Diss. (sammanfattning) Uppsala : Uppsala universitet, 2006. / Härtill 4 uppsatser.

Master of Science / Department of Plant Pathology / John P. Fellers / Harold N. Trick / Wheat streak mosaic virus (WSMV) and Triticum mosaic virus (TriMV), are two of the major viruses in the Great Plains of the United States. Cultural practices and mite vector control are the primary methods of disease management; however, they are not fully effective. Resistant varieties are also deployed, although some of the lines present temperature sensitive resistance or negative agronomic properties are linked to resistance. Alternative approaches to viral resistance are needed. RNAi has been shown to play a role in viral defense response and has been successfully used as a biotechnological tool to preprogram viral resistance in transgenic plants. RNAi reduces the expression of specific genes by targeting the accumulation of mRNA. The mechanism is activated by the presence of dsRNA, which is processed into small non-coding sequence that serves as a guide for degrading RNA in a sequence specific manner. In this work, the RNAi approach was used to elicit resistance against WSMV and TriMV. Immature embryos of the wheat cv "Bobwhite" were independently co-transformed with pAHC20, containing the bar gene for glufosinate selection, and either the hairpin construct targeting the coat protein of WSMV or TriMV. After tissue culture, PCR was used to determined the presence of the RNAi CP transgene in putative transformed plants. Eight WSMV and ten TriMV CP RNAi transgenic plants were obtained from the bombardment experiments. Transgenic T1 and T2 seeds were collected and transgene expression was established through RT-PCR. In order to determine viral resistance, T1 and T2 progeny was mechanically inoculated. ELISA results indicated a differential resistance response among the tillers evaluated in each line in T1 generation for both WSMV and TriMV constructs. In T1 generation resistance was seen in up to 60% of the plants evaluated for both constructs, although some events that showed transgene presence did not exhibited resistant phenotype. Analyses of transgene presence and expression in T2 generation evidenced events of transgene silencing and deletion. Regardless of these phenomena, consistent resistance response in two lines of WSMV CP construct and one TriMV CP transgenic line was found.

O conhecimento do genoma humano e os avanços na biologia molecular levaram a descoberta de mecanismos celulares importantes. A terapia gênica surgiu com a proposta de interferir na fisiologia das células, que apresentam alguma disfunção causadora de uma doença, trazendo a possibilidade de tratamento para incontáveis enfermidades. Na tecnologia de RNA de interferência pequenos fragmentos de RNA de fita dupla (small interference RNA, siRNA) são utilizados para inibir a expressão de genes específicos. O olho tem sido um dos órgãos alvo para o uso desse tipo de tecnologia e, além disso, a córnea é uma membrana atrativa devido ao fácil acesso e a existência de diversas enfermidades que acometem a visão. Para aumentar a biodisponibilidade e viabilizar a administração de siRNA utilizando um polímero catiônico, uma formulação termorreversível com quitosana e outra composta de cristais líquidos funcionalizados com ácido hialurônico foram estudadas como possíveis sistemas de liberação ocular de siRNA, sendo que ambas são inéditas para aplicação tópica e oftálmica de siRNA. O gel termorreversível de poloxamer 407 foi associado a dois diferentes tipos de quitosana (LMW com 92,2% de desacetilação e MMW com 77,0% de desacetilação). Ambas as formulações apresentaram características desejáveis tanto como sistema de liberação de genes, tanto por apresentarem residual positivo e capacidade de complexar o siRNA, quanto como sistema compatível com via tópica ocular, devido ao comportamento reológico pseudoplástico. A quitosana LMW e a adição de NaCl à formulação alteraram a Tsol/gel do poloxamer; somente a associação com a quitosana MMW apresentou Tsol/gel adequada. Os