L'adhérence à la matrice extracellulaire dépendante des intégrines est un processus dynamique et hautement régulé assurant la motilité cellulaire. La protéine ICAP-1alpha interagit avec le domaine cytoplasmique de l'intégrine beta1 et désorganise les adhérences focales in vitro. Comme ICAP-1alpha est absent des adhérences, cette protéine pourrait avoir une action transitoire et finement régulée au niveau de beta1. Dans un premier temps, j'ai pu montrer que ICAP-1alpha ralentit la phase d'assemblage des adhérences en maintenant l'intégrine beta1 en état de faible affinité pour son ligand. De façon surprenante, la régulation négative de l'affinité de l'intégrine beta1 par ICAP-1alpha assure la perception des faibles densités de matrice extracellulaire et l'adaptation de la réponse cellulaire adhésive à cet environnement. ICAP-1alpha agit comme un capteur mécanique qui limite l'assemblage des sites d'adhérence et ralentit la migration et l'étalement des cellules sur des matrices peu denses. Dans un second temps, la voie de signalisation contrôlant l'activité de ICAP-1alpha sur la fonction de l'intégrine beta1 a été caractérisée. ICAP-1alpha possède des sites consensus de phosphorylation dont un reconnu par la protéine kinase dépendante du calcium et de la calmoduline de type II, la CaMKII. Plusieurs évidences révèlent que la CaMKII régule la fonction d'ICAP-1alpha. La phosphorylation d'ICAP-1alpha sur le site reconnu par la CaMKII stimule la liaison de cette protéine sur beta maintient cette intégrine en état de faible affinité pour son ligand et réduit la formation des adhérences focales.

La maladie de Huntington (MH) est une maladie neurodégénérative héréditaire autosomique dominante. Elle résulte d'une expansion anormale de glutamines (polyQ) dans la partie N-terminale de la protéine huntingtine (HTT ; codé par HTT). La MH est caractérisée par la dysfonction et la mort de cellules neuronales dans le cerveau, entraînant l'apparition de symptômes cognitifs, psychiatriques et moteurs, dévastateurs chez les patients. De nombreuses études sur des modèles animaux et cellulaires montrent que l'expansion polyQ dans la protéine mutante conduit à un gain de nouvelles fonctions toxiques, ainsi qu'à la perte de fonctions neuroprotectives de la protéine sauvage. Pendant ma thèse, je me suis intéressée à la description et à la validation fonctionnelle d'un nouvel outil pour étudier la HTT : pARIS-htt. pARIS-htt est un gène synthétique construit pour faciliter le clonage et le marquage de la protéine HTT totale. En utilisant différentes approches cellulaires, nous avons montré que pARIS-htt peut remplacer le rôle de la HTT endogène dans le transport de vésicules du Golgi ainsi que du brain derived neurotrophic factor (BDNF). La version mutante de pARIS-htt ne peut pas restaurer cette fonction. Parallèlement, nous avons généré deux variants de pARIS-htt avec soit une délétion dans la région d'interaction de la HTT avec la dynéine, moteur moléculaire se dirigeant vers l'extrémité négative des microtubules, soit avec la huntingtin associated protein 1 (HAP1), l'un de ses interacteurs. Dans les expériences de remplacement du gène, aucun des deux mutants n'a restauré le transport vésiculaire.Un autre aspect de ma thèse a été d'étudier le rôle de la HTT au cours de la mitose. Nous avons mis en évidence l'importance de la HTT dans le contrôle de l'orientation du fuseau. Cette fonction est perdue lorque la HTT est mutée, mais restaurée lorsque celle-ci est phosphorylée par Akt à la sérine 421. Le contrôle de l'orientation du fuseau est particulièrement important durant la neurogénèse puisque cette orientation ainsi que le mode de division sont impliqués dans la détermination des devenirs cellulaires. Cette fonction de la HTT est conservée chez la D. melanogaster.Cette étude a donc permis de mieux comprendre les fonctions de la HTT, et de proposer de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter la MH.

