Tesis por compendio / [ES] La evolución experimental nos permite comprobar postulados teóricos y realizar observaciones que ayuden a incrementar nuestro conocimiento sobre la evolución. Este trabajo tiene como objetivo estudiar la evolución de los virus utilizando enfoques experimentales. Los virus muestran una alta capacidad de evolución, lo que los convierte en modelos perfectos para abordar cuestiones evolutivas con bastante rapidez. Los procesos subyacentes a la evolución y adaptación de los patógenos se rigen por muchos factores: desde la naturaleza intrínseca del virus hasta componentes ambientales que afectan al hospedador, al patógeno y la interacción entre ambos. En esta tesis utilizamos un patosistema formado por una planta y un potyvirus (virus de (+)ssRNA) para explorar cómo diferentes factores bióticos y abióticos modulan la evolución del virus. Primero, exploramos los efectos biológicos de las mutaciones en una proteína del potyvirus, la cual es un componente esencial del complejo de replicación viral. Revelamos las limitaciones evolutivas que operan sobre esta proteína, y que son consecuencia de un equilibrio evolutiva entre la acumulación dentro del huésped y la gravedad de los síntomas. En segundo lugar, examinamos los efectos de la estructura genética de la población del huésped sobre la evolución del virus: evolucionamos virus en poblaciones genéticamente homogéneas de plantas con diferentes susceptibilidades a la infección y en una población heterogénea. Con este trabajo ilustramos cómo la diversidad genética de huéspedes en un ecosistema afecta la adaptación del virus, ya que los virus se especializaron más rápidamente en poblaciones homogéneas pero fueron más patógenos en poblaciones heterogéneas. Finalmente, estudiamos el impacto del ambiente sobre la interacción virus-planta. Para esta parte, primero revisamos los posibles efectos beneficiosos de la infección por virus en ciertos entornos hostiles para la planta. Posteriormente estudiamos el efecto de la sequía, una condición ambiental con una incidencia cada vez mayor y que se sabe afecta la fisiología del huésped. Por lo tanto, evolucionamos un virus en huéspedes bajo condiciones de sequía o de riego abundante. Los virus adaptados en condiciones de sequía conferían una mayor tolerancia a la sequía a la planta huésped a través de alteraciones específicas en la expresión génica del huésped y la señalización hormonal. En general, esta tesis contribuye al aumento del conocimiento en biología evolutiva de los virus de ARN de plantas. / [CA] L'evolució experimental ens permet comprovar postulats teòrics i realitzar observacions que ajuden a incrementar el nostre coneixement sobre l'evolució. Aquest treball té com a objectiu estudiar l'evolució dels virus utilitzant enfocaments experimentals. Els virus mostren una alta capacitat d'evolució, la qual cosa els converteix en models perfectes per a abordar qüestions evolutives amb bastant rapidesa. Els processos subjacents a l'evolució i adaptació dels patògens es regeixen per molts factors: des de la naturalesa intrínseca del virus fins a components ambientals que afecten l'hoste, al patogen i la interacció entre tots dos. En aquesta tesi utilitzem un patosistema format per una planta i un potyvirus (virus de (+)ssRNA) per a explorar com diferents factors biòtics i abiòtics modulen l'evolució del virus. Primer, explorem els efectes biològics de les mutacions en una proteïna del potyvirus, la qual és un component essencial del complex de replicació viral. Revelem les limitacions evolutives que operen sobre aquesta proteïna, i que són conseqüència d'un equilibri evolutiva entre l'acumulació dins de l'hoste i la gravetat dels símptomes. En segon lloc, examinem els efectes de l'estructura genètica de la població de l'hoste sobre l'evolució del virus: evolucionem virus en poblacions genèticament homogènies de plantes amb diferents susceptibilitats a la infecció i en una població heterogènia. Amb aquest treball il·lustrem com la diversitat genètica d'hostes en un ecosistema afecta l'adaptació del virus, ja que els virus es van especialitzar més ràpidament en poblacions homogènies però van ser més patògens en poblacions heterogènies. Finalment, estudiem l'impacte de l'ambient sobre la interacció virus-planta. Per a aquesta part, primer revisem els possibles efectes beneficiosos de la infecció per virus en uns certs entorns hostils per a la planta. Posteriorment estudiem l'efecte de la sequera, una condició ambiental amb una incidència cada vegada major i que se sap afecta la fisiologia de l'hoste. Per tant, evolucionem un virus en hostes sota condicions de sequera o de reg abundant. Els virus adaptats en condicions de sequera conferien una major tolerància a la sequera a la planta hoste a través d'alteracions