Les apicomplexes sont des organismes intracellulaires intervenant dans de nombreuses pathologies humaines. Parmi celles-ci le fléau du paludisme continue de tuer plus de 600000 personnes chaque année. Malgré tous les efforts déployés par les autorités de santé, le parasite du paludisme a développé de nombreuses résistances à tous les antipaludiques. Les alternatives aux traitements actuels sont donc très attendues. Le développement efficace de nouvelles molécules doit passer par la compréhension complète des mécanismes d’action des molécules actuelles et par la connaissance des mécanismes de résistance développés par le parasite. Dans ce travail de thèse, nous nous sommes intéressés à la compréhension du mécanisme d’action de la Ferroquine, un candidat médicament en développement par la Sanofi. Nous avons étudié l’impact de sa structure originale et de ses propriétés physico-chimiques sur son activité antipaludique. D’autre part, des études d’imagerie ont permis d’étudier l’accumulation et la localisation de cette molécule. Dans une seconde partie, nous nous sommes intéressés au développement d’analogues de la ciprofloxacine. Dans des études antérieures de pharmacomodulation ont montré que la transformation de la ciprofloxacine en prodrogue et l’insertion d’un ferrocène dans sa structure permettent une augmentation de l’activité. Ces travaux de thèse ont permis d’étudier l’influence du ferrocène sur l’activité de ces molécules. Des études d’imagerie ont également été mises en oeuvre sur cette famille de composés. / Apicomplexa parasites are intracellular organisms involved in many human diseases. Among them the scourge of malaria continues to kill over 600,000 people each year. Despite all efforts of health authorities, the malaria parasite has developed resistance to all antimalarial drugs and alternatives to current treatments are eagerly awaited. The development of effective new drugs must go through a complete understanding of molecular mechanisms of action of current drug and knowledge of resistance mechanisms developed by the parasite. In this thesis, we were interested in understanding the mechanism of action of Ferroquine, a drug candidate in development by Sanofi. We studied the impact of its original structure and its physico-chemical properties on its antimalarial activity. On the other hand, imaging studies have investigated the accumulation and localization of this molecule. In the second part, we were interested in developing analogues of ciprofloxacin. Previous pharmacomodulation studies showed that the transformation of ciprofloxacin into a prodrug and the insertion of a ferrocene into its structure allow an increase in activity. This thesis has investigated the influence of ferrocene on the activity of these molecules. Imaging studies were also carried out on this family of compounds.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L'expression intracellulaire des anticorps (intracorps) est une approche qui permet l'étude et le ciblage des antigènes dans les compartiments intracellulaires. Néanmoins, l'expression d'anticorps entiers fonctionnels dans les cellules reste une tâche difficile en raison de leur grande taille et de leur structure, l'environnement réducteur du milieu intracellulaire étant défavorable à la formation des ponts disulfure. Notre groupe a une forte expertise dans le domaine de l'immunisation intracellulaire et son application pour l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques. Pour cela, notre équipe a élaboré des banques de fragments d'anticorps scFv optimisés pour une meilleure expression intracellulaire. Nos travaux antérieurs ont démontré que ces intracorps peuvent cibler spécifiquement des domaines ou des modifications post-traductionnelles de protéines dans des cellules vivantes. Ceci est particulièrement important car il démontre l'un des avantages principaux des intracorps par rapport à l'approche basée sur l'ARNi. Cet avantage a été démontré par un criblage phénotypique dans un modèle d'allergie. En appliquant cette approche à l'étude de l'activation des mastocytes, nous avons pu identifier un nouvel acteur moléculaire impliqué dans la voie de signalisation mise en jeu. Ce travail a été protégé par un brevet européen en 2013 et est publié récemment. Dans le cadre de mon projet de thèse, j'ai construit une nouvelle banque synthétique (HUSCIv) optimisée pour la stabilité, la diversité et l'affinité des scFvs. Pour cela, le scFv 13R4 isolé dans notre équipe a servi de charpente pour le greffage des différentes boucles hypervariables, tout en respectant la diversité des régions CDR observée dans les anticorps naturels humains. Nous avons utilisé la protéine GFP en tant que rapporteur pour étudier le repliement et la solubilité des intracorps. Nos résultats ont clairement démontré que la plupart des intracorps issus de la banque HUSCIv sont soluble dans le cytoplasme des cellules mammifères. Mon projet de thèse décrit ici rapporte l'utilisation de la banque HUSCIv pour un criblage phénotypique