Le développement des nanotechnologies, tout en promettant des progrès remarquables, notamment dans le domaine biomédical, soulève de nombreuses questions : en particulier quel est comportement de ces nano-objets en milieu biologique ? La silice a une place particulière parmi ces matériaux puisqu'elle est utilisée dans des produits cosmétiques, posant ainsi la question de l'exposition cutanée, et étudiée pour développer des vecteurs de libération intracellulaire. Cette étude a pour but d'apporter des éléments de réponses sur le comportement de différentes nanoparticules de silice en milieu biologique, à travers le suivi des phénomènes suivants : agrégation et dissolution en milieu biologique, internalisation dans des cellules en culture 2D ou 3D, toxicité et devenir intracellulaire des particules. Pour se placer dans le contexte d'une exposition cutanée, l'étude a été menée sur des cellules humaines du derme, en exposition directe ou immobilisées dans un matériau modèle du derme à travers lequel les nanoparticules diffusent. On constate ainsi que la cinétique de dissolution des particules en milieu biologique est fonction de leur taille, l'internalisation est influencée par le diamètre et la composition des particules, les effets toxiques sont liés au nombre de particules plutôt qu'à la concentration massique, et enfin la dissolution intracellulaire peut être modulée par la taille et l'insertion de fonctions disulfures et permettre la libération de molécules encapsulées dans les particules. Il apparaît donc que les caractéristiques des nanoparticules (taille, charge de surface et composition) influencent leur comportement en milieu biologique et en présence de cellules

La protéolyse est une fonction clé de la cellule pour le maintien de l'intégrité du protéome, pour le métabolisme et pour la régulation de nombreux processus physiologiques. Le travail présenté dans cette thèse porte sur une famille de complexes peptidases cytosoliques auto-compartimentés et énergie indépendants découverts chez les Archées, les aminopeptidases TET. Chez l'Archée hyperthermophile Pyrococcus horikoshii, organisme modèle de cette étude, il existe 3 peptidases TET présentant chacune des spécificités de substrats différentes. Les caractérisations structurales des différents membres connus de cette famille de peptidases ont révélé un assemblage dodécamériques creux en forme de tétraèdre d'environ 450 kDa. Des études récentes ont montré l'existence de complexes adoptant la même conformation que les TET dans les 3 domaines du vivant. La première partie du travail présenté a permis d'identifier des marqueurs structuraux caractéristiques de l'assemblage tétraédrique afin de déterminer sans ambiguïté l'appartenance de ces complexes à la famille des TET. La seconde partie de l'étude a conduit à élucider la question de la multiplicité des TET chez les Archées hyperthermophile mise en évidence grâce à une étude phylogénétique initiée pendant la thèse. L'étude en co-expression de PhTET2 et PhTET3 révèle que ces aminopeptidases sont capable de former un hétéro-oligomère présentant une activité enzymatique accrue vis-à-vis des homo-oligomères. La dernière partie du travail porte sur les relations oligomérisation-fonction chez les peptidases TET. L'étude d'un mutant de l'oligomérisation de PhTET2 via une stratégie intégrative alliant biochimie, enzymologie, biophysique (SAXS et AUC) et des études in vivo a permis de mettre en évidence un processus d'assemblage contrôlé permettant d'augmenter l'efficacité de la peptidase. Enfin, la méthode de variation de contraste en diffusion de neutrons aux petits angles (SANS) appliqué à l'étude de l'hétéro-oligomère a permis de révéler une topologie rationalise du complexe hétéro-oligomérique favorisant la formations de poches multi-catalytique. L'ensemble de ce travail contribue à mieux comprendre l'importance et le rôle physiologique des machines TETs dans les cellules. / Proteolysis is a key function in the cell for the maintenance of the proteome integrity, the metabolism and for the regulation of many physiological processes. The thesis work is focused on a family of self-compartmentalized energy-independent cytosolic peptidases discovered in Archaea, the TET aminopeptidases. Three different TET showing contrasted enzymatic specificities co-exist in the cytosol of the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus horikoshii, which is the model organism for this study. The structural characterization of the known members of this family shows that they self-assemble in a unique 450 kDa hollow tetrahedral structure . Recent studies have revealed the existence of peptidases complexes that adopt the same conformation in the three domains of life. The first part of this work allowed identifying structural markers to assign without any ambiguity uncharacterized peptidases to the TET family. The second objective of the work was to understand the multiplicity of TET peptidases in hyperthermophilic archaeon that was highlighted by a phylogenomic study presented in this work . The co-expression of PhTET2 and PhTET3 in E. coli revealed that the two proteins form a hetero-oligomeric complex with enhanced enzymatic activity compared to the homo-oligomers. The last part of the work addressed the question of oligomerization-function relationship in TET particles. A mutagenesis strategy was used to slow down the oligomerization process of PhTET2, and, using an integrative strategy combining biochemistry, enzymology, biophysics (SAXS and AUC) and in vivo studies we were able to dissect the oligomerization pathway of the TET particles and to demonstrate that it is a highly controlled process aim to enhance the activity of the peptidases. Finally, the contrast variation technique in small angle neutron scattering studies (SANS) allowed us to unravel the rational topology of the TET hetero-oligomers that favored the formation of multi-catalytic enzymatic pockets in the complex. All theses studies contributed to specify the biological importance of the TET molecular machines in the cells.