sistemas contendo poloxamer em associação com os dois diferentes tipos de quitosana não promoveram a penetração do siRNA in vitro em córnea bovina nas condições experimentais utilizadas. O sistema líquido cristalino foi desenvolvido com monoleína (MO), polietilenimina (PEI), ácido hialurônico (HA) e fase aquosa. A formação de fases cristalinas foi avaliada por microscopia de luz polarizada e a estrutura das mesofases foi confirmada pela difração de raios X a baixo ângulo. O sistema líquido cristalino, composto de uma mistura de cristais de fase cúbica e hexagonal, foi disperso em nanopartículas de tamanho satisfatório, de aproximadamente 166 nm. Os sistemas apresentaram características desejáveis como sistema de liberação de genes, como potencial zeta adequado, capacidade de complexar sem degradar o siRNA e não foram citotóxicos em fibroblastos L929, além de serem compatíveis com a via ocular por serem isotônicos. A dispersão de cristais de MO/PEI foi capaz de transfectar as células L929, entretanto a incorporação do HA diminuiu a absorção celular, provavelmente devido ao elevado peso molecular do ácido hialurônico empregado. O presente estudo permite delinear o futuro desenvolvimento de formulações tópicas para administração de siRNA na córnea. / The understanding of human genome and the evolvement of molecular biology led to discovery of important cellular mechanisms. Gene therapy has emerged as an approach to interfere with cell physiology, whenever it has a dysfunction that causes a disease, bringing new possibility of treatment to countless illnesses. In RNA interference mechanism, small double-stranded RNAs (small interference RNA, siRNA) inhibit specific gene expression. The eye has been one of the targeted organs for the use of such technology and, moreover, the corneal membrane is an attractive tissue due to the easy access and the existence of several diseases that can impair vision. To enhance bioavailability and facilitate the delivery of siRNA using a cationic polymer, a thermoreversible formulation containing chitosan and a liquid crystalline formulation functionalized hyaluronic acid were studied as potential delivery systems for ocular delivery of siRNA and both this systems are inedited as topical and ocular delivery of siRNA. A poloxamer 407 thermoreversible gel of was associated with two different types of chitosan (LMW with 92.2% deacetylation and MMW with 77.0% deacetylation). Both formulations showed desirable characteristics not only as gene delivery systems due to positive residual charge and capacity for complexing the siRNA, but also as a compatible ocular delivery system, due to pseudoplastic rheological behavior. The LMW chitosan and addition of NaCl to the formulation influenced the Tsol/gel of poloxamer gel; only the association with MMW chitosan showed desirable Tsol/gel. The systems containing poloxamer in combination with two different types of chitosan did not promote in vitro penetration of siRNA using bovine cornea under the used experimental conditions. The liquid crystalline system was developed with monoolein (MO), polyethylenimine (PEI), hyaluronic acid (HA) and aqueous phase. The formation of crystalline phases was observed by polarized light microscopy and the mesophases structures were confirmed by small angle X-ray diffraction. The liquid crystalline system composed of a mixture of hexagonal and cubic phases was dispersed into nanoparticles of suitable size, of approximately 166 nm. The formulations showed desirable characteristics as gene delivery systems, such as suitable zeta potential, ability to complex without degrading the siRNA and were not cytotoxic to fibroblasts L929, moreover, were compatible with the ocular administration due to isotonicity. The dispersion of crystals of MO/PEI was able to transfect L929 cells, however the incorporation of the HA decreased cellular uptake, probably due to high molecular weight hyaluronic acid employed. This study provides an outline for the future development of topical formulations to deliver siRNA to the cornea.