dans des cellules de cancer colorectal portant une mutation du gène K-RAS et résistantes au traitement par l'anticorps chimérique Cetuximab. Le projet cherche à sélectionner des scFv capables de restaurer la sensibilité au Cetuximab, avec comme objectif l'identification des cibles intracellulaires impliquées.Pour ce criblage fonctionnel, la banque HUSCIv a été exprimée dans les cellules HCT116 par l'intermédiaire d'un système d'expression rétroviral. Le processus de sélection est basé sur la sélection directe de la prolifération des cellules en utilisant un colorant fluorescent (CMRA). Les cellules dont la prolifération est bloquée sont isolées et un séquençage à haut débit permet de suivre l'évolution des populations de scFv tout au long de l'expérience. Ainsi, ce projet a nécessité un séquençage profond d'un grand nombre de scFv afin de réaliser une analyse statistique. Nous avons réalisé à ce jour deux tours de sélection. Les tests de cytotoxicité réalisés sur les populations sélectionnées ont montré une inhibition significative de la prolifération en présence du Cetuximab d'environ 10%. Ces résultats indiquent l'évolution du phénotype qui tend vers une sélection de scFv inhibiteurs et suggèrent que nous devons réaliser au moins un ou plusieurs tours plus sélectifs avant de formuler des conclusions.L'approche introduite ici est différente de toutes les études existantes en ce qu'elle utilise des banques « naïves », et permet non seulement de répondre à la diversité du protéome, mais aussi d'étudier les messagers secondaires et le métabolisme des cellules. En tant que tel, et par rapport à d'autres approches à grande échelle, celle-ci représente une voie simple pour la découverte de molécules thérapeutiques potentielles. / Intracellular expression of antibodies (intrabodies) permitted the study and targeting of antigens in cellular compartments. However, the expression of functional intrabodies remains a difficult task due to their large size, structure, and the reducing intracellular environment. Our group has a strong expertise in the field of intracellular immunization and the identification of new therapeutic targets. For this purpose, we have developed an scFv library optimized for intracellular expression of scFv antibody fragments. Our previous works have shown the successful use of intrabodies for targeting specific domains or post-translational modifications in living cells. This is particularly important because it demonstrates one of the main advantages of intrabodies compared to the approaches using RNAi. This benefit was demonstrated by a phenotypic screen in a model of allergy. Applying this approach to the study of mast cell activation, we identified a new molecular player involved in the signaling pathway implemented. This work was protected by a European patent in 2013 and was recently published. As part of my thesis project, I designed a new synthetic library (HUSCIv) optimized for scFv stability, diversity and affinity. For this, a highly soluble and hyper-stable framework, scFv13R4 isolated in our group, was used as a scaffold for grafting different hypervariable loops, while respecting the diversity of CDRs observed in human natural antibodies. We used protein GFP as a reporter to study the folding and solubility of intrabodies. Our findings clearly demonstrated that most of the intrabodies from HUSCIv library are soluble in the cytoplasm of mammalian cells. My thesis project described here reports the use of HUSCIv in a phenotypic screen of colorectal cancer cells carrying a mutation in the K-RAS gene and resistant to the treatment with the chimeric antibody Cetuximab. The project seeks to select scFv fragments able to restore the sensitivity to Cetuximab, with the objective to identify the intracellular targets involved. For this functional screen, the HUSCIv library was expressed in HCT116 cells via a retroviral expression system. The selection process is based on the direct selection of cell proliferation using a fluorescent dye (CMRA). The cells whose proliferation is blocked are isolated and the evolution of scFv populations throughout the experiment are tracked via high-throughput sequencing. This sequencing requires a large number of scFvs to perform a statistical analysis. So far, we have achieved two rounds of selection. The cytotoxicity tests carried out on the selected populations showed a significant inhibition of proliferation (10%) in the presence of Cetuximab. These results indicate that the evolving phenotypes are tending towards a selection of scFv inhibitors and suggest that we need to perform at least one or more selective rounds before making conclusions. The approach introduced here is different from all existing studies in that it uses "naive" libraries not only to respond to the diversity of the proteome, but also to study secondary messengers and metabolism in cells. As such, and in comparison to other large-scale approaches, it is a simple way for the discovery of potential therapeutic molecules.