específiques en l'expressió gènica de l'hoste i la senyalització hormonal. En general, aquesta tesi contribueix a l'augment del coneixement en biologia evolutiva dels virus d'ARN de plantes. / [EN] Experimental evolution allows us to test theoretical postulates and make observations that help increase our knowledge about Evolution. This work aims to use experimental approaches to study the evolution of viruses. Viruses have a high degree of evolvability, which makes them perfect subjects to address evolutionary questions quite rapidly. The underlying processes of pathogen evolution are governed by many factors. These factors can be affecting the virus adaptation at different levels: from the intrinsic virus nature to environmental factors affecting the host, the pathogen and the interaction between both. In this thesis, we used a pathosystem formed by a plant and a potyvirus (+ssRNA virus). Using this pathosystem we have explored how different factors modulate the virus evolution. First, we explored the biological effects of mutations in a potyvirus protein that is an essential component of the virus replication complex. We unveiled the evolutionary constraints on this viral protein, with an evolutionary tradeoff between within-host accumulation and severity of symptoms. Second, we examined the effects of the host population genetic structure on virus evolution: we evolved viruses in homogeneous populations of plants with different viral susceptibilities and in a heterogeneous population. With this work we illustrated how the genetic diversity of hosts in an ecosystem affects virus adaptation, as viruses specialized faster in homogeneous populations but were more pathogenic in heterogeneous ones. Finally, we studied the impact of the environment. For this part we first reviewed the possible beneficial effects of virus infection under certain environments. Afterwards we studied the effect of drought, an environmental condition with a predicted increased incidence and known to affect the host physiology. Therefore, we evolved a virus in host under either well-watered or drought conditions. The viruses adapted under drought conditions conferred an increased drought tolerance to the host plant through specific alterations in host gene expression and hormonal signaling. Overall, this thesis contributed to the increase in knowledge in evolutionary biology of plant RNA viruses. / González Miguélez, R. (2021). Virus Adaptation at Different Levels: Study on the Evolutionary Effects of Mutations, Host Population Genetic Structure and Environmental Factors in Potyviruses [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/178154 / Compendio

[ES] El complejo de especies de Ralstonia solanacearum es el responsable de la marchitez bacteriana, una enfermedad que afecta en todo el mundo a cultivos y plantas ornamentales de gran importancia económica. El filotipo (ft) II raza 3 biovar (bv) 2 produce la podredumbre parda de la patata y la marchitez bacteriana de las solanáceas en climas templados, y se ha introducido recientemente en algunas áreas de la Unión Europea y de Estados Unidos, donde este patógeno se considera un organismo de cuarentena. La presencia de R. solanacearum ft II raza 3 bv 2 en estas zonas ha hecho surgir ciertos interrogantes sobre la biología y la patogenicidad de esta bacteria, algunos de los cuales se han abordado en este trabajo. De esta manera, se han evaluado aspectos del comportamiento, la capacidad de supervivencia y la capacidad para la inducción de la enfermedad, de cepas de R. solanacearum ft II raza 3 bv 2 de origen europeo en diferentes especies vegetales y diversas muestras de agua medioambiental. El comportamiento en cuanto a la colonización de R. solanacearum ft II raza 3 bv 2 in planta ha permitido realizar una clasificación en huéspedes susceptibles o tolerantes y en no huéspedes, en base a la localización histológica del patógeno y su aislamiento. Se ha observado que los huéspedes susceptibles y tolerantes eran intensamente invadidos a nivel del xilema de las raíces, pero densamente o bien débilmente colonizados, respectivamente, a nivel del xilema del tallo. Ninguno de ellos debe ser considerado como candidato para la rotación de cultivos en suelos contaminados. Por otra parte, se ha observado que en los no huéspedes no se producía la invasión a nivel del xilema de la planta, aunque podría haber presencia esporádica del patógeno en el córtex de las raíces o en la superficie y, por lo tanto, algunos podrían actuar como reservorios. Los no huéspedes podrían seleccionarse para los sistemas de rotación tras su evaluación en condiciones de campo. La capacidad de supervivencia de R. solanacearum ft II raza 3 bv 2 en microcosmos de agua medioambiental se ha visto influida por factores tanto abióticos como