Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-01-19T17:40:54Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 954292 bytes, checksum: 4c469f118ecec64e0bf397931c09c1cc (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-19T17:40:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 954292 bytes, checksum: 4c469f118ecec64e0bf397931c09c1cc (MD5) Previous issue date: 2016-07-22 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Em vias de defesa envolvidas na interação planta/patógeno e planta/ambiente, a modulação da transcrição é etapa fundamental na ativação de respostas intracelulares. Esses mecanismos são regulados principalmente pelos fatores de transcrição (FT), que entre os mais estudados em plantas estão a família basic leucine zipper motif (bZIP). Interações dos bZIP com outras proteínas modulam a atividade destes transfatores por diversos mecanismos, e essa modulação afeta vias de transdução de sinais nas plantas. O GmbZIPE2 (Glyma05g168100.1) de soja tem sua expressão alterada em resposta à infecção por patógenos e ao tratamento com fitormônios de defesa, sugerindo que esse transfator possa estar envolvido em vias de sinalização de interação planta-patógeno. O objetivo deste trabalho foi identificar interações proteicas do GmbZIPE2 utilizando o ensaio de duplo-híbrido de leveduras. Identificamos que a proteína GmbZIPE2 foi capaz de interagir com G. max uncharacterized LOC100786585 (RbcX), identificada no Phytozome como Chaperonin-like Rbcx Protein, que atua como chaperona no dobramento da Rubisco, e a proteína G. max uncharacterized LOC100777895, cuja função biológica descrita no Uniprot é relacionada à montagem do fotossistema II (PSII). Uma vez que interage com proteínas envolvidas com a fotossíntese e que podem atuar como moléculas sinalizadoras do estado fotossintético da célula, o GmbZIPE2 pode estar relacionado à transmissão de sinais do cloroplasto para o núcleo, atuando na via de sinalização retrógada. / In defence pathways triggered after the plant /pathogen interaction and upon environment stress, the transcriptional modulation is a critical step for the activation of intracellular responses. This modulation is mainly regulated by transcriptional factors (TF). The basic leucine zipper family (bZIP) is the most studied TF in plants. The interaction between bZIP and other proteins modulates the activity of these transcriptional factors by several mechanisms, and that modulation affects the signal transduction pathways. The GmbZIPE2 (Glyma05g168100.1) is responsive to pathogen infection and treatment with phytohormones related to defense, suggesting that GmbZIPE2 is part of pathogen response signaling pathways in soybean. The aim of this study was to identify protein that can interact with GmbZIPE2 using yeast two-hybrid. We found that the GmbZIPE2 was able to interact with G. max uncharacterized LOC100786585 (RbcX), identified in Phytozome as Chaperonin-like Rbcx Protein, that acts as chaperone in folding of Rubisco, and the G. protein max uncharacterized LOC100777895, that was described to the assembly of photosystem II (PSII). These interactions suggest that GmbZIPE2 can be related to signal transmission from chloroplast to the nucleus.

A existência de aminoácidos co-traducionalmente codificados pelo código genético tem estimulado estudos sobre os mecanismos de síntese, reconhecimento e incorporação nas cadeias polipeptídicas nascentes. Como exemplo, pode-se destacar a via específica de biossíntese do aminoácido selenocisteína, presente em eucariotos e procariotos, cuja incorporação ocorre juntamente ao códon de parada UGA. Em bactérias, a via de biossíntese de Sec é composta pelas proteínas Selenocisteína sintase (SelA), Fator de Elongação Específico (SelB), Selenofosfato sintetase (SelD), Seril-tRNA sintetase (SerRS) e Selenocisteína liase (CsdB). A via de síntese e incorporação de Sec depende também de dois RNAs; um tRNA específico (tRNASec) e uma sequência no mRNA (Sequência de Inserção de Selenocisteínas - SECIS), sinalizadora para correta incorporação de Sec junto ao códon UGA. Em eucariotos, essa via difere pela presença das proteínas O-fosfoseril-tRNASec Quinase (PSTK) e Selenocisteil-tRNASec sintase (SepSecS), em substituição a SelA, e pela presença de proteínas ligadoras ao elemento SECIS (SBP2). Pelo fato do selênio ter uma citotoxicidade elevada, é fundamental a compreensão do mecanismo catalítico e formação dos complexos da via na etapa de incorporação junto ao tRNASec. Em 2009, foi proposta a interação entre CsdB e SelD, porém não sendo demonstradaexperimentalmente até o momento. Dessa forma, esse estudo traz pela primeira vez, a caracterização biofísica e estrutural da interação macromolecular entre CsdB e SelD bacterianas, indicando uma elevada afinidade de interação entre elas sob diferentes condições experimentais. Estudos biofísicos mostraram que a interação aumenta a estabilidade térmica e os estudos estruturais resultaram em um modelo em baixa resolução do complexo, indicando uma assimetria para o complexo formado. Além disso, em 2013 nosso grupo anotou uma sequência putativa para uma SBP2 em N. gruberi, ameba não patogênica empregada como modelo para estudos de N. fowleri, conhecida a infectar humanos, resultando na patologia conhecida como Meningoencefalite Amebiana Primária. Deste modo, esse estudo também traz, pela primeira vez, a demonstração experimental da presença de uma SBP2 em N. gruberi Ademais, a interação desta proteína como o elemento SECIS também foi caracterizada através de diversos estudos biofísicos. Demonstrou-se que a NgSBP2 possui alto percentual de regiões de desordem e que ao interagir com o elemento SECIS apresenta enovelamento devido à interação. Dessa forma, este estudo trouxe um avanço no conhecimento das interações moleculares presentes na via de incorporação de selenocisteínas, sendo de grande relevância no entendimento dos determinantes moleculares de interação entre proteína-proteína e proteína-RNA. / The existence of co-translationally encoded amino