Une partie de ce travail de thèse a consisté à appliquer les méthodes de FISH pour l’étude de trois bactéries pathogènes intracellulaires. La viabilité de Bartonella henselae a été évaluée à partir de ganglions de patients atteints de la maladie des griffes du chat (CSD). Le faible taux d’ARN détecté par biologie moléculaire, la stérilité des cultures, l'absence de détection par analyses histologiques et FISH confirment que B. henselae n'est pas ou rarement viable dans les ganglions de patients atteints de CSD. Tropheryma whipplei, l’agent de la maladie de Whipple, a été identifié et localisé par FISH, dans les macrophages d’un ganglion et d’une biopsie pulmonaire, confirmant le diagnostic infectieux. Deux méthodes de FISH ont été testées pour détecter Coxiella burnetii dans des cas d’endocardites et d’infections vasculaires en utilisant des sondes oligonucléotidiques et des sondes PNA. Les résultats ont confirmé une meilleure efficacité des sondes PNA et démontré que les techniques de FISH sont plus sensibles que l’immunohistochimie pour le diagnostic des endocardites et des infections vasculaires à C. burnetii. Nous avons également évalué les stratégies moléculaires mises en place pour le diagnostic syndromique. Bien que la PCR conventionnelle à large spectre permette l'identification de micro-organismes fastidieux et anaérobies, la PCR spécifique en temps réel révèle une supériorité significative dans le diagnostic syndromique. En conclusion, ce travail a permis de démontrer l’efficacité et l’applicabilité de la FISH pour la détection bactérienne. Cette méthode peut être utilisée comme un outil complémentaire afin d'améliorer le diagnostic de microbiologie clinique. / We applied FISH methods to the study of three intracellular pathogenic bacteria. The viability of Bartonella henselae was evaluated in a large series of lymph nodes from patients with cat scratch disease (CSD). The results obtained, associated with sterile cultures and negative histological analyzes and FISH, as well as the low level of RNA detected by molecular biology, provide evidence that B. henselae are not or are rarely viable in the lymph nodes of patients with CSD. Tropheryma whipplei has been identified by FISH in macrophages from one lymph node and for the first time in a pulmonary biopsy, confirming the diagnosis of infection. Two methods of FISH have been tested to detect Coxiella burnetii in cases of endocarditis and vascular infections using oligonucleotide and PNA probes. The results attested to the greater efficiency of PNA probes, and demonstrated that FISH were applicable for the diagnosis of C. burnetii endocarditis. We also evaluated the molecular strategies used for syndrome-driven diagnosis of infectious diseases. Although conventional broad-spectrum PCR allows for the identification of fastidious and anaerobic microorganisms, real-time specific PCR reveals a significant superiority in syndrome-driven diagnosis. The addition of specific PCRs in real time PCR would improve our molecular strategies, for example, in the case of the detection of Staphylococcus aureus for the diagnosis of lymphadenopathy. In conclusion, this work demonstrates the effectiveness and applicability of FISH for the identification of intracellular bacteria. This method can be used as an important complementary tool to the improvement of clinical microbiological diagnosis.