O conhecimento do genoma humano e os avanços na biologia molecular levaram a descoberta de mecanismos celulares importantes. A terapia gênica surgiu com a proposta de interferir na fisiologia das células, que apresentam alguma disfunção causadora de uma doença, trazendo a possibilidade de tratamento para incontáveis enfermidades. Na tecnologia de RNA de interferência pequenos fragmentos de RNA de fita dupla (small interference RNA, siRNA) são utilizados para inibir a expressão de genes específicos. O olho tem sido um dos órgãos alvo para o uso desse tipo de tecnologia e, além disso, a córnea é uma membrana atrativa devido ao fácil acesso e a existência de diversas enfermidades que acometem a visão. Para aumentar a biodisponibilidade e viabilizar a administração de siRNA utilizando um polímero catiônico, uma formulação termorreversível com quitosana e outra composta de cristais líquidos funcionalizados com ácido hialurônico foram estudadas como possíveis sistemas de liberação ocular de siRNA, sendo que ambas são inéditas para aplicação tópica e oftálmica de siRNA. O gel termorreversível de poloxamer 407 foi associado a dois diferentes tipos de quitosana (LMW com 92,2% de desacetilação e MMW com 77,0% de desacetilação). Ambas as formulações apresentaram características desejáveis tanto como sistema de liberação de genes, tanto por apresentarem residual positivo e capacidade de complexar o siRNA, quanto como sistema compatível com via tópica ocular, devido ao comportamento reológico pseudoplástico. A quitosana LMW e a adição de NaCl à formulação alteraram a Tsol/gel do poloxamer; somente a associação com a quitosana MMW apresentou Tsol/gel adequada. Os sistemas contendo poloxamer em associação com os dois diferentes tipos de quitosana não promoveram a penetração do siRNA in vitro em córnea bovina nas condições experimentais utilizadas. O sistema líquido cristalino foi desenvolvido com monoleína (MO), polietilenimina (PEI), ácido hialurônico (HA) e fase aquosa. A formação de fases cristalinas foi avaliada por microscopia de luz polarizada e a estrutura das mesofases foi confirmada pela difração de raios X a baixo ângulo. O sistema líquido cristalino, composto de uma mistura de cristais de fase cúbica e hexagonal, foi disperso em nanopartículas de tamanho satisfatório, de aproximadamente 166 nm. Os sistemas apresentaram características desejáveis como sistema de liberação de genes, como potencial zeta adequado, capacidade de complexar sem degradar o siRNA e não foram citotóxicos em fibroblastos L929, além de serem compatíveis com a via ocular por serem isotônicos. A dispersão de cristais de MO/PEI foi capaz de transfectar as células L929, entretanto a incorporação do HA diminuiu a absorção celular, provavelmente devido ao elevado peso molecular do ácido hialurônico empregado. O presente estudo permite delinear o futuro desenvolvimento de formulações tópicas para administração de siRNA na córnea. / The understanding of human genome and the evolvement of molecular biology led to discovery of important cellular mechanisms. Gene therapy has emerged as an approach to interfere with cell physiology, whenever it has a dysfunction that causes a disease, bringing new possibility of treatment to countless illnesses. In RNA interference mechanism, small double-stranded RNAs (small interference RNA, siRNA) inhibit specific gene expression. The eye has been one of the targeted organs for the use of such technology and, moreover, the corneal membrane is an attractive tissue due to the easy access and the existence of several diseases that can impair vision. To enhance bioavailability and facilitate the delivery of siRNA using a cationic polymer, a thermoreversible formulation containing chitosan and a liquid crystalline formulation functionalized hyaluronic acid were studied as potential delivery systems for ocular delivery of siRNA and both this systems are inedited as topical and ocular delivery of siRNA. A poloxamer 407 thermoreversible gel of was associated with two different types of chitosan (LMW with 92.2% deacetylation and MMW with 77.0% deacetylation). Both formulations showed desirable characteristics not only as gene delivery systems due to positive residual charge and capacity for complexing the siRNA, but also as a compatible ocular delivery system, due to pseudoplastic rheological behavior. The LMW chitosan and addition of NaCl to the formulation influenced the Tsol/gel of poloxamer gel; only the association with MMW chitosan showed desirable Tsol/gel. The systems containing poloxamer in combination with two different types of chitosan did not promote in vitro penetration of siRNA using bovine cornea under the used experimental conditions. The liquid crystalline system was developed with monoolein (MO), polyethylenimine (PEI), hyaluronic acid (HA) and aqueous phase. The formation of crystalline phases was observed by polarized light microscopy and the mesophases structures were confirmed by small angle X-ray diffraction. The liquid crystalline system composed of a mixture of hexagonal and cubic phases was dispersed into nanoparticles of suitable size, of approximately 166 nm. The formulations showed desirable characteristics as gene delivery systems, such as suitable zeta potential, ability to complex without degrading the siRNA and were not cytotoxic to fibroblasts L929, moreover, were compatible with the ocular administration due to isotonicity. The dispersion of crystals of MO/PEI was able to transfect L929 cells, however the incorporation of the HA decreased cellular uptake, probably due to high molecular weight hyaluronic acid employed. This study provides an outline for the future development of topical formulations to deliver siRNA to the cornea.