acids by the genetic code has stimulated studies on the mechanisms of synthesis, recognition, and incorporation into new polypeptide chains. As an example, the selenocysteine (Sec) biosynthesis pathway, present in eukaryotes and prokaryotes, where the amino acid incorporation occurs at the canonical UGA stop-codon. In Bacteria, the Sec biosynthesis pathway is formed by Selenocysteine synthase (SelA), Specific Elongation Factor (SelB), Selenophosphate synthetase (SelD), Seryl-tRNA synthetase (SerRS) and Selenocysteine lyase (CsdB). The synthesis route also needs two RNAs; a specific tRNA (tRNASec) and a sequence in the mRNA (SelenoCysteine Insertion Sequence - SECIS) that encodes for the in-frame UGA Sec incorporation. In eukaryotes, the pathway is distinguished through the presence of O-phosphoseryl-tRNASec kinase (PSTK) and Selenocysteinyl-tRNASec synthase (SepSecS), replacing SelA, also the presence of SECIS binding proteins (SBP2). Once selenium presents high cell toxicity, it is crucial to fully understand the catalytic metabolism and complex formation for the tRNASec incorporation. In 2009, CsdB and SelD interaction was proposed, however, it has not been experimentally demonstrated until now. Thus, this project reports at the first time the biophysical and structural characterization of bacterial CsdB and SelD macromolecular interaction, indicating to a high-affinity interaction between these enzymes for the complex formation. Biophysical assays showed that the complex increased the thermal stability and structural studies showed a low-resolution model also indicating the macromolecule asymmetry. In addition, our research group reported in 2013 the putative SBP2 sequence in N. gruberi, the non-pathogenic amoeba used as a model for studies of N. fowleri, known as human infective, responsible for the pathology known as the Primary Amebic Meningoencephalitis. Moreover, this project also reports, at the first time, the experimental presence of N. gruberi SBP2. The SBP2.SECIS was also characterized by several biophysical methods. NgSBP2 has a high percentage of regions of disorder and access to each element SECIS presents due to interaction. Thus, this study was promoted in advance on the molecular interactions present in the incorporation of selenocysteines, being important for the understanding of the molecular determinants of the interaction between protein-protein and RNA-protein.

O estudo de processos de tradução do código genético em proteínas desperta o interesse pelo seu papel central no metabolismo celular, em particular, o estudo da via de síntese de novos aminoácidos, como a selenocisteína e a pirrolisina, que resultam na expansão do código genético dos 20 aminoácidos canônicos para um total de 22 aminoácidos. A selenocisteína (Sec, U) é um aminoácido que representa a principal forma biológica do elemento selênio e sua incorporação ocorre através de um processo cotraducional em selenoproteínas como resposta ao códon UGA em fase, usualmente interpretado como códon de parada. Essa incorporação requer uma complexa maquinaria molecular distinta entre os três domínios da vida em que as selenoproteínas estão presentes: Bactéria, Arquéia e Eucária. Em Escherichia coli, a via se inicia com a aminoacilação do tRNA específico para a incorporação de selenocisteínas (SelC, tRNASec) com um resíduo de L-serina pela seril-tRNA sintetase (SerRS) formando o tRNA carregado Ser-tRNA[Ser]Sec que é entregue ao complexo homodecamérico selenocisteína sintase (SelA) responsável pela conversão Ser-Sec utilizando a forma biológica de selênio entregue pela enzima selenofosfato sintetase (SelD). Uma vez carregado com L-selenocisteína, o Sec-tRNASec é então carreado pelo fator de elongação específico para selenocisteínas (SelB) para a sua incorporação na cadeia polipeptídica nascente na posição UGA adjunta ao elemento SECIS (SElenoCysteine Insertion Sequence), uma estrutura em grampo presente no RNA mensageiro que indica o códon de inserção de selenocisteínas. Uma vez que elementos contendo selênio são tóxicos para o ambiente celular, interações entre as enzimas da via se fazem necessárias, onde as enzimas participantes em procariotos são conhecidas e caracterizadas individualmente, no entanto, suas interações macromoleculares nas diferentes etapas ainda não foram caracterizadas. Este projeto visa à caracterização macromolecular e estrutural das interações entre as enzimas SelA e SelB com os RNAs participantes tRNASec e SECIS além do ribossomo de E. coli. Para isso, amostras de SelA, SelB, tRNASec, SECIS e ribossomo foram obtidas através de diferentes metodologias. Para SelA e tRNASec foram utilizados protocolos já estabelecidos enquanto que, para SelB, fez-se necessário a otimização do protocolo previamente publicado e, consequentemente, nova caracterização biofísica através de metodologias como dicroísmo dircular (CD) e fluorescência intrínseca (IFS). Para análise das interações, medidas de espectroscopia de anisotropia de fluorescência (FAS), ultracentrifugação analítica (AUC) e calorimetria de varredura diferencial (DSC) foram utilizadas para determinação dos parâmetros de interação dos diferentes complexos estudados. Somado a isso, experimentos de cinética GTPásica foram realizados na formação dos complexos e, além disso, foram gerados modelos estruturais utilizando diferentes metodologias como espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS) além de estudos por microscopia eletrônica de transmissão (TEM). Os estudos propostos irão auxiliar no entendimento do mecanismo de incorporação deste aminoácido em bactérias bem como nos demais domínios da vida além de elucidar o mecanismo sequencial de eventos, provendo conhecimento e desenvolvendo metodologias para sistemas complexos de interação proteína-proteína e proteína-RNA. / The study of genetic code processes in proteins is a central role in cell metabolism, in particular the study of the synthesis pathway of new amino acids, such as selenocysteine and pyrrolisine, which resulted in the