AU COURS DE LA THESE, L'ETUDE DU TRANSCRIPTOME DE SOUCHES GARDEL ET SENEGAL VIRULENTES ET ATTENUEES D'E. RUMINANTIUMA ETE REALISEE. UNE ANALYSE DU TRANSCRIPTOME A DIFFERENTS STADES DE DEVELOPPEMENT, A D'ABORD ETE EFFECTUEE POUR LA SOUCHE GARDEL VIRULENTE. AU STADE CORPS RETICULE (FORME INTRACELLULAIRE NON INFECTIEUSE), UNE SUREXPRESSION DES GENES CODANT POUR DES PROTEINES IMPLIQUEES DANS LE METABOLISME, LE TRANSPORT ET L'ECHANGE DE NUTRIMENTS ET DANS LA RESISTANCE AU STRESS OXYDATIF ETAIT OBSERVEE. IL SEMBLERAIT QUEE. RUMINANTIUMMETTE EN PLACE UN PANEL DE MECANISMES POUR SA SURVIE ET SON DEVELOPPEMENT A L'INTERIEUR DE LA CELLULE HOTE. AU STADE CORPS ELEMENTAIRE (FORME EXTRACELLULAlRE INFECTIEUSE), LE GENE DKSA CODANT POUR UN FACTEUR DE TRANSCRIPTION ETAIT SUREXPRIME. CE GENE A ETE MONTRE COMME ETANT IMPLIQUE DANS LA REGULATION DE FACTEURS DE VIRULENCE. IL SEMBLERAIT . DONC, QU'AU STADE CORPS ELEMENTAIRE, IL Y AIT UNE INDUCTION DE MECANISMES DE VIRULENCE. LA COMPARAISON DE L'EXPRESSION DES GENES AU STADE CORPS ELEMENTAIRE ENTRE SOUCHES VIRULENTES ET ATTENUEES A AUSSI ETE EFFECTUEE. NOS RESULTATS ONT MONTRE UNE MODIFICATION IMPORTANTE DE LA MEMBRANE POUR LES SOUCHES VIRULENTES ET ATTENUEES. POUR LES SOUCHES ATTENUEES, IL A ETE MONTRE UNE SUREXPRESSION DES GENES IMPLIQUES DANS LA BIOGENESE MEMBRANAlRE ET UNE SOUS-EXPRESSION·DES PROTEINES DE LA FAMILLE MULTIGENIQUE MAP. CES RESULTATS SUGGERENT QUE LES PROTEINES MAP JOUENT UN ROLE DE LEURRE VIS-A-VIS DE LA REPONSE IMMUNITAIRE PROTECTRICE. DES PROTEINES MEMBRANAlRES HYPOTHETIQUES SONT SUREXPRIMEES A LA FOIS CHEZ LES SOUCHES VIRULENTES ET ATTENUEES. CERTAINES D'ENTRE ELLES SUREXPRIMEES CHEZ LES SOUCHES ATTENUEES SEMBLENT ETRE DE BONS CANDIDATS VACCINAUX ET DEVRAIENT ETRE ETUDIEES / Transcriptomic study of gardel and senegal both virulent and attenuated e. ruminantium strains was conducted during my phd. an analysis of transcriptome at different stages of development has been first conducted for virulent gardel strain. at reticulate body stage (intracellular form non-infectious), over-expression of genes coding for proteins involved in metabolism, transport and exchange of nutrients and resistance to oxidative stress was observed. at this stage of development, e. ruminantium seems to activate mechanisms for its survival and development within the host cell. at elementary body stage, dksa the gene encoding for a transcription factor was over-expressed. this gene has been shown to be involved in the regulation of virulence factors. it seems, therefore, at the elementary body stage, e. ruminantium induces its virulence factors. secondly, we compare the transcriptome of elementary body between virulent and attenuated strains. our results showed an important membrane modification of attenuated and virulent strains. for attenuated strains, we observed an over-expression of genes involved in membrane biogenesis and a diminution of expression of map multigenic family. it seems that map proteins subvert the protective immune response. hypothetical membrane proteins are over-expressed in both virulent and attenuated strains. some over-expressed proteins in attenuated strains seem to be good vaccine candidates and willstudied.

