerung und die Zelldegenerationen sowie einen negativen Einfluss auf den Grad der Glykogeneinlagerung. Schlussfolgerungen Während des peripartalen Zeitraums kam es in der Leber von Milchkühen zur Fettakkumulationen und Glykogendepletionen sowie zu Hepatitiden und Leberzelldegenerationen. Letztere sind Hinweise einer Steatohepatitis, ähnlich einer NASH des Menschen. Vor allem bei älteren Kühen waren perisinusoidale Fibrosen nachweisbar, die eine Vorstufe von Leberfibrosen sein können und mit höheren Milchleistungen sowie dem damit verbundenen erhöhten Blutfluss in der Leber zusammenhängen könnten. Die Ergebnisse weisen Zusammenhänge zwischen einem ausgeprägteren Körperkonditionsverlust, vermehrten Fettinfiltrationen, geringeren Glykogeneinlagerungen sowie wechselseitige Beziehungen zwischen degenerativen, entzündlichen, fibrotischen und proliferativen Leberveränderungen auf. Als ein ursächlicher Faktor wird eine verminderte Grassilagequalität vermutet. Durch den THI werden Fett- und Glykogeneinlagerungen sowie Leberzelldegenerationen beeinflusst.:1. Einleitung 2. Literaturübersicht 2.1 Die Funktionen der Leber bei Rindern 2.1.1 Allgemein 2.1.2 „First pass effect“ 2.1.3 Entgiftung 2.1.4 Leber als Stoffwechselorgan 2.1.4.1 Allgemein 2.1.4.2 Aminosäuren- und Proteinstoffwechsel 2.1.4.2.1 Bedeutung 2.1.4.2.2 Proteinsynthese 2.1.4.2.3 Aminosäuresynthese und -abbau 2.1.4.2.4 Harnstoffsynthese 2.1.4.3 Fettstoffwechsel 2.1.4.3.1 Bedeutung 2.1.4.3.2 Cholesterolbiosynthese 2.1.4.3.3 Fettsäuresynthese 2.1.4.3.4 Fettsäureoxidation 2.1.4.3.5 Ketogenese 2.1.4.4 Kohlenhydratstoffwechsel 2.1.4.4.1 Bedeutung 2.1.4.4.2 Gluconeogenese 2.1.4.4.3 Glykogensynthese 2.1.4.4.4 Glykogenolyse 2.1.4.4.5 Glykolyse 2.1.5 Leber als Speicherorgan 2.1.5.1 Allgemein 2.1.5.2 Glykogen 2.1.5.2.1 Allgemein 2.1.5.2.2 Bedeutung 2.1.5.2.3 Einflussfaktoren 2.1.5.3 Fett 2.1.5.3.1 Allgemein 2.1.5.3.2 Bedeutung 2.1.5.3.3 Einflussfaktoren 2.2 Das Lipomobilisationssyndrom der Milchkuh und die nichtalkoholische Leberverfettung des Menschen 2.2.1 Lipomobilisationssyndrom der Milchkuh 2.2.1.1 Allgemein 2.2.1.2 Pathogenese 2.2.1.3 Bedeutung und Epidemiologie 2.2.2 Nichtalkoholische Leberverfettung des Menschen 2.2.2.1 Allgemein 2.2.2.2 Pathogenese 2.2.2.3 Bedeutung und Epidemiologie 2.2.3 Hinweise einer nichtalkoholischen Leberverfettung bei Milchkühen 2.3 Die Lichtmikroskopie zur histologischen Beurteilung von Lebergewebsveränderungen 2.3.1 Besonderheiten 2.3.2 Diagnostische Beurteilung von Lebergewebe 2.3.3 Bisherige histologische Untersuchungen der Leber von Rindern und Forschungsbedarf 2.4 Zusammenfassende Schlussfolgerungen aus dem Literaturstudium und Arbeitshypothesen 3. Material und Methoden 3.1 Studienprotokoll 3.2 Klimadaten 3.3 Entnahme der Leberbioptate 3.4 Aufbereitung der Leberbioptate für die histologische Untersuchung 3.5 Histopathologische Befundung 3.5.1 Durchführung der histopathologischen Untersuchung 3.5.2 Beurteilung der Fetteinlagerung 3.5.3 Beurteilung der Glykogeneinlagerung 3.5.4 Beurteilung der degenerativen, entzündlichen, fibrotischen und proliferativen Veränderungen 3.6 Ergänzende Statistik (Temperatur-Feuchtigkeits-Index) 4. Publikation 5. Weitere Ergebnisse 5.1 Vorkommen von Glykogeneinlagerungen bei gleichzeitiger Leberverfettung 5.2 Dynamik der Fett- und Glykogeneinlagerung im Leberläppchen 5.3 Dynamik der Hepatitis im Untersuchungszeitraum 5.4 Dynamik der Fibrose im Untersuchungszeitraum 5.5 Fallbeschreibungen von Einzeltieren mit entzündlichen, fibrotischen und proliferativen Besonderheiten 5.6 Temperatur-Feuchtigkeits-Index Einflüsse 6. Diskussion 6.1 Der Temperatur-Feuchtigkeits-Index und sein Einfluss auf die Histomorphologie 6.2 Periportale Fettakkumulation und Glykogendepletion 6.3 Periportales Auftreten von Hepatitis und Fibrose 6.4 Einzelfälle mit entzündlichen, fibrotischen und proliferativen Veränderungen im Lebergewebe und deren mögliche Ursachen 6.5 Vergleich zwischen Lipomobilisationssyndrom der Milchkuh und der nichtalkoholischen Steatohepatitis des Menschen 6.5.1 Vorkommen von Leberverfettung 6.5.2 Vorkommen von Hepatitis 6.5.3 Vorkommen von Leberzelldegeneration 6.5.4 Vorkommen von Leberfibrose 6.5.5 Unterscheidung der Ursachen und Folgen einer Leberverfettung bei Mensch und Rind 6.6 Klinische Relevanz der histopathologischen Leberveränderungen 7. Zusammenfassung 8. Summary 9. Literaturverzeichnis 10. Danksagung 11. Anhang 11.1 Übersicht histopathologischer Untersuchungen der Leber von Rindern 11.2 Färbeanleitungen 11.2.1 Hämalaun-Eosin-Färbung 11.2.1.1 Verfahrensschritte 11.2.1.2 Benötigte Reagenzien 11.2.1.3 Ergebnis 11.2.2 Sudan-III-Hämalaun-Färbung 11.2.2.1 Verfahrensschritte 11.2.2.2 Benötigte Reagenzien 11.2.2.3 Ergebnis 11.2.3 Periodsäure-Schiff-Reaktion und Amylase Reaktion 11.2.3.1 Verfahrensschritte 11.2.3.2 Benötigte Reagenzien 11.2.3.3 Ergebnis 11.2.3.4 Amylase-Kontrollreaktion 11.2.3.4.1 Methode 11.2.3.4.2 Ergebnis 11.2.4 Pikrosiriusrot-Färbung 11.2.4.1 Verfahrensschritte 11.2.4.2 Benötigte Reagenzien 11.2.4.3 Ergebnis 11.3 Untersuchungsprotokolle / Dynamic histomorphological changes of the liver parenchyma during the transition period in dairy cows Introduction Lipomobilisation sydrome is associated with multiple production diseases in dairy cows and causes substantial economic losses. In people, chronic hepatic lipidosis can lead to steatohepatitis and subsequently