bióticos. El patógeno ha mostrado una resistencia considerable frente a la exposición a la oligotrofía como único factor de stress. Así, desarrolló varias estrategias que le permitieron sobrevivir en microcosmos de agua medioambiental durante cuatro años bajo condiciones de limitación de nutrientes, manteniendo la capacidad de inducir la enfermedad en el huésped incluso a través de riego. Las estrategias adaptativas para superar la oligotrofía observadas durante este largo periodo han sido la respuesta de supervivencia frente a la privación de nutrientes, la entrada en el estado viable no cultivable, una transformación progresiva de las formas bacilares típicas en cocoides de reducido tamaño, los fenómenos de filamentación y gemación, y la agregación. El patógeno también ha mostrado estrategias eficientes cuando ha sido expuesto a diferentes temperaturas simultaneamente a las condiciones de escasez de nutrientes. De esta manera, a 4°C el frío indujo la entrada en un estado viable no cultivable que fue dependiente del contenido en nutrientes del agua, mientras que a 14°C y 24°C las respuestas de supervivencia frente a la privación de nutrientes, aunque aparentemente similares, revelaron un efecto de la temperatura en la formación de los cocoides. Por otra parte, la persistencia del patógeno se redujo de manera significativa en microcosmos de agua medioambiental por la actividad predadora, competitiva o lítica de los protozoos, las bacterias y/o los bacteriófagos presentes en el agua. Entre todos ellos, se demostró que los fagos líticos fueron los responsables principales del descenso en las poblaciones de R. solanacearum, si bien los protozoos y las otras bacterias contribuyeron en cierta medida. El efecto fue más apreciable a 24°C que a 14°C debido a que las interacciones bióticas fueron más lentas a la temperatura más baja. Esta bacteria ha mostrado una gran capacidad de adaptación, consiguiendo sobrevivir y mantener su poder patógeno en prácticamente todas las condiciones ensayadas. La finalidad de este trabajo ha sido contribuir al progreso del conocimiento de las interacciones entre R. solanacearum ft II raza 3 bv 2 y sus ambientes naturales, para mejorar las estrategias preventivas tanto de la diseminación del patógeno como de la propagación de la marchitez bacteriana en dichos hábitats. / [EN] The Ralstonia solanacearum species complex causes bacterial wilt, a plant disease affecting economically important crops and ornamentals worldwide. The phylotype (ph) II race 3 biovar (bv) 2 produces potato brown rot and bacterial wilt in solanaceous plants in temperate climates and has recently been introduced to several areas of the European Union and the USA, where the pathogen has a quarantine status. Presence of R. solanacearum ph II race 3 bv 2 in these zones raised questions on biological and phytopathological aspects of this bacterium, some of them being addressed in this work. Thus behaviour, ability for survival and disease inducing capacity of European R. solanacearum ph II race 3 bv 2 have been assessed in a range of different plant species and diverse surface run-off water samples. Behaviour of R. solanacearum ph II race 3 bv 2 in planta has led to a classification in susceptible or tolerant hosts and non-hosts, based on the pathogen histological localization and isolation. Susceptible and tolerant hosts were highly invaded in root xylem but, heavily or weakly colonized respectively in stem xylem. They are to be avoided as candidates for crop rotation. Non-hosts were not invaded in plant xylem but, occasional presence of the pathogen in root cortex or on surface might occur and so, some of them might act as reservoirs. They could be selected for crop rotation systems after being carefully tested in open field conditions. Ability for survival of R. solanacearum ph II race 3 bv 2 in environmental water microcosms has been influenced by abiotic and biotic factors. When faced to oligotrophy as the only stressing factor the pathogen displayed a considerable endurance. It resorted to a number of survival strategies which enabled it to survive in environmental water microcosms over four years under starvation, retaining disease inducing capacity in the host even by watering. Adaptations to overcome nutrient limitation during the long period were starvation-survival responses, the entrance into a viable but non-culturable state, progressive transformation from the typical bacillar shape into coccoid forms reduced in size, filamentation and budding phenomena and aggregation. Survival strategies were also successfully exhibited by the pathogen when exposed to environmental temperatures simultaneously to nutrient scarcity conditions. Thus, at 4°C a viable but non-culturable state dependent on water nutrient contents was