Le striatum dorsal et le noyau accumbens (NAc) jouent un rôle crucial dans la sélection et l’exécution de mouvements résultant de l’intégration de signaux dopaminergiques et d’informations glutamatergiques sensorielles. A ce jour, les mécanismes moléculaires à travers lesquels la dopamine (DA) régule la plasticité des neurones épineux moyens du striatum (MSNs) sont peu connus. La synthèse des protéines est un événement essentiel requis pour la plasticité synaptique et la mémoire à long terme. Dans de nombreuses régions cérébrales, l’initiation, étant l'étape limitante de la synthèse protéique, est contrôlée par la phosphorylation de facteurs d’initiation de la traduction (eIFs). Notre hypothèse est que la DA pourrait réguler la traduction d’ARNm dans le striatum à travers des mécanismes moléculaires similaires. La première partie de cette thèse visait à étudier le rôle de la DA dans la régulation de la machinerie de traduction dans les MSNs. Pour ce faire, nous avons analysé au niveau du striatum, la phosphorylation de différents eIFs en réponse à l’administration aigue ou répétée de d-amphetamine (d-amph), entraînant une augmentation transitoire ou de longue durée de la transmission dopaminergique, respectivement. Bien que l’administration de la d-amph est associée à une légère augmentation de pS209-eIF4E, l’état de phosphorylation de S1108-eIF4G reste inchangé. En revanche, une forte augmentation de p51-eIF2α a été observée après administration répétée d-amph. Nous démontrons que la phosphorylation de 51-eIF2α est corrélée à une diminution transitoire de la synthèse protéique globale dans le striatum. En outre, la d-amph induit également une importante augmentation de la phosphorylation de la protéine ribosomale S6 (rpS6). Cet effet se produit spécifiquement dans MSNs exprimant le récepteur D1 à la DA et implique la cascade de signalisation AMPc/PKA/DARPP-32, tout en étant indépendant des voies mTORC1/S6K et ERK. La phosphorylation de rpS6 est couramment utilisée pour marquer de l'activité neuronale bien que son rôle biologique dans le cerveau reste énigmatique. Compte tenu sa régulation significative par la DA, la deuxième partie de cette thèse a eu pour but d’acquérir de nouvelles connaissances sur la fonction de la phosphorylation de rpS6 en utilisant un modèle de souris rpS6 déficient de ses sites de phosphorylations, rpS6P-/-. Dans ces souris transgéniques la synthèse protéique globale est normale dans diverses régions du cerveau. Néanmoins, les souris rpS6P -/- présentent une altération de la traduction d'un sous-ensemble de ARNm, ceci sélectivement dans le NAc, suggérant le rôle potentiel de la phosphorylation de rpS6 dans la régulation de la traduction de transcrits bien spécifiques au sein de cette sous-région du striatum. Dans l'ensemble, les résultats présentés dans cette thèse permettent une meilleure compréhension des mécanismes engagés par DA pour contrôler la traduction d’ ARNm dans les MSNs du striatum. / The dorsal striatum and the nucleus accumbens (NAc) process dopamine (DA) signals in order to generate appropriate behavior in response to given glutamatergic sensory cues. The molecular mechanisms through which DA promotes long-lasting changes in striatal GABAergic medium-sized spiny neurons (MSNs) are still not fully understood. It is widely accepted that protein synthesis is an essential event required for several forms of synaptic plasticity and long-term memory. In various brain areas, initiation is the rate-limiting step of translation and is regulated through phosphorylation of translation initiation factors (eIFs). Whether DA could regulate mRNA translation in the striatum through similar mechanisms is yet poorly investigated. A first part of this thesis aimed to shed light on the role of DA in the regulation of the translational machinery in MSNs. Here, we measured the phosphorylation state of eIFs following single and repeated in vivo d-amphetamine (d-amph) administration, resulting in a transient or long-lasting increase of the dopaminergic transmission, respectively. Although d-amph exposure slightly enhances the striatal pS209-eIF4E, pS1108-eIF4G remains unchanged. In contrast, a strong increase in p51-eIF2α is observed after repeated d-amph administration. We demonstrate that d-amph-induced p51-eIF2α is associated to a transient decrease in generall striatal protein synthesis. In addition, d-amph markedly