liver cirrhosis. Objectives The main goal of this study was to investigate the histopathological changes in the liver parenchyma in terms of hepatitis, fibrosis and fat and glycogen deposits in dairy cows. Additionally, the histomorphological lesions in dairy cows with lipomobilisation syndrome were compared with those seen in people with non-alcoholic steatohepatitis (NASH). The effects of the temperature-humidity index (THI) on the dynamics of histomorphological hepatic changes were also evaluated. Material and Methods A total of 80 German Holstein cows were divided into three groups: the first group consisted of 20 cows that received 5 ml / 100 kg of butaphosphan and cyanocobalamin (BCC); the second group consisted of 20 cows that received 10 ml / 100 kg of BCC; and the third group consisted of 40 that cows received a placebo. Liver biopsy was carried out 14 days antepartum (a.p.) and 7, 28 and 42 days postpartum (p.p.). The liver tissue was processed routinely and stained with haematoxylin and eosin, sudan III, periodic acid-Schiff and picrosirius red stains. The histological sections were assessed semiquantitatively for fat and glycogen content and for degenerative, inflammatory, fibrotic and proliferative changes. The effects of time of biopsy, lactation number, metaphylactic BCC treatment, THI and metabotype (mass spectrometry of liver tissue) were examined statistically. A metabolom analysis was used to identify three metabotypes. Results Mild to moderate fat infiltration was seen in the liver of 37 % of cows in the last two weeks a.p. The degree of fat infiltration increased considerably from two weeks a.p. until the end of the first week when it was moderate to severe in 66 % of the cows. It then decreased again until the end of the study period when it was moderate to severe in 25 % of the cows. Lipidosis was significantly and positively correlated with the severity of hepatocyte degeneration and negatively correlated with the degree of glycogen deposition. Complete glycogen depletion of hepatocytes was not observed in cows even in the presence of severe hepatic lipidosis. Moderate to severe lymphocytic hepatitis was seen in 39 % of cows throughout the study period, and cows with lactation numbers five or greater had perisinusoidal fibrosis significantly more often than younger cows. Severe fibrosis of the liver did not occur. Cows of one of the three metabotypes had an increased risk of fatty infiltration of the liver, lower glycogen storage and degenerative, inflammatory, fibrotic, and proliferative changes of the liver parenchyma. Based on ration analysis, feeding of poor-quality grass silage (high ash content, fluctuations in dry matter and nutrient content) appeared to be associated with the liver metabolom and histomorphological liver changes. Treatment with BCC had no significant effects on any of the variables measured. The THI had a positive effect on the degree of lipid deposition and hepatocyte degeneration and a negative effect on the degree of glycogen deposition. Conclusion During the transition period, the liver of dairy cows is characterised by fat accumulation and glycogen depletion and histological signs of hepatitis and hepatocyte degeneration. The latter suggests steatohepatitis analogous to NASH in people. Perisinusoidal fibrosis was seen particularly in older cows and may represent an early stage of fibrosis of the liver. It is conceivable that these changes are associated with increased perfusion of the liver in association with increased milk production. There were correlations between pronounced loss of body condition, fatty infiltration of the liver and lower glycogen storage and degenerative, inflammatory, fibrotic, and proliferative changes of the liver parenchyma. These findings suggest that poor-quality grass silage was causative factor. Changes in the THI may also affect fat and glycogen deposition and liver cell degeneration in the liver.:1. Einleitung 2. Literaturübersicht 2.1 Die Funktionen der Leber bei Rindern 2.1.1 Allgemein 2.1.2 „First pass effect“ 2.1.3 Entgiftung 2.1.4 Leber als Stoffwechselorgan 2.1.4.1 Allgemein 2.1.4.2 Aminosäuren- und Proteinstoffwechsel 2.1.4.2.1 Bedeutung 2.1.4.2.2 Proteinsynthese 2.1.4.2.3 Aminosäuresynthese und -abbau 2.1.4.2.4 Harnstoffsynthese 2.1.4.3 Fettstoffwechsel 2.1.4.3.1 Bedeutung 2.1.4.3.2 Cholesterolbiosynthese 2.1.4.3.3 Fettsäuresynthese 2.1.4.3.4 Fettsäureoxidation 2.1.4.3.5 Ketogenese 2.1.4.4 Kohlenhydratstoffwechsel 2.1.4.4.1 Bedeutung 2.1.4.4.2 Gluconeogenese 2.1.4.4.3 Glykogensynthese 2.1.4.4.4 Glykogenolyse 2.1.4.4.5 Glykolyse 2.1.5 Leber als Speicherorgan 2.1.5.1 Allgemein 2.1.5.2 Glykogen 2.1.5.2.1 Allgemein 2.1.5.2.2 Bedeutung 2.1.5.2.3 Einflussfaktoren 2.1.5.3 Fett 2.1.5.3.1 Allgemein 2.1.5.3.2 Bedeutung 2.1.5.3.3 Einflussfaktoren 2.2 Das Lipomobilisationssyndrom der Milchkuh und die nichtalkoholische Leberverfettung des Menschen 2.2.1 Lipomobilisationssyndrom der Milchkuh 2.2.1.1 Allgemein 2.2.1.2 Pathogenese 2.2.1.3 Bedeutung und Epidemiologie 2.2.2 Nichtalkoholische Leberverfettung des Menschen 2.2.2.1 Allgemein 2.2.2.2 Pathogenese 2.2.2.3 Bedeutung und Epidemiologie 2.2.3 Hinweise einer nichtalkoholischen Leberverfettung bei Milchkühen 2.3 Die Lichtmikroskopie zur histologischen Beurteilung von Lebergewebsveränderungen 2.3.1 Besonderheiten 2.3.2 Diagnostische Beurteilung