expansion of the genetic code of the 20 canonical amino acids for 22 amino acids. Selenocysteine (Sec, U) is an amino acid that represents a major biological form of selenium element and its incorporation through a co-translational process in selenoproteins in response to the in-phase UGA-codon, usually interpreted as stop-codon. This incorporation requires a complex molecular machinery distinct between the three domains of life in which, as selenoprotein has present: Bacteria, Archaea and Eukaria. In Escherichia coli, an initiation pathway with an aminoacylation of the tRNA specific for the incorporation of selenocysteines (SelC, tRNASec) with an L-serine residue by seril-tRNA synthetase (SerRS) resulting in the charged tRNA Ser-tRNA[Ser] Sec that is delivered to the homodecameric complex selenocysteine synthase (SelA), responsible for Ser-Sec conversion using the biological form of selenium delivered by the enzyme selenophosphate synthetase (SelD). Once loaded with L-selenocysteine, Sec-tRNASec is then carried by the selenocysteine-specific elongation factor (SelB) for incorporation into the nascent polypeptide chain at the UGA position attached to the SECIS (SElenoCysteine Insertion Sequence) element, staple structure that indicates the insertion codon of selenocysteines. Since elements containing selenium are toxic to the cell, interactions between how pathway enzymes are made, where the enzymes participating in concepts are known and characterized individually, however, their macromolecular interactions in the different steps have not yet been characterized. This project aims at the macromolecular and structural characterization of the interactions between SelA and SelB enzymes with the RNAS tRNASec and SECIS participants in addition to the E. coli ribosome. For this, as samples of SelA, SelB, tRNASec, SECIS and ribosome were obtained through different methodologies. For SelA and tRNASec, protocols were used to determine parameters for SelB, it was necessary to optimize a previously published protocol and, consequently, a new biophysical characterization through methodologies such as circular dichroism (CD) and intrinsic fluorescence spectroscopy (IFS). To analyze the interactions, measurements of fluorescence anisotropy spectroscopy (FAS), analytical ultracentrifugation (AUC) and differential scanning calorimetry (DSC) were used to determine the interaction parameters of different complexes studied. In addition, GTPases activity experiments were carried out in the formation of the complexesand, in addition, we have generated models that characterize different methodologies such as small angles X-ray scattering (SAXS) and transmission electron microscopy (TEM). The proposed studies will aid in understanding the mechanism of incorporation of this amino acid into bacteria as well as the other domains of life besides elucidating the sequential mechanism of events, providing knowledge and development of methodologies for complex protein-protein and RNA-protein interaction systems.

O estudo de processos de tradução do código genético em proteínas desperta o interesse pelo seu papel central no metabolismo celular, em particular, o estudo da via de síntese de novos aminoácidos, como a selenocisteína e a pirrolisina, que resultam na expansão do código genético dos 20 aminoácidos canônicos para um total de 22 aminoácidos. A selenocisteína (Sec, U) é um aminoácido que representa a principal forma biológica do elemento selênio e sua incorporação ocorre através de um processo cotraducional em selenoproteínas como resposta ao códon UGA em fase, usualmente interpretado como códon de parada. Essa incorporação requer uma complexa maquinaria molecular distinta entre os três domínios da vida em que as selenoproteínas estão presentes: Bactéria, Arquéia e Eucária. Em Escherichia coli, a via se inicia com a aminoacilação do tRNA específico para a incorporação de selenocisteínas (SelC, tRNASec) com um resíduo de L-serina pela seril-tRNA sintetase (SerRS) formando o tRNA carregado Ser-tRNA[Ser]Sec que é entregue ao complexo homodecamérico selenocisteína sintase (SelA) responsável pela conversão Ser-Sec utilizando a forma biológica de selênio entregue pela enzima selenofosfato sintetase (SelD). Uma vez carregado com L-selenocisteína, o Sec-tRNASec é então carreado pelo fator de elongação específico para selenocisteínas (SelB) para a sua incorporação na cadeia polipeptídica nascente na posição UGA adjunta ao elemento SECIS (SElenoCysteine Insertion Sequence), uma estrutura em grampo presente no RNA mensageiro que indica o códon de inserção de selenocisteínas. Uma vez que elementos contendo selênio são tóxicos para o ambiente celular, interações entre as enzimas da via se fazem necessárias, onde as enzimas participantes em procariotos são conhecidas e caracterizadas individualmente, no entanto, suas interações macromoleculares nas diferentes etapas ainda não foram caracterizadas. Este projeto visa à caracterização macromolecular e estrutural das interações entre as enzimas SelA e SelB com os RNAs participantes tRNASec e SECIS além do ribossomo de E. coli. Para isso, amostras de SelA, SelB, tRNASec, SECIS e ribossomo foram obtidas através de diferentes metodologias. Para SelA e tRNASec foram utilizados protocolos já estabelecidos enquanto que, para SelB, fez-se necessário a otimização do protocolo previamente publicado e, consequentemente, nova caracterização biofísica através de metodologias como dicroísmo dircular (CD) e fluorescência intrínseca (IFS). Para análise das interações, medidas de espectroscopia de anisotropia de fluorescência (FAS), ultracentrifugação analítica (AUC) e calorimetria de varredura diferencial (DSC) foram utilizadas para determinação dos parâmetros de interação dos diferentes complexos estudados. Somado a isso, experimentos de cinética GTPásica foram realizados na formação dos complexos e, além disso, foram gerados modelos estruturais utilizando diferentes metodologias como espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS) além