La microsporidie, Encephalitozoon cuniculi, parasite intracellulaire, est un pathogène opportuniste. Des reconstructions tridimensionnelles à partir de coupes sériées ont permis de visualiser les différents stades cellulaires au cours de la sporogenèse. L'immunolocalisation de protéines pariétales couplée à l'hybridation in situ des ARNm correspondants ont révélé leur expression différentielle durant le développement intracellulaire. L'étude sur la glycosylation des protéines a permis de démontrer l'absence de N-glycosylation et l'existence d'une voie de O-mannosylation. Semblables à celles des champignons, les chaînes sont linéaires d'une longueur maximale de 8 mannoses liés en alpha1,2 et les mannoprotéines sont localisées dans le capuchon polaire. Des protéines fucosylées sont présentes dans la paroi sporale. La mise au point d'un protocole de séparation des stades sporogoniques en gradient de densité, offre des perspectives d'analyses biochimiques comparatives

La surexpression de pompes d'efflux par les cellules cancéreuses permet l'élimination d'agents cytotoxiques, induisant alors une résistance à la chimiothérapie. Trois transporteurs ABC sont principalement impliqués dans cette résistance : ABCB1 (aussi appelé P-gp), ABCC1 (ou MRP1) et ABCG2 (ou BCRP, MXR, ABCP). Du fait de leur implication dans le phénotype de " MultiDrug Resistance ", il est essentiel de mieux comprendre le fonctionnement de ces transporteurs. Une étude par mutagenèse dirigée a montré que les boucles intracellulaires, ICL0 et ICL1 sont impliquées dans le transport des substrats. Deux résidus sont particulièrement intéressants : W379 qui agirait comme un filtre des substrats ; et H457 qui participerait à la reconnaissance ou à la fixation des substrats. Par ailleurs, il est important de moduler cette chimiorésistance. Dans ce contexte nous avons développé une nouvelle classe d'inhibiteurs d'ABCB1 et ABCG2 non compétitifs basés sur un motif dipeptidique. Les composés les plus efficaces, CT1347 pour ABCB1 et CT1364 pour ABCG2, s'avèrent, d'une part peu ou pas cytotoxiques à fortes concentrations, abolissent d'autre part la résistance induite par ABCB1 ou ABCG2 et se comportent comme des inhibiteurs non compétitifs du Hoechst 33342 et de la daunorubicine. De plus, CT1364 inhibe l'activité ATPasique d'ABCG2 et induit une diminution rapide de l'expression de la protéine. Enfin, les 1ers tests in vivo de ce composé montrent que l'association avec l'irinotécan ralentit la croissance des xénogreffes de petite taille chez des souris

La spondylarthrite ankylosante (SA), la forme la plus commune des spondylarthrites (SpA), est fortement associée à la molécule du CMH de classe I HLA-B27 mais le rôle de cet antigène d'histocompatibilité dans le développement de ces pathologies reste encore inexpliqué. L’étude des rats transgéniques HLA-B27, développant une pathologie inflammatoire spontanée ressemblant aux SpA, a permis de confirmer l’implication directe du HLA-B27 et de corréler l’apparition des symptômes avec une forte expression de cette molécule. De plus, il a été montré que l’HLA-B27 présentait une propension particulière au mauvais repliement et à la formation d’oligomères de chaînes lourdes. L’objectif de mon travail de thèse était de déterminer si le trafic et/ou la formation d’oligomères du HLA-B27 étaient corrélés à sa surexpression. Pour cela, notre équipe a développé des protéines de fusion (HLA-BYFP et HLA-BRLuc) ainsi que la technique BRET afin d’étudier les interactions HLA-B/HLA-B. Au moyen de ce système expérimental, nous avons montré la formation de vésicules intracellulaires riches en protéines HLA-B mal repliées lorsqu’elles étaient fortement exprimées, qu'il s'agisse d'allèles associés à la SA (HLA-B*2702, -05, et -07) ou non (HLA-B*2706, et -09, HLA-B*0702). Cependant, ce phénomène était significativement plus prononcé pour les sous-types associés à la SA. Dans les conditions de forte expression, nous avons également observé que les sous-types associés à la SA formaient des oligomères qui se comportent différemment de ceux formés par la protéine HLA-B7. Ce phénomène ne semble pas être dû au déclenchement de la réponse cellulaire « Unfolded Protein Response » (UPR) et n’est pas abrogé par l’inhibition du protéasome. / Ankylosing spondylitis (AS), the most common form of spondyloarthritis (SpA), is strongly associated with the MHC class I HLA-B27 molecule. Although this association has been largely studied, mechanisms of pathology remain unclear. Development of a spontaneous inflammatory disease resembling human SpA in HLA-B27 transgenic rats confirmed the direct involvement of HLA-B27 and allowed to associate disease development with high expression levels of this molecule. Moreover, the HLA-B27 protein has an enhanced propensity to misfold and form aberrant disulfide linked heavy chain oligomers in the endoplasmic reticulum and at the cell surface. The goal of my thesis work was to determine if the HLA-B27 traffic and/or its ability to form oligomers are involved in this requirement of overexpression. For that, our team has developed fusion proteins ((HLA-BYFP and HLA-BRLuc) and the BRET technique to study, in vitro, the HLA-B/HLA-B interactions. Using this experimental system, we have shown the formation of intracellular vesicles, in which misfolded/unfolded HLA-B proteins accumulated when they were highly expressed, for both AS-associated alleles (HLA-B*2702, -05, et -07) or not (HLA-B*2706, et -09, HLA-B*0702). This phenomenon is strongly pronounced for AS-associated subtypes. For high-level expression, we also observed that the AS-associated subtypes form oligomers that behave differently from those formed by the HLA-B7 control protein. This phenomenon doesn’t appear to be due to unfolded protein response (UPR) triggering and is not abrogated by proteasome inhibition.