von Lebergewebe 2.3.3 Bisherige histologische Untersuchungen der Leber von Rindern und Forschungsbedarf 2.4 Zusammenfassende Schlussfolgerungen aus dem Literaturstudium und Arbeitshypothesen 3. Material und Methoden 3.1 Studienprotokoll 3.2 Klimadaten 3.3 Entnahme der Leberbioptate 3.4 Aufbereitung der Leberbioptate für die histologische Untersuchung 3.5 Histopathologische Befundung 3.5.1 Durchführung der histopathologischen Untersuchung 3.5.2 Beurteilung der Fetteinlagerung 3.5.3 Beurteilung der Glykogeneinlagerung 3.5.4 Beurteilung der degenerativen, entzündlichen, fibrotischen und proliferativen Veränderungen 3.6 Ergänzende Statistik (Temperatur-Feuchtigkeits-Index) 4. Publikation 5. Weitere Ergebnisse 5.1 Vorkommen von Glykogeneinlagerungen bei gleichzeitiger Leberverfettung 5.2 Dynamik der Fett- und Glykogeneinlagerung im Leberläppchen 5.3 Dynamik der Hepatitis im Untersuchungszeitraum 5.4 Dynamik der Fibrose im Untersuchungszeitraum 5.5 Fallbeschreibungen von Einzeltieren mit entzündlichen, fibrotischen und proliferativen Besonderheiten 5.6 Temperatur-Feuchtigkeits-Index Einflüsse 6. Diskussion 6.1 Der Temperatur-Feuchtigkeits-Index und sein Einfluss auf die Histomorphologie 6.2 Periportale Fettakkumulation und Glykogendepletion 6.3 Periportales Auftreten von Hepatitis und Fibrose 6.4 Einzelfälle mit entzündlichen, fibrotischen und proliferativen Veränderungen im Lebergewebe und deren mögliche Ursachen 6.5 Vergleich zwischen Lipomobilisationssyndrom der Milchkuh und der nichtalkoholischen Steatohepatitis des Menschen 6.5.1 Vorkommen von Leberverfettung 6.5.2 Vorkommen von Hepatitis 6.5.3 Vorkommen von Leberzelldegeneration 6.5.4 Vorkommen von Leberfibrose 6.5.5 Unterscheidung der Ursachen und Folgen einer Leberverfettung bei Mensch und Rind 6.6 Klinische Relevanz der histopathologischen Leberveränderungen 7. Zusammenfassung 8. Summary 9. Literaturverzeichnis 10. Danksagung 11. Anhang 11.1 Übersicht histopathologischer Untersuchungen der Leber von Rindern 11.2 Färbeanleitungen 11.2.1 Hämalaun-Eosin-Färbung 11.2.1.1 Verfahrensschritte 11.2.1.2 Benötigte Reagenzien 11.2.1.3 Ergebnis 11.2.2 Sudan-III-Hämalaun-Färbung 11.2.2.1 Verfahrensschritte 11.2.2.2 Benötigte Reagenzien 11.2.2.3 Ergebnis 11.2.3 Periodsäure-Schiff-Reaktion und Amylase Reaktion 11.2.3.1 Verfahrensschritte 11.2.3.2 Benötigte Reagenzien 11.2.3.3 Ergebnis 11.2.3.4 Amylase-Kontrollreaktion 11.2.3.4.1 Methode 11.2.3.4.2 Ergebnis 11.2.4 Pikrosiriusrot-Färbung 11.2.4.1 Verfahrensschritte 11.2.4.2 Benötigte Reagenzien 11.2.4.3 Ergebnis 11.3 Untersuchungsprotokolle

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Einleitung: Kardiovaskuläre Erkrankungen stellen weltweit die häufigste Todesursache dar. Bis heute gibt es keine ursächliche Therapie für die Herzinsuffizienz, die die gemeinsame Endstrecke einer Vielzahl von unterschiedlichen kardialen Erkrankungen bildet. Auch die Gentherapie hat in der Kardiologie, anders als in anderen Bereichen, noch keinen großen Fortschritt erzielen können. Das Kalziumsensorprotein S100A1 stellt aber einen vielversprechenden Kandidaten für die kardiale Gentherapie dar, da es als zentraler Regulator der Herzfunktion und des Kalziumsignalwegs innerhalb der Kardiomyozyten identifiziert werden konnte. Ziele der Untersuchungen: Diese translationale Studie sollte dazu beitragen, dem Ziel einer kardialen Gentherapie der kardialen Dysfunktion einen Schritt näher zu kommen. Zum einen sollte hierzu ein auf adeno-assoziierten Viren (AAVs) basierender Vektor (rAAV) des Serotyps 5 in Verbindung mit einem kardiospezifischen Promotor (CMVenh/0,26 kb-MLC) auf seine Anwendbarkeit und Sicherheit für die kardiale Gentherapie untersucht werden. Durch eine umfangreiche Testung auf präexistierende neutralisierende Serumfaktoren (NSF) sollte zudem untersucht werden, ob das Schwein generell ein geeignetes Modelltier für AAV5-basierte präklinische Studien darstellt. Zum anderen sollte in einem endpunktbasierten Studiendesign der Effekt der hS100A1-Gentherapie nach Myokardinfarkt (MI) im humanrelevanten Großtiermodell weiter charakterisiert werden. Tiere, Material und Methoden: Insgesamt wurden 83 juvenile Schweine aus einem kommerziellen Herkunftsbetrieb verwendet. Vor Versuchsbeginn wurde das Serum von 40 Tieren mittels eines auf Durchflusszytometrie basierenden Zellreporter-Assays auf präexistierende NSF gegen AAV5 untersucht. Für die Hauptstudie wurde bei 8 Tieren eine 2 stündige perkutane Okklusion des Ramus circumflexus der linken Koronararterie (LCX) durchgeführt und so ein ischämischer Myokardinfarkt mit anschließender Reperfusion und resultierender kardialer Dysfunktion induziert. Nach 2 Wochen wurden Infarktgröße und Herzfunktion mittels Kardio-Magnetresonanztomographie (MRT) evaluiert. Die Tiere wurden in die Therapiegruppe (AAV5-hS100A1, 5 Tiere) oder Kontrollgruppe (AAV5-hRluc, 3 Tiere) aufgeteilt. Der Gentransfer (1x1013 virale Genomkopien (vgc)/Tier)) erfolgte per retrograder koronarvenöser Infusion. 