increases the striatal phosphorylation of the 40S ribosomal protein S6 (rpS6). This effect occurs selectively in D1 DA receptor (D1R)-expressing MSNs and requires the cAMP/PKA/DARPP-32 cascade but is independent of mTORC1/S6K and ERK signaling. rpS6 phosphorylation is commonly used as a marker for neuronal activity even though its biological role in the brain remains puzzling. Given the significant regulation of striatal rpS6 phosphorylation by DA, the second part of this thesis sought to gain new insights into the function of this post-translational event by using a phosphodeficient rpS6P-/- mouse model. We showed that rpS6P-/- mice display unaltered global protein synthesis in different brain regions. Nonetheless, rpS6P-/- mice exhibit impaired translation of a subset of mRNA selectively in the NAc, pointing to the potential role of rpS6 phosphorylation in the regulation of transcript-specific translation within this striatal sub-region. Overall, the results presented in this thesis provide a better understanding of the mechanisms engaged by DA to control mRNA translation in striatal MSNs.

Les microtubules (MTs) sont importants pour des processus cellulaires majeurs comme la polarisation, le trafic membranaire, la division cellulaire ainsi que pour l'architecture intracellulaire. En retour, les organites influencent l'organisation et la dynamique des MTs. Mon projet de thèse vise à élucider les interactions fonctionnelles existantes entre les MTs et la sécrétion en adoptant une approche quantitative et systématique. En synchronisant le trafic de différents cargos grâce au système RUSH (Retention Using Selective Hooks) et à une dépolymérisation complète des MTs, nous avons montré que les MTs ne sont pas strictement nécessaires à la sécrétion des cargos. D'une manière générale nous avons observé que le trafic intracellulaire est ralenti mais toujours possible en présence d'un appareil de Golgi dispersé. Nous avons caractérisé deux populations d'éléments golgiens. Elles sont présentes peu après la dépolymérisation des MTs et sont différentes en terme de composition et de capacité de sécrétion. Nos résultats montrent qu'une maturation fonctionnelle des éléments golgiens est nécessaire pour le trafic post-golgien, basée sur l'acquisition de certains facteurs golgiens non identifiés à ce jour. Dans une deuxième partie, nous nous sommes intéressés à l'exocytose au niveau de la membrane plasmique. Nous avons observé une sécrétion préférentielle des protéines à proximité des adhésions focales. Différentes techniques de biologie cellulaire nous ont permis de caractériser cet adressage préférentiel vers les sites d'adhésion de la cellule. Nous avons également corrélé les forces exercées par la cellule sur le substrat avec la direction du transport antérograde. / Microtubules (MTs) are important for major cellular processes like cell polarization, intracellular trafficking, cell division, intracellular architecture. Organelles influence back the MTs organization and dynamics. The goal of my project was to study the involvement of MTs in the intracellular trafficking. Thanks to the Retention Using Selective Hooks (RUSH) system to synchronize the trafficking of cargos and with an efficient way to depolymerize MTs, we showed that MTs were not strictly essential to secretion of cargos. More generally, we showed that intracellular trafficking is slowed down but still possible in the presence of a dispersed Golgi apparatus. Moreover, we characterized two populations of Golgi elements in cells without MTs that are different in terms of secretion ability and composition. Our results demonstrated that functional maturation of Golgi elements is needed to ensure post-Golgi trafficking and that MTs driven post-Golgi transport is not strictly required. Besides working on intracellular trafficking without MTs, we conducted a study on the exocytosis at the plasma membrane. By using an antibody coating on coverslips to immobilize secreted cargos, we visualized the first step of arrival at the plasma membrane. We observed a directed and polarized secretion close to focal adhesions that we characterized by different cell biology technics and microscopy (spinning disk, TIRF…). We highlighted a close relationship between forces exerted by the cell on its substrate and the directionality of the anterograde transport by using patterning and Traction Force Microscopy (TFM).