Os tumores astrocíticos são originados a partir dos astrócitos e classificados de acordo com a Organização Mundial de Saúde em astrocitoma pilocítico (grau I), astrocitoma subependimal de células gigantes (grau I), xantoastrocitoma pleomórfico (grau II), astrocitoma difuso (grau II), astrocitoma anaplásico (grau III) e glioblastoma (GBM) (grau IV). Este último é o tumor cerebral mais frequente em adultos, possuindo uns dos piores prognósticos, devido principalmente à radioresistência do tumor, com uma sobrevida média de 14 meses. Vários estudos têm procurado encontrar novos alvos terapêuticos e os genes da família BUB são candidatos promissores, devido ao seu papel no controle do ciclo celular. Estes genes participam do mecanismo do ponto de checagem do fuso mitótico, prevenindo a separação prematura das cromátides irmãs. Os objetivos deste trabalho foram avaliar a expressão de BUB1, BUB3 e BUBR1 em amostras de pacientes portadores de gliomas de baixo grau (I e II) e glioblastoma, relacionar as expressões destes genes à sobrevida e estudar os efeitos da inibição dos genes BUB1 e BUBR1, por RNAi, na linhagem pediátrica SF188. Nossos resultados mostraram que tanto BUB1 quanto BUBR1 foram hiperexpressos nos glioblastomas e nos gliomas de baixo grau em relação à substância branca (p<0,05). A análise da expressão destes genes em amostras de glioblastomas em relação a amostras de grau I e II demonstrou uma hiperexpressão dos genes BUB1 e BUBR1 e uma hipoexpressão do BUB3 em glioblastoma (p<0,05). Em relação à sobrevida, os baixos níveis de expressão dos genes BUB1 e BUBR1 foram relacionados a uma melhor sobrevida quando analisado o total de todos os pacientes. Paralelamente, a inibição dos genes BUB1 e BUBR1 na linhagem SF188 resultou em uma diminuição da proliferação e também da capacidade clonogênica, além de um aumento na apoptose quando combinado com temozolomida (TMZ). Também foram realizados experimentos com inibições dos genes com ou sem a presença de irradiação. Esta combinação resultou em uma diminuição tanto da proliferação quanto da capacidade clonogênica. Estes resultados sugerem que o BUB1 e o BUBR1 podem ser considerados alvos interessantes para o tratamento de glioblastoma, porém estudos adicionais são necessários para confirmar tal potencial. / Astrocytic tumors are originated from astrocitytes and classified according to the World Health Organization into pilocytic astrocytoma (grade I), subependymal giant cell astrocytoma (grade I), pleomorphic xanthoastrocytoma (grade II), diffuse astrocytoma (grade II), anaplastic astrocytoma (grade III) and Glioblastoma (GBM) (grade IV). Glioblastoma is the most common brain tumor in adults with a very poor prognosis and a median survival of 14 months. Because their role in cell cycle control, several authors have previously ponited the BUB gene family as new therapeutic target candidates. These genes participate in the mitotic checkpoint by preventing the premature separation of sister chromatids. The aims of this study were to study the expression of BUB1, BUB3 e BUBR1 in samples of patients with low-grade gliomas (I and II) and glioblastoma, evaluate any association of gene expression with patient survival and analyze BUB1 e BUBR1 inhibition (by iRNA) effects, on SF188, a pediatric cell line. BUB1 and BUBR1 were found hyperexpressed in glioblastoma samples and in low-grade gliomas when compared with white matter samples (p<0.05). The analysis of the expression of these genes in glioblastoma samples compared with grade I and II samples showed a hyperexpression of BUB1 and BUBR1, while BUB3 was hipoexpressed in glioblastoma (p<0.05). In the survival analysis, the hipoexpression of BUB1 and BUBR1 genes were related with a better survival when all patients were considered. The BUB1 and BUBR1 inhibition resulted in decreased proliferation and colony formation, along with increased apoptosis when combined with temozolomide. Experiments with the inhibition of genes also were performed in association with irradiation. This combination demonstrated decreased proliferation and colony formation. Our results suggest that BUB1 and BUBR1 might be interesting targets for future treatment of glioblastoma, nonetheless further studies are necessary to confirm this potencial.