12 Wochen nach Gentransfer wurde eine erneute Kardio-MRT Untersuchung durchgeführt. Zur Überprüfung der pharmakologischen Sicherheit wurden während des Versuchs serielle Blut und Elektrokardiogramm (EKG) Untersuchungen durchgeführt. Am Versuchsende wurden die Tiere schmerzfrei getötet und ihre Organe für weitere molekularbiologische Untersuchungen entnommen. Zur Untersuchung der Verteilung und Transkriptionseffizienz der vgc wurde aus den Gewebeproben DNA und RNA isoliert und anschließend eine quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) durchgeführt. Zusätzlich erfolgte eine Next-Generation Sequenzierung der myokardialen RNA, die mit einer gewichteten Gen Co-Expressionsanalyse (WGCNA) und anschließender Anreicherungsanalyse untersucht wurde. Zur Reduktion der Tierzahl wurde die Studie Endpunkt orientiert durchgeführt: sobald die beiden Gruppen signifikant unterschiedliche Ergebnisse in den Endpunkten (EF und Infarktausweitung) erzielten, wurde die Studie beendet. Ergebnisse: Die Ergebnisse zeigen eine niedrige anti-AAV5-Seroprävalenz in der Hausschweinpopulation. Die AAV5-hS100A1-Gentherapie führte nach 12 Wochen zu einer signifikanten Verringerung der Infarktausweitung und zu einer signifikant höheren EF im Vergleich zur Kontrollgruppe (ungepaarter zweiseitiger Student t-Test, p < 0,05). Die EKG- und Blutuntersuchungen ergaben keine Hinweise auf Toxizität. Die Transkriptomanalyse der Myokardproben lieferte mit der EF und Infarktausweitung signifikant und stark negativ korrelierende pathophysiologisch relevante Signalwege. Dabei scheint u.a. eine antiinflammatorische Wirkung von AAV5-hS100A1 von großer Bedeutung zu sein. Erstmals konnte auch eine Interaktion zwischen S100A1 und der kardioprotektiven Retinsäure gezeigt werden. In einer aufgrund der hohen Mortalität während der MI-Induktion eingeschobene Versuchsreihe mit 72 Tieren konnte durch den Wechsel des Narkosegases von Isofluran auf Sevofluran die Mortalität signifikant gesenkt werden (einseitiger Fisher’s exact test, p < 0,05). Schlussfolgerungen: Das Schwein stellt ein geeignetes Modelltier für AAV5-basierte Versuchsvorhaben dar. Das zu testende Konstrukt AAV5-hS100A1 mit CMVenh/0,26 kb-MLC Promotor zeigte bei einer hohen pharmakologischen Sicherheit eine robuste und weitestgehend kardiospezifische Expression des Transgens 12 Wochen nach Gentransfer. Es verfügt somit über ein großes therapeutisches Potenzial. Die Studie konnte dazu beigetragen, neue Signalwege zu identifizieren, die für den Wirkmechanismus von S100A1 relevant sein könnten. Durch die Änderung des Narkosegases konnte die Mortalität bei der MI-Induktion gesenkt werden. In zukünftigen MI-Studien sollte daher die Aufrechterhaltung der Inhalationsanästhesie bevorzugt mittels Sevofluran erfolgen.:Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Koronare Herzkrankheit, Myokardinfarkt und Herzinsuffizienz 2.1.1 Definition und Epidemiologie 2.1.2 Infarktheilung 2.1.3 Therapiemöglichkeiten 2.2 (Kardiale) Gentherapie 2.2.1 Vektoren 2.2.1.1 AAV5 2.2.2 Promotoren 2.2.3 Applikationsmethoden 2.3 S100A1 als therapeutisches Protein in der kardialen Gentherapie 2.3.1 Die Struktur von S100A1 2.3.2 Die Funktion von S100A1 2.3.3 Die kardiale S100A1-Gentherapie 2.4 Das Schwein in der translationalen Forschung 3 Material und Methoden 3.1 Material für die Aufarbeitung der Proben im Labor 3.1.1 Geräte und Verbrauchsmaterialien 3.1.2 Reagenzien und Chemikalien 3.1.3 Kits 3.1.4 Medien und Puffer 3.2 Material für den Großtier-OP und das Kardio-MRT 3.2.1 Geräte 3.2.2 Katheter und Schleusen 3.2.3 Medikamente und Medizinprodukte 3.3 Allgemeiner Versuchsaufbau 3.3.1 Versuchstiere 3.3.2 Versuchsaufbau 3.3.3 Vorbereitung, Narkose, perioperative Überwachung und Versorgung 3.3.4 Blutentnahme 3.3.5 Gefäßzugänge 3.3.6 Induktion des Myokardinfarkts 3.3.6.1 Änderung der Narkoseaufrechterhaltung während der MI-Induktion 3.3.7 Kardio-MRT – Durchführung 3.3.8 Gentransfer 3.3.9 Virale Vektoren 3.3.10 Organentnahme 3.4 Untersuchung auf neutralisierende Antikörper und Serumfaktoren 3.5 Bestimmung der Genexpression mittels qPCR 3.5.1 Homogenisierung und RNA-/DNA-Isolierung 3.5.2 cDNA-Synthese 3.5.3 Primer und Probes 3.5.4 qPCR im multiplex-Ansatz 3.5.5 Quantifizierung der Vektorgenomkopien mittels SYBR-qPCR 3.6 Kardio-MRT – Auswertung 3.7 Transkriptomanalyse 3.7.1 Next-Generation RNA-Sequenzierung – Durchführung 3.7.2 NGS – Auswertung 3.7.3 Hauptkomponentenanalyse 3.7.4 Gewichtete Gen Korrelation Netzwerk Analyse 3.7.5 Anreicherungsanalyse 3.8 Blutanalyse 3.9 Elektrokardiogramm – Auswertung 3.10 Statistische Auswertung 4 Ergebnisse 4.1 Erfüllung der Einschlusskriterien zur Aufnahme in die Studie 4.1.1 Seroprävalenz von neutralisierenden Antikörpern und Serumfaktoren gegen AAV5 4.1.2 Infarktgröße vor Gentherapie 4.2 Mortalität beim perkutanen LCX-Ischämie-/Reperfusionsmodell 4.3 Gentransfer 4.3.1 Überprüfung der Spezifität der Primer und Probes 4.3.2 Distribution der viralen Vektoren im linken Ventrikel 4.3.3 Transgenexpression im linken Ventrikel 4.3.4 Trankriptionseffizienz im linken Ventrikel 4.3.5 Systemische Verteilung 4.4 Einfluss der hS100A1-Gentherapie auf die kontraktile Funktion und Infarktgrößenentwicklung nach Myokardinfarkt 4.4.1 Effekte auf die Ejektionsfraktion 4.4.2 Effekte auf die Infarktausweitung 4.4.3 Ergebnisse der Transkriptomanalyse 4.5 Einfluss der hS100A1-Gentherapie auf die pharmakologische Sicherheit 4.5.1 Blutanalyse 4.5.2 Elektrokardiogramm 5 Diskussion 5.1 Eignung des Tiermodells 5.1.1 Seroprävalenz von neutralisierenden Antikörpern und Serumfaktoren in der Versuchstierart Schwein 5.1.2 Das perkutane LCX-Ischämie-/Reperfusionsmodell als experimentelles Modell zur Untersuchung der Infarktausweitung 5.1.3 Einfluss des Narkosegases auf