de estudos por microscopia eletrônica de transmissão (TEM). Os estudos propostos irão auxiliar no entendimento do mecanismo de incorporação deste aminoácido em bactérias bem como nos demais domínios da vida além de elucidar o mecanismo sequencial de eventos, provendo conhecimento e desenvolvendo metodologias para sistemas complexos de interação proteína-proteína e proteína-RNA. / The study of genetic code processes in proteins is a central role in cell metabolism, in particular the study of the synthesis pathway of new amino acids, such as selenocysteine and pyrrolisine, which resulted in the expansion of the genetic code of the 20 canonical amino acids for 22 amino acids. Selenocysteine (Sec, U) is an amino acid that represents a major biological form of selenium element and its incorporation through a co-translational process in selenoproteins in response to the in-phase UGA-codon, usually interpreted as stop-codon. This incorporation requires a complex molecular machinery distinct between the three domains of life in which, as selenoprotein has present: Bacteria, Archaea and Eukaria. In Escherichia coli, an initiation pathway with an aminoacylation of the tRNA specific for the incorporation of selenocysteines (SelC, tRNASec) with an L-serine residue by seril-tRNA synthetase (SerRS) resulting in the charged tRNA Ser-tRNA[Ser] Sec that is delivered to the homodecameric complex selenocysteine synthase (SelA), responsible for Ser-Sec conversion using the biological form of selenium delivered by the enzyme selenophosphate synthetase (SelD). Once loaded with L-selenocysteine, Sec-tRNASec is then carried by the selenocysteine-specific elongation factor (SelB) for incorporation into the nascent polypeptide chain at the UGA position attached to the SECIS (SElenoCysteine Insertion Sequence) element, staple structure that indicates the insertion codon of selenocysteines. Since elements containing selenium are toxic to the cell, interactions between how pathway enzymes are made, where the enzymes participating in concepts are known and characterized individually, however, their macromolecular interactions in the different steps have not yet been characterized. This project aims at the macromolecular and structural characterization of the interactions between SelA and SelB enzymes with the RNAS tRNASec and SECIS participants in addition to the E. coli ribosome. For this, as samples of SelA, SelB, tRNASec, SECIS and ribosome were obtained through different methodologies. For SelA and tRNASec, protocols were used to determine parameters for SelB, it was necessary to optimize a previously published protocol and, consequently, a new biophysical characterization through methodologies such as circular dichroism (CD) and intrinsic fluorescence spectroscopy (IFS). To analyze the interactions, measurements of fluorescence anisotropy spectroscopy (FAS), analytical ultracentrifugation (AUC) and differential scanning calorimetry (DSC) were used to determine the interaction parameters of different complexes studied. In addition, GTPases activity experiments were carried out in the formation of the complexesand, in addition, we have generated models that characterize different methodologies such as small angles X-ray scattering (SAXS) and transmission electron microscopy (TEM). The proposed studies will aid in understanding the mechanism of incorporation of this amino acid into bacteria as well as the other domains of life besides elucidating the sequential mechanism of events, providing knowledge and development of methodologies for complex protein-protein and RNA-protein interaction systems.

Proteínas FtsH são metaloproteases pertencentes à família AAA (ATPases Associadas a Diversas Atividades Celulares), e estão presentes em todos os reinos dos seres vivos. Estas proteases utilizam a energia liberada da hidrólise do ATP para desempenhar suas diversas atividades celulares. Em Escherichia coli, as proteases FtsH se organizam em um homohexamero na membrana plasmática, sendo que este complexo atua na degradação de proteínas mal dobradas. Em Arabidopsis, o hetero-complexo FtsH localizado na membrana dos tilacóides é formados por isômeros do tipo A (FtsH1/FtsH5) e do tipo B (FtsH2/FtsH8). Sua atividade proteolítica está relacionada ao controle de qualidade organelar, degradando proteínas mal dobradas e de vida curta. O complexo está envolvido também na degradação da proteína D1 do PSII, danificada por danos foto-oxidativo. Embora as FtsH cloroplastidiais sejam bem caracterizadas em termos genéticos e moleculares, o mecanismo de regulação do complexo ainda não foi esclarecido, o que torna interessante a busca por fatores proteicos adicionais. Em investigações anteriores nosso grupo de pesquisa encontrou um candidato potencial, denominado FIP (FtsH5 Interacting Protein), que pode modular a atividade ATPásica e/ou proteásica do complexo. Fip está presente na membrana dos tilacóides e mostrou interação com FtsH5 in vivo e in vitro. Neste trabalho foram realizados ensaios de duplo híbrido de leveduras, utilizando deleções da proteína FIP, bem como substituições de resíduos de cisteína por alanina. Os resultados revelaram que a interação entre FIP e FtsH5 é mantida somente quando duas regiões ricas em cisteína estão presentes na sequência de FIP. Essa região compreende 46 aminoácidos, com 4 resíduos de cisteína conservados, e ensaios com 7 diferentes substituições desses resíduos por alanina não mostraram interação com FtsH5, o que corrobora a hipótese de que os resíduos de cisteína são necessários para a interação. Experimentos de análise de expressão utilizando PCR em tempo real, sob condições de estresse salino e estresse a frio, revelaram que os genes que codificam FIP e FtsH5 têm sua expressão regulada de modo antagônico, o que sugere que FIP possa atuar como modulador negativo da atividade proteásica do complexo FtsH. / Metalloprotease FtsH proteins are members of the AAA family (ATPases Associated with Diverse Cellular Activities), and are present in all