cold-induced, whilst at 14°C and 24°C apparently similar starvation-survival responses revealed a distinct effect of temperature on coccoid formation. On the other hand, indigenous freshwater protozoa, bacteria and/or phages with predatory, competitive or lytic activity reduced significantly pathogen persistence. Among them, lytic bacteriophages were the main responsible for the decrease in R. solanacearum populations, although protozoa and other bacteria also contributed. The effect was more appreciable at 24°C than at 14°C because of slower biotic interactions at the lower temperature. The pathogen was able to adapt itself, succeeding in surviving and keeping pathogenic in almost all condition. This work intends to contribute to the progress in the knowledge of the interactions between R. solanacearum ph II race 3 bv 2 and natural environments, which may allow to improve the strategies to prevent pathogen dissemination and bacterial wilt spread in natural settings. / [FR] Le complexe d'espèces de Ralstonia solanacearum est l'agent causal du flétrissement bactérien, une maladie qui affecte des cultures et des plantes ornementales de grande importance économique dans le monde entier. Le phylotype (phyl) II race 3 biovar (bv) 2 produit la pourriture brune de la pomme de terre et d’une manière générale le flétrissement bactérien des Solanacées dans les climats tempérés. Ce phylotype II a récemment été introduit dans des certaines régions de l'Union Européenne et des États-Unis, où cette bactérie est considérée comme un pathogène de quarantaine. La présence de R. solanacearum phyl II race 3 bv 2 dans ces régions a soulevé quelques questions au sujet de sa biologie et de son pouvoir pathogène, questions qui ont été abordées dans ce travail. Nous avons notamment évalué, chez R. solanacearum phyl II race 3 bv 2 d'origine européenne, l'aptitude à survivre dans divers échantillons de l'eau environnementale de surface et la capacité à induire la maladie dans des différentes espèces de plantes cultivées. Notre étude de la capacité de colonisation de R. solanacearum phyl II race 3 bv 2 in planta a permis une classification en hôtes sensibles ou tolérants et non hôtes sur la base de la localisation histologique de l'agent pathogène et de son isolement in planta. Il a été noté que les hôtes sensibles et tolérants sont intensément envahis à niveau du xylème des racines, mais fortement ou faiblement colonisés à niveau du xylème de la tige chez les plantes sensibles ou tolérantes respectivement. Aucune de ces plantes ne doit être recommandée comme candidat dans une rotation culturale. En outre, nous avons noté que le xylème des plantes non hôtes n’est pas envahi, bien que l’on puisse noter la présence sporadique de l'agent pathogène dans le cortex des racines ou sur la surface racinaire. Cela signifie que certaines plantes non hôtes pourraient potentiellement être des réservoirs d’inoculum latent. En conséquence les plantes non hôtes qui pourraient être recommandées dans des systèmes de rotation culturale doivent être évaluées non seulement au laboratoire mais aussi au champ dans des conditions naturelles. Nous avons montré que la capacité de survie de R. solanacearum phyl II race 3 bv 2 dans des microcosmes de l'eau environnementale, préalablement filtrée ou autoclavée, est influencée par des facteurs abiotiques et biotiques. L'agent pathogène fait preuve d'une résistance considérable quand il est exposé à l'oligotrophie comme seul facteur de stress. Nous avons mis en évidence différentes stratégies utilisées par cette bactérie pour survivre plus de quatre ans dans des conditions de limitation des éléments nutritifs dans des microcosmes de l'eau environnementale tout en maintenant sa capacité d'induction de la maladie chez un hôte sensible à la suite de sa dissémination par irrigation. Les adaptations utilisées par cette bactérie pour surmonter l'oligotrophie au cours de cette longue période ont été l'entrée dans l'état viable non cultivable, une transformation progressive des typiques formes bacillaires vers des formes coccoïdes de petite taille, des phénomènes de filamentation et de bourgeonnement et d'agrégation. L'agent pathogène a également utilisé des stratégies efficaces quand il a été exposé à des différentes températures de l'environnement en même temps qu'à des conditions de limitation des éléments nutritifs. Ainsi à 4°C le froid a entraîné un état viable non cultivable qui a été dépendant de la teneur en éléments nutritifs de l'eau. Par contre à 14°C et 24°C les réponses de survie face à la privation des éléments nutritifs ont induit la formation de formes coccoïdes. En outre, la persistance de l'agent pathogène a été considérablement réduite dans des microcosmes de l'eau environnementale par l'activité prédatrice, compétitive ou