die Mortalitätsrate beim perkutanen LCX-Ischämie-/ Reperfusionsmodell 5.2 Eignung des Vektorkonstruktes für die kardiale Gentherapie 5.2.1 Kardiale und systemische Biodistribution, Expression und Transkriptionseffizienz 5.2.2 Pharmakologische Sicherheit der AAV5-hS100A1-Gentherapie 5.2.2.1 Blutanalyse 5.2.2.2 Elektrokardiogramm 5.3 Effekte der hS100A1-Gentherapie 5.3.1 Einfluss auf die Ejektionsfraktion 5.3.2 Einfluss auf die Infarktausweitung 5.4 Limitationen des Studiendesigns und des tierexperimentellen Modells 5.5 Fazit und Ausblick 6 Zusammenfassung 7 Summary 8 Literaturverzeichnis 9 Anhang 10 Danksagung / Introduction: Cardiovascular diseases are the prevailing cause of death worldwide. To date, there is no causal therapy for heart failure, which represents the common endpoint of a large number of different cardiac diseases. Even the promising gene therapy approach has not yet been able to achieve relevant progress in this field. Identified as a central regulator of cardiac activity and calcium signaling in cardiomyocytes, the calcium-sensor protein S100A1 represents a highly suitable candidate for cardiac gene therapy. Objective: The overall goal of this translational study is to advance the field of gene therapy for cardiac dysfunction. On the one hand, the on adeno-associated viruses (AAVs) based vector (rAAV) of serotype 5 was tested in combination with a cardiac-specific promotor (cmvenh/0,26 kb-mlc) for its applicability and safety for cardiac gene therapy. Beforehand, extensive testing for preexisting neutralizing serum factors (nsf) was performed to decipher whether the pig is a suitable model for AAV5-based preclinical studies. On the other hand, the effect of the hS100A1 gene therapy after myocardial infarction (MI) was further characterized in a clinically relevant large animal model with an endpoint-based study design. Animals, materials and methods: A total of 83 juvenile farm pigs were used. Before starting the experiment, we analyzed serum from 40 animals for preexisting nsf against AAV5 using a flow cytometry-based cell reporter assay. For the main study, we used 8 animals in which we induced an ischemic myocardial infarction with subsequent reperfusion by occluding percutaneously the ramus circumflexus of the left coronary artery (LCX) for 2 hours to generate cardiac dysfunction. After 2 weeks, we evaluated infarct size and cardiac function with cardiac magnetic resonance imaging (MRI). Animals were divided into the treatment group (AAV5-hS100A1, 5 animals) and the control group (AAV5-hRluc, 3 animals). We applied gene transfer (1x1013 viral genome copies (vgc)/animal) using retrograde coronary venous infusion. We repeated the cardiac MRI 12 weeks after gene transfer. Serial blood and electrocardiogram (ECG) tests were performed during the experiment to verify pharmacological safety. At the end of the study, the animals were euthanized and their organs were collected for further molecular analyses. To investigate the distribution and transcriptional efficiency of the vectors, we isolated DNA and RNA from the tissue samples and performed real-time quantitative polymerase chain reaction (qPCR). In addition, a next-generation sequencing of myocardial RNA was conducted and analyzed with weighted gene co-expression network analysis (WGCNA) and subsequent enrichment analysis. To reduce the number of animals, the study was end point oriented: When reaching significant differences in the primary end points (ejection fraction (EF) and infarct extension), the study was terminated. Results: The results demonstrate a low anti-AAV5 seroprevalence in the farm pig population. After 12 weeks, the AAV5-hS100A1 gene therapy resulted in a significant reduction of infarct extension and a significantly higher EF compared to the control group (unpaired two-sided Student t-Test, p < 0.05). ECG and blood tests did not show any indications of toxicity. The transcriptome analysis of the myocardial samples provided a significant negative correlation between relevant pathological signaling pathways and EF/infarct extension, thus giving clues to underlying mechanisms. Among these, an anti-inflammatory effect of AAV5-hS100A1 appears to be of major importance. For the first time, we could also demonstrate an interaction between S100A1 and the cardioprotective retinoic acid. Due to the high mortality during MI-induction, we incorporated a test series with 72 animals. By changing the anesthetic gas from isoflurane to sevoflurane, we could significantly reduce the mortality (one-sided Fisher's exact test, p < 0.05). Conclusions: The pig represents a suitable model for AAV5-based studies. 