Le potentiel d'action est un des événements de signalisation majeurs du cerveau. Ce travail est dédié à l'étude de la génération du potentiel d'action, et son impact dans le potentiel extracellulaire ainsi que dans le réseau local. Pour ce faire nous avons abordé trois questions principales. Premièrement, nous nous sommes intéressés à comprendre pourquoi les potentiels d'action ont souvent un début brutal dans les enregistrements somatiques des neurones de mammifères. Nous avons montré que l'hypothèse du couplage résistive critique explique comment le potentiel d'action est initié dans le segment initial de l'axone pour fournir le 'kink' dans le soma. Deuxièmement, nous avons évalué l'impact de la position du segment initial sur le potentiel extracellulaire. De façon importante, nous démontrons que l’impact de la position du segment initial axonal dans la forme et l’amplitude du potentiel d’action dépend de la distance entre le site d’enregistrement et l’axone, et de sa position par rapport à l’axe soma-segment initial axonal.Finalement, nous avons exploré l’impact d’un seul potentiel d’action dans l’activité de réseau, car cet effet est souvent questionné. Nos montrons qu’un seul potentiel d’action d’un neurone pyramidal hippocampique peut commencer l’activité «sharp-wave ripple” qui consiste en l’activation de multiple interneurones. L’ensemble de nos résultats montre que les potentiels d’action sont des événements complexes modelés par la biochimie de le membrane neuronale et la morphologie de l’axone. De plus, ces caractéristiques neuronales modulent fortement leur impact dans le champ extracellulaire et l’activité de réseau. / The action potential is considered one of the major signaling events in the brain.Although it has been studied for years, many questions remain unanswered. The present work is dedicated to the study of action potential generation, its impact on extracellular field and local network establishment. We considered three questions: Firstly, (i) we asked why mammalian neurons often have characteristically sharp onset in the somatic recordings of action potentials. We show that the Critical Resistive Coupling Hypothesis is sufficient to explain how the action potential is initiated in the axon initial segment to provide for the ‘kink’ in the soma, while the Back propagation Hypothesis is not sufficient to explain it. Next, (ii)we asked how the placement of the axon initial segment might affect the extracellular field. We show that the impact of the axon initial segment position on the shape and amplitude ofextracellular action potential depends on the distance between the recording site andthe axon and on its position along the soma–axon initial segment axis. Finally, (iii)we inquired if a single action potential might have an effect on the network activity. Weshow that a single action potential from a single pyramidal neuron in the hippocampus can trigger sharp-wave ripple activity consisting of the firing of multiple interneurons.Altogether, our results show that action potentials are complex events shaped by the biochemistry of the neuronal membrane and morphology of the axon. In addition these features strongly modulate the neuron’s impact on the extracellular field and network activity.