lytique des protozoaires, des bactéries et/ou des bactériophages qui étaient contenus dans de l'eau. Notamment, il a été constaté que les phages lytiques sont les principaux responsables de la baisse des populations de R. solanacearum, bien que les protozoaires et d'autres bactéries aient également contribués dans une certaine mesure. L'effet a été plus sensible à 24°C qu'à 14°C en raison d'interactions biotiques plus lentes aux températures plus basses. En conclusion cette bactérie a démontré une grande capacité pour s'adapter, survivre et de maintenir son pouvoir pathogène dans pratiquement toutes les conditions couramment rencontrées dans les conditions naturelles. Le but de ce travail a été de contribuer à l'avancement de la connaissance des interactions entre R. solanacearum phyl II race 3 bv 2 et les milieux aquatiques naturels ou les plantes hôtes potentielles, dans l’espoir de développer les meilleures stratégies pour empêcher la propagation de l'agent pathogène et donc du flétrissement bactérien dans ces environnements. / [CA] El complex d'espècies de Ralstonia solanacearum és l'agent causal del pansiment bacterià, una malaltia vegetal que afecta a tot el món a cultius i plantes ornamentals de gran importància econòmica. El filotipo (fil) II raça 3 biovar (bv) 2 produeix la podridura marró de la patata i el pansiment bacterià en plantes solanàcies de climes temperats, i s'ha introduït recentment en algunes àrees de la Unió Europea i dels Estats Units, on aquest patogen es considera de quarantena. La presència de R. solanacearum fil II raça 3 bv 2 en aquestes zones ha fet sorgir certs interrogants sobre qüestions biològiques i fitopatològiques d'aquest bacteri, algunes de les quals s'han abordat en aquest treball. D'aquesta manera s'han valorat aspectes del comportament, la capacitat de supervivència i la capacitat per a la inducció de la malaltia, de R. solanacearum fil II raça 3 bv 2 de procedència europea en diferents espècies vegetals i diverses mostres d'aigua d'escorrentia superficial. El comportament pel que fa a la colonització de R. solanacearum fil II raça 3 bv 2 in planta ha proporcionat una classificació en hostes susceptibles o tolerants i en no hostes, en base a la localització histològica del patogen i el seu aïllament. S'observà que els hostes susceptibles i tolerants eren intensament envaïts a nivell del xilema de les arrels, però densament o bé feblement colonitzats respectivament a nivell del xilema de la tija. Cap d'ells ha de ser considerat com a candidat per a la rotació cultural. D'altra banda, es va observar que els no hostes no eren envaïts en el xilema de la planta, encara que podria haver presència esporàdica del patogen en el còrtex de les arrels o a la surperfície i, per tant, alguns podrien actuar com a reservoris. Els no hostes podrien ser seleccionats per als sistemes de rotació cultural després d'haver estat avaluats en condicions de camp. La capacitat de supervivència de R. solanacearum fil II raça 3 bv 2 en microcosmos d'aigua mediambiental s'ha vist influïda per factors abiòtics i biòtics. El patogen ha mostrat una resistència considerable quan ha estat exposat a l'oligotrofia com a únic factor d'estrès. Així, va recórrer a diverses estratègies que li van permetre sobreviure en microcosmos d'aigua mediambiental durant quatre anys sota condicions de limitació de nutrients, mantenint la capacitat per a la inducció de la malaltia en l'hoste fins i tot a través de reg. Les adaptacions per superar l'oligotrofia que s'han observat durant aquest llarg període han estat respostes de supervivència front a la privació de nutrients, l'entrada en l'estat viable no cultivable, una transformació progressiva de les típiques formes bacilars a cocoids de reduït tamany, els fenòmens de filamentació i gemmació, i l'agregació. El patogen també ha mostrat estratègies eficients quan ha estat exposat a diferents temperatures mediambientals simultàneament a les condicions d'escassetat de nutrients. D'aquesta manera, a 4°C el fred va induir un estat viable no cultivable que va ser dependent del contingut en nutrients de l'aigua, mentre que a 14°C i 24°C les respostes de supervivència front a la privació de nutrients, encara que aparentment similars, van revelar un efecte de la temperatura a la formació dels cocoids. D'altra banda, la persistència del patogen s'ha vist significativament reduïda en microcosmos d'aigua mediambiental per l'activitat predadora, competitiva o lítica dels protozous, els bacteris i/o els bacteriòfags que contenia l'aigua. Entre tots ells, es va determinar que els fags lítics eren els responsables principals del descens en les poblacions de R. solanacearum, si bé els protozous i els altres bacteris van contribuir en certa mesura. L'efecte va ser més apreciable a 24°C que a 14°C