kingdoms of living organisms. These proteases use energy of ATP hydrolysis to perform its various cellular activities. In Escherichia coli, FtsH proteases are organized in a homo-hexamer in the cytoplasmic membrane, and this complex acts in the degradation of misfolded proteins. In Arabidopsis, the FtsH hetero-complex located in the thylakoid membrane is formed by type A (FtsH1/FtsH5) and type B (FtsH2/FtsH8) isomers. Its proteolytic activity is involved in organellar quality control by degrading misfolded and short-lived proteins. The complex is also involved in the degradation of the D1 protein of PSII, damaged by photo-oxidative damage. Although the chloroplast FtsH are well characterized genetically and molecularly, the regulatory mechanism of the complex remains unclear, which makes it interesting to search for additional protein factors. In earlier studies our research group has found a potential candidate called FIP (FtsH5 Interacting Protein), which can modulate the ATPase and/or protease activity of the complex. FIP is present in the membrane of the thylakoids and showed interaction with FtsH5 in vivo and in vitro. In this study yeast two-hybrid assays were performed using FIP protein deletions, and substitutions of cysteine to alanine residues. The results showed that the interaction between FIP and FtsH5 is maintained only when two cysteine rich regions are present in the sequence of FIP. This region contains 46 amino acids with four conserved cysteine residues and 7 different assays with alanine replacements of these residues showed no interaction with FtsH5, which corroborates the hypothesis that the cysteine residues are required for the interaction. Expression experiments analysis using realtime PCR, under conditions of salt stress and cold stress, revealed that the genes encoding FtsH5 and FIP have its expression regulated in an antagonistic way, suggesting that FIP can act as a negative modulator of the activity FtsH protease of the complex.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-09-02T18:25:03Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 898935 bytes, checksum: 76e4100a96f4410f999b0f8c2973b39e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-02T18:25:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 898935 bytes, checksum: 76e4100a96f4410f999b0f8c2973b39e (MD5) Previous issue date: 2015-03-06 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Os vírus que infectam plantas apresentam um genoma pequeno e codificam um número reduzido de proteínas. A limitação do número de proteínas virais é superada pela modulação da expressão de genes na célula hospedeira. O mapeamento das redes de interações entre fatores do patógeno e do hospedeiro tem fornecido respostas importantes para a compreensão dos processos que favorecem a infecção viral. O objetivo deste trabalho foi avaliar a contribuição de duas proteínas do tomateiro, a chaperona citosólica Hsp70 e sua co-chaperona DnaJ (classe 1) no estabelecimento da infecção pelo Pepper yellow mosaic virus (PepYMV). Essas duas proteínas foram identificadas com a expressão induzida em células infectadas pelo PepYMV. A sequencia codificadora da Hsp70 de tomateiro (SlHsp70) foi clonada e sequenciada. A análise in silico mostrou a presença de todos os domínios típicos de uma Hsp70. Alinhamento entre a sequencia da proteína SlHsp70, e as Hsps70 de Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana e Nicotiana tabacum mostrou uma alta conservação na sequência de aminoácidos das quatro proteínas alinhadas. A localização subcelular de SlHsp70 em células infectadas pelo PepYMV foi analisada por microscopia confocal. Células sadias e infectadas apresentaram uma localização nuclear e citoplasmática, entretanto em células infectadas foi possível observar a expressão da Hsp70 em estruturas ancoradas a membrana semelhantes a vesículas replicativas induzidas pela proteína viral 6K2. Para avaliar a ocorrência de interação entre SlHsp70 com proteínas virais, e SlDj1 com proteínas virais foi realizado um ensaio de duplo hibrido em leveduras. Não houve a detecção de nenhuma interação entre as proteínas do PepYMV e as proteínas SlHsp70 e SlDj1. Foi detectado a ocorrência de interação entre SlHsp70 e SlDj1. Com o objetivo de avaliar o efeito do silenciamento de SlDj1 na infecção viral, plantas de tomateiro foram transformadas com uma construção que induz o silenciamento de SlDj1 via Agrobacterium tumefaciens. As plantas transformadas silenciadas apresentaram um fenótipo de letalidade e esse fenômeno não permitiu a quantificação do acúmulo do PepYMV em tomateiros transformados. Os resultados deste trabalho sugerem que as proteínas SlHsp70 e SlDj1 favorecem a infecção viral de forma indireta, e que estudos mais detalhados irão formecer informações sobre o envolvimento dessas proteínas no processo de infecção pelo PepYMV. / Viruses are obligate intracellular parasites with a small genome and encode a limited number of proteins. Limitation in the number of viral proteins is overcome by modulating the expression of certain genes in the host cell. Mapping interaction networks between pathogen and host factors has provided important answers to the understanding of the processes that promote viral infection. This study objective is to evaluate the contribution of the tomato proteins chaperone Hsp70 and its co- chaperone DnaJ in infection process with Pepper yellow mosaic virus (PepYMV). These two proteins were investigated due to the modification of gene expression reports of transcripts in infected cells PepYMV. Initially the coding sequence corresponding to the tomato Hsp70 (SlHsp70) was analyzed in silico, the presence of all the domains of a typical Hsp70 was confirmed. Sequence alignment between the protein SlHsp70, and Hsps70 Arabidopsis thaliana, as well as Nicotiana benthamiana and Nicotiana tabacum revealed high conservation in the amino acid sequence alignment of the four proteins. The subcellular localization by confocal scanning microscopy was performed with SlHsp70 