Thesis (M.Sc.). / Written for the Dept. of Microbiology and Immunology. Title from title page of PDF (viewed 2008/05/29). Includes bibliographical references.

Os tumores astrocíticos são originados a partir dos astrócitos e classificados de acordo com a Organização Mundial de Saúde em astrocitoma pilocítico (grau I), astrocitoma subependimal de células gigantes (grau I), xantoastrocitoma pleomórfico (grau II), astrocitoma difuso (grau II), astrocitoma anaplásico (grau III) e glioblastoma (GBM) (grau IV). Este último é o tumor cerebral mais frequente em adultos, possuindo uns dos piores prognósticos, devido principalmente à radioresistência do tumor, com uma sobrevida média de 14 meses. Vários estudos têm procurado encontrar novos alvos terapêuticos e os genes da família BUB são candidatos promissores, devido ao seu papel no controle do ciclo celular. Estes genes participam do mecanismo do ponto de checagem do fuso mitótico, prevenindo a separação prematura das cromátides irmãs. Os objetivos deste trabalho foram avaliar a expressão de BUB1, BUB3 e BUBR1 em amostras de pacientes portadores de gliomas de baixo grau (I e II) e glioblastoma, relacionar as expressões destes genes à sobrevida e estudar os efeitos da inibição dos genes BUB1 e BUBR1, por RNAi, na linhagem pediátrica SF188. Nossos resultados mostraram que tanto BUB1 quanto BUBR1 foram hiperexpressos nos glioblastomas e nos gliomas de baixo grau em relação à substância branca (p<0,05). A análise da expressão destes genes em amostras de glioblastomas em relação a amostras de grau I e II demonstrou uma hiperexpressão dos genes BUB1 e BUBR1 e uma hipoexpressão do BUB3 em glioblastoma (p<0,05). Em relação à sobrevida, os baixos níveis de expressão dos genes BUB1 e BUBR1 foram relacionados a uma melhor sobrevida quando analisado o total de todos os pacientes. Paralelamente, a inibição dos genes BUB1 e BUBR1 na linhagem SF188 resultou em uma diminuição da proliferação e também da capacidade clonogênica, além de um aumento na apoptose quando combinado com temozolomida (TMZ). Também foram realizados experimentos com inibições dos genes com ou sem a presença de irradiação. Esta combinação resultou em uma diminuição tanto da proliferação quanto da capacidade clonogênica. Estes resultados sugerem que o BUB1 e o BUBR1 podem ser considerados alvos interessantes para o tratamento de glioblastoma, porém estudos adicionais são necessários para confirmar tal potencial. / Astrocytic tumors are originated from astrocitytes and classified according to the World Health Organization into pilocytic astrocytoma (grade I), subependymal giant cell astrocytoma (grade I), pleomorphic xanthoastrocytoma (grade II), diffuse astrocytoma (grade II), anaplastic astrocytoma (grade III) and Glioblastoma (GBM) (grade IV). Glioblastoma is the most common brain tumor in adults with a very poor prognosis and a median survival of 14 months. Because their role in cell cycle control, several authors have previously ponited the BUB gene family as new therapeutic target candidates. These genes participate in the mitotic checkpoint by preventing the premature separation of sister chromatids. The aims of this study were to study the expression of BUB1, BUB3 e BUBR1 in samples of patients with low-grade gliomas (I and II) and glioblastoma, evaluate any association of gene expression with patient survival and analyze BUB1 e BUBR1 inhibition (by iRNA) effects, on SF188, a pediatric cell line. BUB1 and BUBR1 were found hyperexpressed in glioblastoma samples and in low-grade gliomas when compared with white matter samples (p<0.05). The analysis of the expression of these genes in glioblastoma samples compared with grade I and II samples showed a hyperexpression