degut a que les interaccions biòtiques van ser més lentes a la temperatura més baixa. Aquest bacteri ha mostrat una gran capacitat d'adaptació, aconseguint sobreviure i mantenir el seu poder patogènic en pràcticament totes les condicions. La finalitat d'aquest treball és contribuir al progrés del coneixement de les interaccions entre R. solanacearum fil II raça 3 bv 2 i els seus ambients naturals, el que pot desenvolupar una millora de les estratègies per a la prevenció tant de la disseminació del patogen com de la propagació del pansiment bacterià en aquests ambients. / B. Álvarez specially thanks the Marie Curie Foundation for a Marie Curie Fellowship at the IFR40 in Toulouse (France) and the Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias for a predoctoral grant. This work has been funded by the European contract QLK3-CT-2000-01598 acronym “Potatocontrol” and FAIR 5-CT97-3632 of the European Union, FD 1997-2279 of the Ministerio de Educación y Ciencia of Spain and GV05/214 of the Generalitat Valenciana. / Álvarez Ortega, MB. (2009). Biology of Ralstonia Solanacearum Phylotype II in Host and Non-Host Environments [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/191532

Tesis por compendio / [ES] La producción en acuicultura se ha visto menguada por aparición de enfermedades en los sistemas de cría de peces. En concreto, en la dorada (Sparus aurata), hay dos parásitos destacados: Enteromyxum leei (Myxozoa) y Enterospora nucleophila (Microsporidia). Hasta la fecha, para ninguno de los dos se ha establecido un cultivo in vitro, y solo para E. leei se ha conseguido establecer un modelo de mantenimiento de la infección in vivo. La presente tesis pretende incrementar el conocimiento sobre estos parásitos y sus relaciones con el hospedador, sentando las bases para generar soluciones que puedan ser aplicadas en la acuicultura. El objetivo con E. leei fue estudiar la inmunidad adquirida inducida en la dorada y la posibilidad de generar herramientas de diagnóstico y vacunas frente a esta enfermedad. Para ello, primero se demostró la resistencia del pez al parásito tras una segunda exposición, la cual duró hasta 16 meses. Además, la resistencia parece estar correlacionada con altos niveles de inmunoglobulina (Ig) M específica en sangre, y una alta expresión de Igs, incluso antes de la re-exposición al parásito. El siguiente paso fue afinar el protocolo de infección con E. leei. Los resultados mostraron que una semana es suficiente para transmitir la infección de E. leei por efluente, independientemente de la temperatura. Tras la demostración de la respuesta adaptativa eficaz frente a E. leei, y al disponer de un modelo de infección refinado, se realizó un ensayo de inmunización pasiva. Aquí, los resultados mostraron que los anticuerpos especi'ficos efectivamente consigue ralentizar la invasión del intestino por el parásito y disminuir los síntomas de la enfermedad. Paralelamente, el resultado del análisis del repertorio de las regiones variables de la IgM e IgT del intestino peces resistentes mostró la inducción de una respuesta policlonal en las ce'lulas B. En base a estos resultados, se realizó una búsqueda de antígenos de E. leei que pudieran ser utilizados como candidatos para la producción de vacunas (análisis proteómico) o herramientas de diagnóstico (análisis in silico). Para ello, se ensambló un transcriptoma de novo utilizando una muestra mixta de intestino de dorada y parásito. Los resultados dieron lugar a 7 y 12 candidatos en la búsqueda in silico y proteómica, respectivamente. En los estudios de E. nucleophila, debido a que fue descrita muy recientemente, el punto de partida fue más básico. Las muestras de este parásito solo se pueden obtener de brotes naturales en piscifactorias. Por ello, primero se realizó un estudio de caracterización de la patología de la infección a partir de peces infectados naturalmente. En etapas tempranas de la infección, el parásito se localiza principalmente en el intestino, pero meses después, la prevalencia en intestino baja e incrementa en los órganos hematopoyéticos y el esto'mago. Los signos clínicos de la infección consistieron en una reducción significativa del crecimiento, emaciación, y palidez de las paredes intestinales. A nivel celular, en los casos ma's graves se observó hipercelularidad en el epitelio intestinal y proliferación de ce'lulas rodlet, un elevado número de linfocitos en la base del epitelio e infiltración de granulocitos acidófilos en el epitelio intestinal. Finalmente se probaron varias formas de transmisión horizontal de E. nucleophila (cohabitación, efluente, intubación oral y anal) con para desarrollar un modelo de mantenimiento in vivo. Se consiguió la transmisión el parásito por todas las vías, pero con una disminución de prevalencia a lo largo del