12 weeks after gene transfer, the construct AAV5-hS100A1 with cmvenh/0.26 kb-mlc promoter showed a robust and mostly cardiospecific expression of the transgene accompanied by high pharmacological safety. Thus, it provides great therapeutical potential. The study contributed to identify novel signaling pathways that may be relevant for S100A1’s therapeutic actions. By changing the anesthetic gas, we could reduce the mortality during infarct induction. Therefore, in future MI studies, sevoflurane should be used preferably to maintain inhalation anesthesia.:Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Koronare Herzkrankheit, Myokardinfarkt und Herzinsuffizienz 2.1.1 Definition und Epidemiologie 2.1.2 Infarktheilung 2.1.3 Therapiemöglichkeiten 2.2 (Kardiale) Gentherapie 2.2.1 Vektoren 2.2.1.1 AAV5 2.2.2 Promotoren 2.2.3 Applikationsmethoden 2.3 S100A1 als therapeutisches Protein in der kardialen Gentherapie 2.3.1 Die Struktur von S100A1 2.3.2 Die Funktion von S100A1 2.3.3 Die kardiale S100A1-Gentherapie 2.4 Das Schwein in der translationalen Forschung 3 Material und Methoden 3.1 Material für die Aufarbeitung der Proben im Labor 3.1.1 Geräte und Verbrauchsmaterialien 3.1.2 Reagenzien und Chemikalien 3.1.3 Kits 3.1.4 Medien und Puffer 3.2 Material für den Großtier-OP und das Kardio-MRT 3.2.1 Geräte 3.2.2 Katheter und Schleusen 3.2.3 Medikamente und Medizinprodukte 3.3 Allgemeiner Versuchsaufbau 3.3.1 Versuchstiere 3.3.2 Versuchsaufbau 3.3.3 Vorbereitung, Narkose, perioperative Überwachung und Versorgung 3.3.4 Blutentnahme 3.3.5 Gefäßzugänge 3.3.6 Induktion des Myokardinfarkts 3.3.6.1 Änderung der Narkoseaufrechterhaltung während der MI-Induktion 3.3.7 Kardio-MRT – Durchführung 3.3.8 Gentransfer 3.3.9 Virale Vektoren 3.3.10 Organentnahme 3.4 Untersuchung auf neutralisierende Antikörper und Serumfaktoren 3.5 Bestimmung der Genexpression mittels qPCR 3.5.1 Homogenisierung und RNA-/DNA-Isolierung 3.5.2 cDNA-Synthese 3.5.3 Primer und Probes 3.5.4 qPCR im multiplex-Ansatz 3.5.5 Quantifizierung der Vektorgenomkopien mittels SYBR-qPCR 3.6 Kardio-MRT – Auswertung 3.7 Transkriptomanalyse 3.7.1 Next-Generation RNA-Sequenzierung – Durchführung 3.7.2 NGS – Auswertung 3.7.3 Hauptkomponentenanalyse 3.7.4 Gewichtete Gen Korrelation Netzwerk Analyse 3.7.5 Anreicherungsanalyse 3.8 Blutanalyse 3.9 Elektrokardiogramm – Auswertung 3.10 Statistische Auswertung 4 Ergebnisse 4.1 Erfüllung der Einschlusskriterien zur Aufnahme in die Studie 4.1.1 Seroprävalenz von neutralisierenden Antikörpern und Serumfaktoren gegen AAV5 4.1.2 Infarktgröße vor Gentherapie 4.2 Mortalität beim perkutanen LCX-Ischämie-/Reperfusionsmodell 4.3 Gentransfer 4.3.1 Überprüfung der Spezifität der Primer und Probes 4.3.2 Distribution der viralen Vektoren im linken Ventrikel 4.3.3 Transgenexpression im linken Ventrikel 4.3.4 Trankriptionseffizienz im linken Ventrikel 4.3.5 Systemische Verteilung 4.4 Einfluss der hS100A1-Gentherapie auf die kontraktile Funktion und Infarktgrößenentwicklung nach Myokardinfarkt 4.4.1 Effekte auf die Ejektionsfraktion 4.4.2 Effekte auf die Infarktausweitung 4.4.3 Ergebnisse der Transkriptomanalyse 4.5 Einfluss der hS100A1-Gentherapie auf die pharmakologische Sicherheit 4.5.1 Blutanalyse 4.5.2 Elektrokardiogramm 5 Diskussion 5.1 Eignung des Tiermodells 5.1.1 Seroprävalenz von neutralisierenden Antikörpern und Serumfaktoren in der Versuchstierart Schwein 5.1.2 Das perkutane LCX-Ischämie-/Reperfusionsmodell als experimentelles Modell zur Untersuchung der Infarktausweitung 5.1.3 Einfluss des Narkosegases auf die Mortalitätsrate beim perkutanen LCX-Ischämie-/ Reperfusionsmodell 5.2 Eignung des Vektorkonstruktes für die kardiale Gentherapie 5.2.1 Kardiale und systemische Biodistribution, Expression und Transkriptionseffizienz 5.2.2 Pharmakologische Sicherheit der AAV5-hS100A1-Gentherapie 5.2.2.1 Blutanalyse 5.2.2.2 Elektrokardiogramm 5.3 Effekte der hS100A1-Gentherapie 5.3.1 Einfluss auf die Ejektionsfraktion 5.3.2 Einfluss auf die Infarktausweitung 5.4 Limitationen des Studiendesigns und des tierexperimentellen Modells 5.5 Fazit und Ausblick 6 Zusammenfassung 7 Summary 8 Literaturverzeichnis 9 Anhang 10 Danksagung

Einleitung: Das West-Nil-Virus (WNV) ist ein Arbovirus (engl.: arthropod-borne virus) aus der Familie der Flaviviridae. Vorrangig wird das WNV in einem Vogel-Stechmücken-Vogel-Zyklus übertragen, allerdings können auch Pferde und Menschen als Fehlwirte infiziert werden (CHANCEY et al. 2015). Bei etwa 8–10 % der infizierten Equiden kommt es zum Auftreten neurologischer Symptome mit teils schweren und fatalen Krankheitsverläufen (BUNNING et al. 2004). Im Jahr 2018 wurden die ersten zwei equinen WNV-Infektionen in Deutschland nachgewiesen (ZIEGLER et al. 2019). Alle seither gemeldeten equinen WNV-Infektionen konzentrieren sich auf den mitteldeutschen Raum (TSIS 2022). Informationen zur Seroprävalenz der WNV-Infektionen in der hiesigen Pferdepopulation existieren jedoch nicht. Ziele der Untersuchung: Anhand einer Querschnittsstudie sollte die Seroprävalenz equiner WNV-Infektionen in einem Gebiet mit erwarteter Viruszirkulation bestimmt werden. Darüber hinaus sollte die Seroprävalenz in Landkreisen mit gemeldeten equinen Infektionen (Fall-Landkreisen, LK) und solchen ohne bisher registrierte equine WNV-Infektionen (Kontroll-LK) verglichen werden. In einem zweiten Studienteil sollten anhand der Erhebung pferde- und betriebsspezifischer Daten sowie Informationen zum individuellen und betrieblichen Mückenmanagement Risikofaktoren für eine WNV-Infektion von Pferden in Mitteldeutschland ermittelt werden. Tiere, Material und Methoden: Im Jahr 2020 wurde ein Studiengebiet mit neun Landkreisen (LK) aus drei Bundesländern definiert. In sechs Fall-LK wurden in den Jahren 2018/2019 equine WNV-Infektionen registriert, während in drei Kontroll-LK keine registrierten Fälle vorlagen. Pferdehalter mit fünf und mehr gemeldeten Equiden wurden zur freiwilligen Teilnahme an der Studie eingeladen. Eingeschlossen wurden klinisch gesunde Pferde, die mindestens 12 Monate alt, nicht gegen das WNV geimpft und dauerhaft