and demonstrated a common cytoplasmic and nuclear localization to healthy cells and cells infected by PepYMV. The infected cells showed similar expression of Hsp70 in membrane-anchored structures, similar to replicative vesicles induced by 6K2. Study of protein-protein interaction was performed by two-hybrid assay in yeasts. Due to SlHsp70 chaperone and co-chaperone SlDj1 act together, the interactions between the PepYMV proteins were tested with both the vegetable proteins. There was no detection of any interaction between PepYMV proteins and vegetable proteins, a single interaction was detected between SlHsp70 and SlDj1. Genetic transformation of tomato plants by Agrobacterium tumefaciens was carried out to induce silencing of the gene encoding the protein SlDj1. The silenced plants showed a lethality phenotype, and this phenomenon did not allow the quantification of the PepYMV accumulation in processed tomato. These results suggest that SlHsp70 and SlDj1 proteins promove the viral infection indirectly, and that investigations in the PepYMV replication process can reveal interesting facts about the involvement of these proteins in infection.

Submitted by Fernanda Rodrigues de Lima (fernanda.rlima@ufpe.br) on 2018-08-02T20:58:21Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Thaís Meira Menezes.pdf: 5590290 bytes, checksum: 6516515f3f28c707bbffd79ee5b3e400 (MD5) / Approved for entry into archive by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-08-07T19:25:58Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Thaís Meira Menezes.pdf: 5590290 bytes, checksum: 6516515f3f28c707bbffd79ee5b3e400 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-07T19:25:58Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Thaís Meira Menezes.pdf: 5590290 bytes, checksum: 6516515f3f28c707bbffd79ee5b3e400 (MD5) Previous issue date: 2017-03-15 / CNPq / Para o desenho de drogas com maior compatibilidade com o sítio de ligação é extremamente importante ter conhecimento do alvo molecular a que se destina o fármaco e da sua maneira de interação, ou seja, é preciso estudar a região onde será feita a conexão com o ligante e o mecanismo da reação. A ampla gama de aplicações para compostos orgânicos derivados de base de Schiff na industria química estende-se desde catalisadores, estabilizadores, intermediário de síntese e corantes. No contexto biológico, estes compostos tem sido empregado devido as suas atividade contra bacterias, fungos, virus, inflamação e neoplasias. Esta classe de moléculas apresentam relevante flexibilidade sintética e apresentam alta seletividade e sensibilidade em relação ao átomo de uma metaloenzima. Diante da relevância destes compostos no contexto biológico foram sintetizados e caracterizados nessa dissertação alguns derivados de base de Schiff. Visando estudar a biodisponibilidade do ponto de vista farmacocinético, estes compostos foram sujeitos a estudos de interação com a proteína BSA, através do mapeamento e monitoramento das mudanças das linhas de RMN frente a titulação com a proteína e os constantes de ligação Kd foram determinadas. Os compostos obtidos foram sujeito a estudos de interação teorico-experimental com a proteína tirosinase que esta envolvida com a mela-nogênese e um marcador neoplásico altamente relevante. A partir do estudo realizado, infere-se que os compostos devidamente sintetizados e caracterizados apresentaram moderada interação com a BSA, forte interação com íons cobre, indicando uma possível coordenação dos compostos com o metal, além da forte interação da NW-F e AMTAC 02 com a enzima tirosinase. Finalmente estudos de inibição de atividade enzimatica foram conduzidos com o composto acridínico AMTAC01 e os resultados mostraram que este composto inibe a proteína com valores de dose resposta IC50 de 8,8.10−8, mesma ordem de grandeza que o inibidor comercial ácido kójico, o que qualifica o composto AM-TAC01 como um potente inibidor da enzima tirosinase. / For the design of drugs with greater compatibility with the binding site, it is extremely important to the molecular target for which the drug is intended and its mode of interaction, that is, it is necessary to study the region where the connection with the ligand and the mechanism of the dog. The wide range of applications for organic compounds derived from Schiff base in the chemistry ranges from catalysts, stabilizers, synthesis intermediates and colorants. At the biological context, these compounds have been employed due to their activity against bacteria, fungi, viruses, inflammation and neoplasms. This class of molecules presents significant flexibility synthetic and have high selectivity and sensitivity to the atom of a metalloenzyme. In view of the relevance of these compounds in the biological context were synthesized and characterized in this dissertation some Schiff base derivatives. Aiming to study the bioavailability of the from a pharmacokinetic perspective, these compounds were subjected to interaction studies with the BSA protein, through the mapping and monitoring of the changes of the NMR lines against titration with the protein and the Kd binding constants were determined. The obtained compounds were subjected to studies of the theoretical-experimental in-teraction with the protein tyrosinase that is involved with the melanogenesis and a highly relevant neoplastic marker. Based on the study, it is inferred that The duly synthesized and characterized compounds presented moderate interaction with BSA, strong interaction with copper ions, indicating a possible coordination of the compounds with the As well as the strong interaction of NW-F and AMTAC 02 with the enzyme tyrosinase. Finally, studies of Inhibition of enzyme activity were conducted with the acridine compound AMTAC01 and the results showed that this compound inhibits the protein with IC 50 dose response values of 8.8.10-8, same order of magnitude as the kojic acid commercial inhibitor, which qualifies the compound AMTAC 01 as a potent inhibitor of the enzyme tyrosinase.