tiempo. Variables como la temperatura, la dosis, y el estado de los peces donantes parecen ser más determinantes que la ruta seleccionada para la transmisión. Entre las rutas probadas, la intubación anal parece ser la más prometedora, pero ninguna de ellas fue capaz de reproducir los signos clínicos observados en las infecciones naturales. / [CA] La producció en aqüicultura s'ha vist minvada per aparició de malalties en els sistemes de cria de peixos. En concret, en l'orada (Sparus aurata), hi ha dos paràsits destacats: Enteromyxum leei (Myxozoa) i Enterospora nucleophila (Microsporidia). Fins avui, per a cap dels dos s'ha establert un cultiu in vitro, i només per a E. leei s'ha aconseguit establir un model de manteniment de la infecció in vivo. La present tesi pretén incrementar el coneixement sobre aquests paràsits i les seves relacions amb l'hoste, establint les bases per a generar solucions que puguin ser aplicades en l'aqüicultura. L'objectiu amb E. leei va ser estudiar la immunitat adquirida induïda en l'orada i la possibilitat de generar eines de diagnòstic i vacunes enfront d'aquesta malaltia. Per a això, primer es va demostrar la resistència del peix al paràsit després d'una segona exposició, la qual va durar fins a 16 mesos. A més, la resistència sembla estar correlacionada amb alts nivells d'immunoglobulina (Ig) M específica en sang, i una alta expressió de Igs, fins i tot abans de la re-exposició al paràsit. El següent pas va ser afinar el protocol d'infecció amb E. leei. Els resultats van mostrar que una setmana és suficient per a transmetre la infecció de E. leei per efluent, independentment de la temperatura. Després de la demostració de la resposta adaptativa eficaç enfront de E. leei, i en disposar d'un model d'infecció refinat, es va realitzar un assaig d'immunització passiva. Aquí, els resultats van mostrar que els anticossos específics efectivament aconsegueix alentir la invasió de l'intestí pel paràsit i disminuir els símptomes de la malaltia. Paral·lelament, el resultat de l'anàlisi del repertori de les regions variables de la IgM i IgT de l'intestí peixos resistents va mostrar la inducció d'una resposta policlonal en les cèl·lules B. Sobre la base d'aquests resultats, es va realitzar una cerca d'antígens de E. leei que poguessin ser utilitzats com a candidats per a la producció de vacunes (anàlisis proteómico) o eines de diagnòstic (anàlisi in silico). Per a això, es va assemblar un transcriptoma de novo utilitzant una mostra mixta d'intestí d'orada i paràsit. Els resultats van donar lloc a 7 i 12 candidats en la cerca in silico i proteòmica, respectivament. En els estudis de E. nucleophila, pel fet que va ser descrita molt recentment, el punt de partida va ser més bàsic. Les mostres d'aquest paràsit només es poden obtenir de brots naturals en piscifactorias. Per això, primer es va realitzar un estudi de caracterització de la patologia de la infecció a partir de peixos infectats naturalment. En etapes primerenques de la infecció, el paràsit es localitza principalment en l'intestí, però mesos després, la prevalença en intestí baixa i incrementa en els òrgans hematopoètics i l'estómac. Els signes clínics de la infecció van consistir en una reducció significativa del creixement, emaciació, i pal·lidesa de les parets intestinals. A nivell cel·lular, en els casos més greus es va observar hipercelularidad en l'epiteli intestinal i proliferació de cèl·lules rodlet, un elevat nombre de limfòcits en la base de l'epiteli i infiltració de granulòcits acidòfils en l'epiteli intestinal. Finalment es van provar diverses formes de transmissió horitzontal de E. nucleophila (cohabitació, efluent, intubació oral i anal) amb per a desenvolupar un model de manteniment in vivo. Es va aconseguir la transmissió el paràsit per totes les vies, però amb una disminució de prevalença al llarg del temps. Variables com la temperatura, la dosi, i l'estat dels peixos donants semblen ser més determinants que la ruta seleccionada per a la transmissió. Entre les rutes provades, la intubació anal sembla ser la més prometedora, però cap d'elles va ser capaç de reproduir els signes clínics observats en les infeccions naturals. / [EN] Aquaculture production is hampered by the emergence of parasite diseases in fish farming systems. Among them, in Sparus aurata, there are two important enteric parasites described: Enteromyxum leei (Myxozoa) Enterospora nucleophila (Microsporidia). To date, no in vitro culture has been established for either parasite, and only for E. leei was it possible to establish a model for maintaining the infection in vivo. The aim of this thesis is to gain new knowledge about these parasites and their relationship with the host, also the basic foundations for generating solutions that can be applied in aquaculture. The