of BUB1 and BUBR1, while BUB3 was hipoexpressed in glioblastoma (p<0.05). In the survival analysis, the hipoexpression of BUB1 and BUBR1 genes were related with a better survival when all patients were considered. The BUB1 and BUBR1 inhibition resulted in decreased proliferation and colony formation, along with increased apoptosis when combined with temozolomide. Experiments with the inhibition of genes also were performed in association with irradiation. This combination demonstrated decreased proliferation and colony formation. Our results suggest that BUB1 and BUBR1 might be interesting targets for future treatment of glioblastoma, nonetheless further studies are necessary to confirm this potencial.

As espécies reativas de oxigênio (ERO) e de nitrogênio (ERN) são essenciais na resposta imune dos artrópodes aos microrganismos. Este estudo teve como objetivo a caracterização do estresse oxidativo das células embrionárias BME26 do carrapato R. microplus em resposta à infecção por A. marginale. Mostrou-se que A. marginale invade as células BME26 durante a primeira hora. No perfil de expressão de diversos genes codificadores de proteínas que estão envolvidas na produção e destoxificação de ERO e ERN após desafios com A. marginale e R. rickettsii, foi observado que A. marginale inibiu os transcritos das enzimas oxidantes 72 horas após a infecção. Em contrapartida os genes codificadores das enzimas antioxidantes foram todos induzidos. O perfil de expressão gênica pela infecção por R. rickettsii foi diferente do obtido com A. marginale uma vez que se detectou uma maior indução dos genes oxidantes e repressão dos antioxidantes. O silenciamento de quatro genes antioxidantes por RNAi indicaram o envolvimento da resposta redox no controle da infecção por A. marginale. Com isto se demonstra que o estresse oxidativo é importante no controle da infecção pela bactéria nas células BME26 podendo afetar a capacidade vetorial do carrapato na transmissão desse patógeno. / The production of reactive oxygen species (ROS) and nitrogen (ERN) is essential in the immune response of the arthropods. The aim of this study was the characterization of the oxidative stress of the embryonic cell line BME26 from the cattle tick R. microplus in response to A. marginale infection. It was shown that A. marginale invade BME26 cells during the first 1 hour. The expression profile of sixteen genes encoding proteins involved in either production or detoxification of ROS and RNS in response to A. marginale e R. rickettsii, was shown A. marginale caused a down-regulation of the genes encoding the oxidant enzymes in 72 hours after infection. In contrast the genes encoding the antioxidant were induced. The gene expression pattern in response to R. rickettsii was different from that triggered by A. marginale challenge, with induction of oxidant genes and down-regulation of antioxidant genes. The knockdown of four genes encoding the antioxidant enzymes by RNAi suggests that redox response play a role in the control of infection by A. marginale. Our dataset have shown the importance of the oxidative stress to control A. marginale infection by BME26 cells and might have implications on the vectorial capacity of R. microplus in transmission of this pathogen.

<p>The aim of this thesis was to investigate the cellular role of the mouse RBBP6 gene using the interference RNA (RNAi) gene targeting technology and also to understand the relevance of two promoters for the RBBP6 gene.</p>

<p>The aim of this thesis was to investigate the cellular role of the mouse RBBP6 gene using the interference RNA (RNAi) gene targeting technology and also to understand the relevance of two promoters for the RBBP6 gene.</p>