Proteínas FtsH são metaloproteases pertencentes à família AAA (ATPases Associadas a Diversas Atividades Celulares), e estão presentes em todos os reinos dos seres vivos. Estas proteases utilizam a energia liberada da hidrólise do ATP para desempenhar suas diversas atividades celulares. Em Escherichia coli, as proteases FtsH se organizam em um homohexamero na membrana plasmática, sendo que este complexo atua na degradação de proteínas mal dobradas. Em Arabidopsis, o hetero-complexo FtsH localizado na membrana dos tilacóides é formados por isômeros do tipo A (FtsH1/FtsH5) e do tipo B (FtsH2/FtsH8). Sua atividade proteolítica está relacionada ao controle de qualidade organelar, degradando proteínas mal dobradas e de vida curta. O complexo está envolvido também na degradação da proteína D1 do PSII, danificada por danos foto-oxidativo. Embora as FtsH cloroplastidiais sejam bem caracterizadas em termos genéticos e moleculares, o mecanismo de regulação do complexo ainda não foi esclarecido, o que torna interessante a busca por fatores proteicos adicionais. Em investigações anteriores nosso grupo de pesquisa encontrou um candidato potencial, denominado FIP (FtsH5 Interacting Protein), que pode modular a atividade ATPásica e/ou proteásica do complexo. Fip está presente na membrana dos tilacóides e mostrou interação com FtsH5 in vivo e in vitro. Neste trabalho foram realizados ensaios de duplo híbrido de leveduras, utilizando deleções da proteína FIP, bem como substituições de resíduos de cisteína por alanina. Os resultados revelaram que a interação entre FIP e FtsH5 é mantida somente quando duas regiões ricas em cisteína estão presentes na sequência de FIP. Essa região compreende 46 aminoácidos, com 4 resíduos de cisteína conservados, e ensaios com 7 diferentes substituições desses resíduos por alanina não mostraram interação com FtsH5, o que corrobora a hipótese de que os resíduos de cisteína são necessários para a interação. Experimentos de análise de expressão utilizando PCR em tempo real, sob condições de estresse salino e estresse a frio, revelaram que os genes que codificam FIP e FtsH5 têm sua expressão regulada de modo antagônico, o que sugere que FIP possa atuar como modulador negativo da atividade proteásica do complexo FtsH. / Metalloprotease FtsH proteins are members of the AAA family (ATPases Associated with Diverse Cellular Activities), and are present in all kingdoms of living organisms. These proteases use energy of ATP hydrolysis to perform its various cellular activities. In Escherichia coli, FtsH proteases are organized in a homo-hexamer in the cytoplasmic membrane, and this complex acts in the degradation of misfolded proteins. In Arabidopsis, the FtsH hetero-complex located in the thylakoid membrane is formed by type A (FtsH1/FtsH5) and type B (FtsH2/FtsH8) isomers. Its proteolytic activity is involved in organellar quality control by degrading misfolded and short-lived proteins. The complex is also involved in the degradation of the D1 protein of PSII, damaged by photo-oxidative damage. Although the chloroplast FtsH are well characterized genetically and molecularly, the regulatory mechanism of the complex remains unclear, which makes it interesting to search for additional protein factors. In earlier studies our research group has found a potential candidate called FIP (FtsH5 Interacting Protein), which can modulate the ATPase and/or protease activity of the complex. FIP is present in the membrane of the thylakoids and showed interaction with FtsH5 in vivo and in vitro. In this study yeast two-hybrid assays were performed using FIP protein deletions, and substitutions of cysteine to alanine residues. The results showed that the interaction between FIP and FtsH5 is maintained only when two cysteine rich regions are present in the sequence of FIP. This region contains 46 amino acids with four conserved cysteine residues and 7 different assays with alanine replacements of these residues showed no interaction with FtsH5, which corroborates the hypothesis that the cysteine residues are required for the interaction. Expression experiments analysis using realtime PCR, under conditions of salt stress and cold stress, revealed that the genes encoding FtsH5 and FIP have its expression regulated in an antagonistic way, suggesting that FIP can act as a negative modulator of the activity FtsH protease of the complex.