general objective for E. leei was to study the acquired immunity induced in gilthead bream and the possibility of generating diagnostic tools and vaccines against this disease. To this end, resistance against the parasite was assessed with a second exposure against the parasite, which showed a resistance for at least 16 months. Besides resistance seemed to be correlated with high levels of specific immunoglobulin (Ig) M in blood, and a high expression of Igs, in particular, the soluble forms, even before re-exposure to the parasite. The next step was refining the protocol for effluent infection with E. leei by studying infection at different exposure time points, temperatures and population densities. The results showed that one week of exposure is sufficient to spread E. leei infection by effluent, regardless of temperature. After demonstrating the resistance against E. leei, and with a refined infection model, a passive immunization assay was performed. The results showed that the serum with specific antibodies effectively slows down the invasion of the gut by the parasite and reduces the symptoms of the disease. At the same time, the analysis of the repertoire of the variable regions of intestinal IgM and IgT showed an induction of a polyclonal response in B cells. On the basis of these results, a research was carried out for E. leei antigens that could have use as candidates for the production of vaccines (proteomic study) or diagnostic tools (in silico study) using the parasite transcriptomic data. To do this, a de novo transcriptome was assembled using a mixed sample of gilthead sea bream and parasite, with a posterior filtrate of the sequences. The In silico and proteomic analysis search resulted in 7 and 12 transcripts, respectively, which are being used for diagnostic and vaccine production. The starting point was more basic in E. nucleophila studies, since this is a recently described disease. The samples of this parasite can only be obtained from natural outbreaks in fish farms. Therefore, first study was carried out to characterize the pathology of the infection of naturally infected fish. In the early stages of the infection, the parasite is mainly located in the intestine, but months later, the prevalence is lower in the intestine and increases in the hematopoietic organs and the stomach. Clinical signs of infection were significant reduction in growth, wasting, and intestinal walls paleness. At the cellular level, in the most severe cases hypercellularity in the intestinal epithelium, proliferation of rodlet cells, high number of lymphocytes at the base of the epithelium and infiltration of acidophilic granulocytes in the intestinal epithelium were observed. Finally, horizontal transmission of E. nucleophila was tried using different transmission methods: cohabitation, effluent, and oral and anal intubation. Transmission of the parasite was achieved with all routes, but there was a decrease in prevalence over time in all cases except for the anal route. Variables such as temperature, dose, and the status of the donor fish appear to be more important than the selected route. Among the routes tested, anal intubation seemed to be the most promising, as it was sustained over a longer period of time, but none of them was able to reproduce the same clinical signs of infection observed in natural infections. / The authors kindly acknowledge the collaboration of anonymous fish farming companies allowing access to the animals during the disease outbreaks. We thank J. Monfort and L. Rodríguez (IATS-CSIC) for the technical assistance on histological processing.This work has been carried out with financial support from the European Union and the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness (MINECO) under grant projects ParaFishControl (H2020-634429) and AGL2013-R-48560-C2-2-R, respectively. APS was contracted under ParaFishControl project. Primer sequences and access to the gilthead sea bream transcriptomic database were kindly provided by Prof. J. Pérez-Sánchez of the IATS- Nutrigenomics group. The authors thank I. Vicente for fish maintenance and technical assistance during samplings. The authors thank P. Boudinot (INRAE) for his help in designing and interpreting the immunoglobulin repertoire study and results, J. Pérez-Sánchez (IATS-CSIC) for providing access to the gilthead sea bream genome sequences to perform the repertoire analysis.This work was funded by the European Research Council (ERC Consolidator Grant 2016 725061 TEMUBLYM). / Picard Sánchez, MA. (2021). Control of enteric parasitic diseases of farmed gilthead sea bream: New insights into Enteromyxum leei (Myxozoa) and Enterospora nucleophila (Microsporidia) infections [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/167035 / Compendio