in der Region gehalten wurden. Alle Seren wurden in einem kompetitiven ELISA (cELISA) auf flavivirenspezifische Antikörper untersucht. Um akute Infektionen zu detektieren, wurden alle reaktiven Seren (positiv und fraglich) weiterhin auf das Vorliegen von IgM-Antikörper untersucht. Verifiziert wurden die cELISA-reaktiven Seren im Neutralisationstest (VNT). Analysiert wurde neben WNV auch das mit ihm serologisch eng verwandte Usutu-Virus (USUV) und das Frühsommer-Meningoenzephalitis-Virus (FSMEV). Für die Risikofaktorenanalyse wurden epidemiologische Daten in Form eines Fragebogens für alle teilnehmenden Pferde erhoben und statistisch mittels Logistischer Regression ausgewertet. Ergebnisse: Zwischen September und November 2020 wurden 940 Pferde aus 127 Betrieben beprobt. Insgesamt 106 Seren waren im cELISA reaktiv; hiervon wurden bei sechs Pferden IgM-Antikörper festgestellt. Im VNT zeigten 54/106 Pferden neutralisierende Antikörper gegen das WNV, 35/106 Pferden Antikörper gegen das FSMEV und 8/106 Seren neutralisierten das USUV. Die WNV-Seroprävalenz lag auf Pferde-Ebene bei 5,8 % und auf Betriebsebene bei 21,3 %, In den Fall-LK war die Seroprävalenz mit 7,2 % signifikant höher als in den Kontroll-LK mit 2,7 %. Seropositive Pferde konnten in allen sechs Fall-LK, und in zwei der drei Kontroll-LK ermittelt werden. Das Regressionsmodell zeigte einen signifikanten Einfluss auf die Seropositivität für sechs Variablen. Der Typus Pony und eine zunehmende WNV-Impfdichte im Betrieb verringerten die Wahrscheinlichkeit der Seropositivität, während die Haltung in einem Fall-LK, 24h Zugang zum Auslauf, die Existenz eines Unterstandes im Auslauf und die Verwendung einer Fliegendecke die Wahrscheinlichkeit der Seropositivität erhöhten. Schlussfolgerungen: Die Ergebnisse bestätigen eine WNV-Zirkulation in Mitteldeutschland mit einer Seroprävalenz von 5,8 % in der lokalen Pferdepopulation. Neben dem WNV zirkulieren mit FSMEV und USUV mindestens zwei weitere eng verwandte Flaviviren in der Region, wovon die durch das FMEV ausgelöste FSME als Differentialdiagnose für Erkrankungen mit neurologischen Erscheinungsformen in Betracht gezogen werden sollte. In Bezug auf die Risikofaktoren bleibt fraglich, ob Ponys einem reduzierten Risiko der Infektion unterliegen. Die Haltung in Landkreisen mit bereits registrierten equinen WNV-Infektionen sowie ein permanenter Zugang zum Auslauf in der insektenreichen Zeit von April bis November steigert das Risiko einer WNV-Infektion für Pferde.:1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Das West-Nil-Virus 2.1.1 Virusstruktur und Taxonomie 2.1.2 Übertragung 2.1.3 Epidemiologie 2.1.4 Pathogenese und Pathologie 2.1.5 Immunologie 2.1.6 Diagnostik 2.1.7 Klinische Symptomatik 2.1.8 Therapie und Prophylaxe 2.1.9 Tierseuchenrechtliche Regelung equiner WNV-Infektionen 2.2 Das Frühsommer-Meningoenzephalitis-Virus 2.2.1 Virusstruktur und Taxonomie 2.2.2 Übertragung 2.2.3 Epidemiologie 2.2.4 Pathogenese und Immunologie 2.2.5 Diagnostik 2.2.6 Klinische Symptomatik 2.3 Das Usutu-Virus 2.3.1 Virusstruktur und Taxonomie 2.3.2 Übertragung 2.3.3 Epidemiologie 2.3.4 Pathogenese und Immunologie 2.3.5 Diagnostik 2.3.6 Klinische Symptomatik 3 Ziele der Studie 4 Publikation 4.1 Stellungnahme zum Eigenanteil 4.2 Ergänzende Daten der Publikation 4.2.1 Tabelle 1: Beschreibung teilnehmender Betriebe 4.2.2 Tabelle 2: Deskriptive Statistik auf Pferde-Ebene 4.2.3 Tabelle 3: Laborergebnisse Serologie 4.2.4 Tabelle 4: Univariate Analyse 4.2.6 Tabelle 5: Logistische Regression 5 Diskussion 5.1 WNV-Seroprävalenz 5.1.1 Vergleich innerhalb Europas 5.1.2 Vergleich zwischen Fall- und Kontroll-Landkreisen 5.2 Verbreitung FSMEV 5.3 Verbreitung USUV 5.4 Risikofaktoren für WNV-Seropositivität 5.4.1 Typus 5.4.2 Landkreise 5.4.3 Haltungsform und die Existenz eines Unterstandes 5.4.4 WNV Impfdichte im Betrieb 5.4.5 Nutzung einer Fliegendecke 6 Zusammenfassung 7 Summary 8 Literaturverzeichnis 9 Danksagung

Die Toxoplasmose, nach ihrem Verursacher, dem Parasiten Toxoplasma gondii (T. gondii) benannt, ist eine weltweit häufig auftretende Zoonose. Einen wichtigen Infektionsweg stellt der Verzehr von nicht ausreichend erhitztem oder rohem Fleisch, welches Gewebezysten enthält, dar. In Deutschland hat der Konsum von Wildbret in den letzten 10 Jahren zugenommen. Schwarzwild (Sus scrofa), Rehwild (Capreolus capreolus), Damwild (Dama dama) und Rotwild (Cervus elaphus) sind das am häufigsten gejagte Schalenwild in Deutschland. Dennoch gibt es nur wenige Informationen über das Vorkommen von T. gondii in Wildtieren in Deutschland, so dass die Bedeutung von Wild als Quelle für eine Infektion des Menschen mit T. gondii weitgehend unbekannt ist. Ziel dieser Studie war es, die Datenlage zum Vorkommen von T. gondii in Schwarzwild, Rehwild, Damwild und Rotwild in Deutschland zu verbessern und eine fundierte Bewertung des von dem Verzehr von Wildtieren ausgehenden potenziellen Risikos zu ermöglichen. Neben dem indirekten serologischen Nachweis soll der Nachweis mittels direkter Nachweisverfahren einen Einblick in die tatsächliche Anwesenheit von T. gondii im Muskelgewebe und einen potenziellen Zusammenhang von Seropositivität und der Anwesenheit von T. gondii im Gewebe geben. In den Jahren 2017-2020 wurden in Brandenburg 306 Stück Schwarzwild, 184 Stück Rehwild, 80 Stück Damwild und 65 Stück Rotwild beprobt. Den 