Em eucariotos, o processamento de pré-rRNA depende de vários fatores como endonucleases, exonucleases, RNA helicases, enzimas modificadoras de rRNA e componentes de snoRNPs. Com o objetivo de caracterizar novas proteínas envolvidas no processamento de pré-rRNA, foi identificada a proteína Nop53p interagindo com a proteína nucleolar Nop17p a partir de uma varredura da biblioteca de cDNAs de Saccharomyces cerevisiae. A cepa condicional contendo a seqüência da ORF NOP53 sob controle do promotor de galactose não cresce em meio contendo glicose, indicando que Nop53p seja uma proteína essencial para a viabilidade celular. Os resultados deste trabalho demonstram que Nop53p está envolvida nas etapas iniciais de clivagem do pré-rRNA, assim como nas clivagens responsáveis pela formação dos rRNAs maduros 5.8S e 25S. Análise mais detalhada do processamento de pré-RNA por Northern blot e \"pulse-chase labeling\", revelou também que Nop53p afeta principalmente o processamento do rRNA intermediário 27S, que origina os rRNAs maduros 5.8S e 25S. Nop53p participa do processamento desses rRNAs afetando a poliadenilação dos precursores dos rRNAs 5.8S e 25S. Experimentos de co-imunoprecipitação de RNA com a proteína de fusão ProtA-Nop53p confirmaram o envolvimento de Nop53p no processamento do 27S rRNA, indicando que essa proteína possa ligar RNA diretamente. A capacidade de Nop53p de ligar RNA foi confirmada através de testes in vitro, enquanto que ensaios de co-imunoprecipitação de cromatina revelaram que Nop53p liga-se ao rRNA 5.8S durante a transcrição. Nop53p regula a função do exossomo através da sua interação direta com a subunidade exclusivamente nuclear deste complexo, Rrp6p. / In eukaryotes, the rRNA processing depends on several factors, such as, endonucleases, exonucleases, RNA helicases, rRNA modifying enzymes and components of the snoRNPs. With the purpose of characterizing new proteins involved in pre-rRNA processing, Nop53p was identified interacting with the nucleolar protein Nop17p in a two hybrid assay. The conditional yeast strain containing the sequence of the ORF NOP53 under the control of the galactose promoter cannot grow in medium containing glucose, indicating that the protein is essential for cell viability. The results of this work demonstrate that Nop53p is involved in the initial steps of pre-rRNA processing and in the cleavages responsible for the formation of the mature rRNAs 5.8S and 25S. A more detailed analysis of the pre-rRNA processing, by Northern blot and pulse-chase labeling, revealed that Nop53p affects the processing of the 27S precursor, that originates the rRNAs 5.8S and 25S. Nop53p participates in the processing of these RNAs by affecting the polyadenylation of the precursors of the rRNAs 5.8S and 25S. RNA co-imunoprecipitation assays with the fusion protein A-Nop53p confirmed the involvement of Nop53p in the processing of the 27S pre-rRNA, indicating that the protein may interact directly with the RNA. The capacity of Nop53p to bind RNA was confirmed by in vitro assays, while chromatin imunoprecipitation assays demonstrated that Nop53p binds the 5.8S rRNA co- transcriptionally. Nop53p regulates the function of the exosome by interacting directly with the exclusively nuclear subunit of the complex, Rrp6p.

A selenocisteína (Sec, U) é o aminoácido que representa a principal forma biológica do elemento selênio e sua incorporação é um processo co-traducional em selenoproteínas como resposta ao códon UGA em fase e requer uma complexa maquinaria molecular. O repertório completo de genes envolvidos nessa via de síntese em procariotos é conhecido, porém algumas das interações moleculares ainda não foram totalmente esclarecidas. Este projeto visa à caracterização molecular nas interações entre o Fator de Elongação específico para incorporação de Sec (SelB) e Seril-tRNA sintetase (SerRS) com distintas construções do tRNASec de Escherichia coli afim de compreender a sua especificidade, seletividade e ordem de eventos. Para isso, medidas de Espectroscopia de Anisotropia de Fluorescência (FAS), Ultracentrifugação Analítica (AUC) e Calorimetria de Varredura Diferencial (DSC) foram utilizadas para determinação das constantes de interação desses complexos proteína-tRNA. Além disto, experimentos de Espalhamento de Raios-X a baixo ângulo (SAXS) e Microscopia eletrônica de transmissão por contraste negativo (NS-EM) foram realizados para elucidação estrutural destes complexos. Os estudos propostos irão auxiliar no entendimento do mecanismo de incorporação e de especificidade do tRNA para este aminoácido em bactérias bem como nos demais domínios da vida além de possibilitar um aumento na compreensão de complexos do tipo proteína-tRNA bem como salientar a importância dos elementos estruturais do tRNA para sua especificidade no processo de síntese de novas proteínas. / Selenocysteine (Sec, U) is an amino acid that represents the main biological form of the selenium element and its incorporation is a co-translational process in selenoproteins in response to the in-phase UGA codon and requires complex molecular machinery. The complete repertoire of genes involved in this pathway of synthesis in prokaryotes is known, although some of the molecular interactions have not yet been fully elucidated. This project aims at the molecular characterization in the interactions between the specific elongation factor for the incorporation of Sec (SelB) and Seril-tRNA synthase (SerRS) with different constructions of tRNASec from Escherichia coli in order to their specificity, selectivity and order of events. For this, measurements using Fluorescence Anisotropy Spectroscopy (FAS), Analytical Ultracentrifugation (AUC) and Differential Scanning Calorimetry (DSC) were employed to determine the interaction constants of the protein-tRNA complexes. In addition, Small Angle X-Ray Scattering (SAXS) experiments and negative stain transmission electron microscopy (NS-EM) were performed for structural elucidation of these complexes. The proposed studies will help to understand the mechanism of tRNA incorporation and specificity for this amino acid in bacteria as well as other domains of life. In addition, it allows an increase in the understanding of protein-tRNA-like complexes as well as emphasizing the importance of structural elements of tRNA for its specificity in the process of synthesis of new proteins.