Les champs électromagnétiques sont couramment utilisés pour stimuler de manière non-invasive le cerveau humain soit à des fins thérapeutiques ou dans un contexte de recherche. Les effets de la stimulation magnétique varient en fonction de la fréquence et de l'intensité du champ magnétique. Les mécanismes mis en jeu restent inconnus, d'autant plus lors de stimulations à faible intensité. Dans cette thèse, nous avons évalué les effets de stimulations magnétiques répétées à différentes fréquences appliqués à faible intensité (10-13 mT ; Low Intensity Repetitive Magnetic Stimulation : LI-rMS) in vitro, sur des cultures corticales primaires et sur des modèles de réparation neuronale. De plus, nous décrivons une méthodologie pour la construction d'un dispositif instrumental fait sur mesure pour stimuler des cultures cellulaires.Les résultats montrent des effets dépendant de la fréquence sur la libération du calcium des stocks intracellulaires, sur la mort cellulaire, sur la croissance des neurites, sur la réparation neuronale, sur l'activation des neurones et sur l'expression de gènes impliqués. En conclusion, nous avons montré pour la première fois un nouveau mécanisme d'activation cellulaire par les champs magnétiques à faible intensité. Cette activation se fait en l'absence d'induction de potentiels d'action. Les résultats soulignent l'importance biologique de la LI-rMS par elle-même mais aussi en association avec les effets de la rTMS à haute intensité. Une meilleure compréhension des effets fondamentaux de la LI-rMS sur les tissus biologiques est nécessaire afin de mettre au point des applications thérapeutiques efficaces pour le traitement des conditions neurologiques. / Electromagnetic fields are widely used to non-invasively stimulate the human brain in clinical treatment and research. This thesis investigates the effects of different low intensity (mT) repetitive magnetic stimulation (LI-rMS) parameters on single neurons and neural networks and describes key aspects of custom tailored LI-rMS delivery in vitro. Our results show stimulation specific effects of LI-rMS on cell survival, neuronal morphology, neural circuit repair and gene expression. We show novel mechanisms underlying cellular responses to stimulation below neuronal firing threshold, extending our understanding of the fundamental effects of LI-rMS on biological tissue which is essential to better tailor therapeutic applications.

Notre objectif est d’évaluer la sérologie, la biologie moléculaire et la culture pour le diagnostic des infections liées aux bactéries intracellulaires.La sérologie occupe une place importante dans le dépistage, le suivi et le monitoring des patients présentant une infection cardiovasculaire à C. burnetii ou Bartonella. Cependant, nous avons montré quelques limites aux seuils précédemment établis pour le diagnostic d’endocardite. Ce travail suggère que les faibles titres d’anticorps n'excluent pas le diagnostic de l'infection cardiovasculaire chez les patients ayant des facteurs prédisposant et qu'une valeur de seuil sérologique ne peut fournir une VPP de 100%.La qPCR réalisée sur des prélèvements cardiovasculaires pour le diagnostic d’endocardite à C. burnetii et Bartonella est plus sensible que la culture et l’immunohistochimie. Toutefois, des qPCR négatives ont été obtenues chez des patients présentant une endocardite avec de fort titre d’anticorps, par conséquent une qPCR négative ne doit pas définitivement exclure le diagnostic. Nous avons montré que l’ADN est capable de persister dans les prélèvements, malgré un traitement antibiotique préalable. Nous avons alors développé un nouvel outil pour évaluer la viabilité bactérienne en quantifiant la transcription de l'ARNr 16S de C. burnetii.La culture des bactéries intracellulaires reste nécessaire pour permettre la caractérisation des bactéries et faciliter le développement d'outils diagnostiques. Au cours de cette thèse, nous avons mis au point une technique innovante de plage de lyse pour mettre en évidence un effet délétère des antibiotiques sur les cellules infectées par R. conorii. / The aim of our study is to evaluate serology, molecular biology and culture for the diagnosis of intracellular bacteria.Serology plays an important role in the detection of Q fever and Bartonella infections and for the follow up and monitoring of patients with cardiovascular infection. However, we have shown some limits to the use of serological thresholds previously established for the diagnosis of endocarditis. In 2 series of Q fever and Bartonella endocarditis, we diagnosed patients with a definite cardiovascular infection associated with low antibody levels (<800). This work suggests that low antibody titers do not exclude the diagnosis of cardiovascular infection in patients with predisposing factors and a value of serological threshold cannot provide a positive predictive value of 100%.qPCR performed on cardiovascular samples for the diagnosis of C. burnetii and Bartonella endocarditis is more sensitive than the amplification of the 16S rRNA gene, culture and immunohistochemistry. Nevertheless, negative qPCR were obtained for patients presenting endocarditis with high antibody titer, therefore a negative qPCR should not definitively exclude the diagnosis. On the other hand, we have shown that DNA can persist in clinical specimens, despite previous antibiotic treatment. We developed a new tool to assess bacterial viability by quantifying the transcription of the 16S rRNA of C. burnetii.Culture of intracellular bacteria is necessary to enable the characterization of bacteria and facilitate the development of diagnostic tools. We developed an innovative technique of plaque assay to highlight a deleterious effect of antibiotics on infected cells by R. conorii.