635 Wildtieren wurden Blutproben und Proben von Herz- und Vorderlaufmuskulatur entnommen. Das aus den Blutproben gewonnene Serum wurde mittels eines kommerziell erhältlichen ELISA untersucht. Zum direkten Nachweis von T. gondii wurde zur Analyse der aus den Muskelproben gewonnenen DNA eine real-time PCR (qPCR) eingesetzt, die auf das 529-bp-repetitive Element abzielt. Die DNA wurde auf drei unterschiedliche Arten gewonnen: direkt aus 5 g Muskelgewebe extrahiert, aus einem Pellet nach saurem Pepsinverdau von 50 g Muskelgewebe extrahiert, und die Ziel-DNA durch Magnetic Capture aus weiteren 50 g Muskelgewebe angereichert. Die Übereinstimmung der Ergebnisse des molekularen Nachweises und ihre Übereinstimmung mit den ELISA-Ergebnissen wurde ermittelt. Der molekulare Nachweis wurde bei 23 Proben von einem Maus-Bioassay begleitet. Zusätzlich wurde eine PCR-RFLP zur Genotypisierung bei qPCR-positiven Proben durchgeführt. Fisher’s exact Test, Cohen’s kappa (κ) und Odds Ratio wurden für die statistische Analyse genutzt. T. gondii-spezifische Antikörper wurden in 20,3 % der Schwarzwildproben, 10,9 % der Rehwildproben und 6,2 % der Rotwildproben nachgewiesen. Bei allen untersuchten Wildarten wurde ein Anstieg der Seroprävalenz mit zunehmendem Alter festgestellt, welcher bei Schwarzwild und Rehwild statistisch signifikant war (p = 0,004 und < 0,001). Bei der Untersuchung von Herzmuskulatur wurde T. gondii-DNA mit mindestens einer direkten Nachweismethode in 11,8 % der Schwarzwildproben, 5,5 % der Rehwildproben, 2 % der Damwildproben und 1,9 % der Rotwildproben nachgewiesen. Der höchste Anteil an Tieren, die positiv auf T. gondii-DNA getestet wurden, wurde durch die qPCR-Analyse von DNA aus 50 g Herzmuskulatur nach Magnetic Capture nachgewiesen (10 %). Die Ergebnisse der Methoden zeigten insgesamt eine mäßige Übereinstimmung (κ = 0,47-0,59). Die höchste Übereinstimmung zeigten die Ergebnisse von DNA aus 50 g Herzmuskulatur nach Pepsin-Verdau und DNA aus 50 g Herzmuskulatur nach Magnetic Capture (κ = 0,59). Insgesamt ergab die Untersuchung von 50 g Herzmuskulatur einen signifikant höheren Anteil an positiven qPCR-Ergebnissen als die Analyse von 5 g Herzmuskulatur (p = 0,048). Die qPCR-Ergebnisse von Herz- und Vorderlaufmuskelgewebe zeigten beim Schwarzwild eine beachtliche und bei der gemeinsamen Betrachtung aller untersuchten Wildarten eine mäßige Übereinstimmung (κ = 0,62 bzw. 0,46). Ein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen Seropositivität und direktem Nachweis war bei Schwarzwild und Rehwild erkennbar (p < 0,001). In allen T. gondii-DNA-positiven Proben, bei denen zusätzlich ein Bioassay durchgeführt wurde, konnte Infektiosität bestätigt werden (4/4). Sowohl in den T. gondii-DNA-positiven Schwarzwildproben als auch in den positiven Rehwildproben waren die spezifischen Allele von T. gondii-Typ II am weitesten verbreitet. Die durch diese Arbeit generierten Daten zeigen, dass T. gondii in Schwarzwild, Rehwild, Damwild und Rotwild in Brandenburg vorkommt und Wild eine relevante Quelle für T. gondii-Infektionen beim Menschen darstellen könnte.

Ziel dieser Studie ist die Bestimmung der Serum-sRAGE-Kon- zentrationen bei Hunden mit Chronische Enteropathie (CIE) und deren Zusammenhang mit histologischen sowie klinisch- pathologischen Befunden. Ein weiteres Ziel der Studie ist der quantitative Vergleich der Expression von Transmembran (full-length)-RAGE entlang des Gastrointestinaltrakts bei Hunden mit CIE sowie die Untersuchung auf deren Zusammenhang mit Serum-sRAGE-Konzentrationen sowie klinischen, klinisch-pathologischen und histologischen Befunden. Die Ergebnisse deuten auf eine Dysregulation der RAGE/sRAGE-Achse bei der CIE des Hundes und legen nahe, dass die RAGE-Signalwege eine Rolle bei der Patho- genese dieser Erkrankung spielen.:Introduction. Review of Literature Functional Anatomy and Physiology of the Intestines. Anatomy of the Intestines. Gastrointestinal Physiology Small Intestinal Physiology. Large Intestinal Physiology. Gastrointestinal Neuronal and Endocrine System Gastrointestinal Immune System Innate Immunity and Acquired Immunity Intestinal Microbiome Enteropathies in Dogs.Definition Acute Enteropathy Chronic Enteropathies Food-Responsive Enteropathy (FRE) Antibiotic-Responsive Enteropathy (ARE) Steroid- or Immunosuppressant-responsive enteropathy (SRE/IRE) Non-Responsive Enteropathy (NRE) Protein-Losing Enteropathy (PLE) Diagnostic evaluation of dogs with suspected CIE Clinical and Clinicopathologic Approach Diagnostic Imaging of the Abdomen Laboratory Tests for Gastrointestinal Disease Serum cobalamin (vitamin B12 Serum folic acid (vitamin B9) Serum C-reactive protein (CRP) Fecal calprotectin and S100A12 Protein Fecal alpha1-proteinase inhibitor (α1PI) Gastrointestinal Histopathology attern Recognition Receptors Receptor for Advanced Glycation End Products Aims and Hypotheses Own Publications Association between serum soluble receptor for advanced glycation end-products (RAGE) deficiency and severity of clinicopathologic evidence of canine chronic in- flammatory enterophy Dysregulation of gastrointestinal RAGE (receptor for advanced glycation end products) expression in dogs with chronic inflammatory enteropathy Discussion Objective of the Study Discussion of the results Limitations of the Study Conclusions Summary Zusammenfassung References Acknowledgments