Les bactéries appartenant au complexe Burkholderia cepacia (Bcc) sont des pathogènes opportunistes intracellulaires qui causent des infections pulmonaires chez les patients atteints de mucoviscidose, aggravant leur pronostic clinique. Ces infections pulmonaires sont caractérisées par des périodes chroniques avec des exacerbations intermittentes détériorant la fonction pulmonaire, et pouvant causer des nécroses broncho-pulmonaires et septicémies fatales reconnues sous le nom du “Syndrome Cepacia”. Ces bactéries intrinsèquement multi-résistantes aux antibiotiques sont aussi responsables de sérieuses infections émergentes dans des contextes hors mucoviscidose, à la fois dans des conditions intra et extra-hospitalières. Burkholderia cenocepacia, l’une des espèces les plus répandues et isolées chez les patients, est capable d’échapper à la dégradation par les macrophages de l’hôte en bloquant la maturation des (auto)phagosomes. Nous avons récemment démontré que les macrophages servent de niche essentielle pour la réplication intracellulaire de B. cenocepacia K56-2, et sont nécessaires pour le développement d’une réponse pro-inflammatoire aiguë et fatale dans des larves de poisson zèbre. Cette étude exploite d’autant plus le modèle du poisson zèbre pour mieux comprendre quels sont les facteurs bactériens et de l’hôte qui sont impliqués dans la différence entre infection aiguë et persistante, et dans la transition entre ces deux phases infectieuses.ShvR est un régulateur transcriptionnel appartenant aux LTTRs (“LysR-Type Transcriptional Regulators”) chez B. cenocepacia K56-2. Il a été démontré dans le modèle d’infection pulmonaire chez le rat, que ShvR a un rôle important dans l’induction de la réponse pro-inflammatoire, mais pas dans les infections persistantes. Pour cette étude nous utilisons une approche bioinformatique, le modèle du poisson zèbre et des études transcriptomiques afin d’obtenir plus d’informations sur le rôle de ShvR dans la virulence et dans la transition entre infection persistante et réponses pro-inflammatoires. Nos données bioinformatiques suggèrent que le gène shvR s’est adapté par évolution divergente, et a été perdu dans une sous-classe du Bcc. Grâce au modèle du poisson zèbre, nous avons démontré que ShvR n’est pas essentiel pour les stades intra-macrophagiques, mais qu’il est requis pour la dissémination de B. cenocepacia K56-2 des macrophages et pour le développement d’une réponse pro-inflammatoire fatale. Le profile persistant de l’infection a été confirmé par l’analyse du transcriptome de l’hôte, donnant plus d’informations sur les différentes réponses de l’hôte envers les infections par des mutants comparées à la souche sauvage. Le travail de cette thèse a contribué non seulement à une meilleure compréhension du rôle de ShvR et aux gènes cibles régulés par ce dernier qui joue un rôle important dans les infections aiguës, mais également à établir de nouvelles pistes pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques luttant contre les infections par les bactéries appartenant au complexe Bcc. / Bacteria belonging to the Burkholderia cepacia complex (Bcc) are opportunistic pathogens with an intracellular life style. Pulmonary infections with these bacteria significantly worsen clinical outcome for cystic fibrosis (CF) patients. Chronic infections with recurrent acute exacerbations deteriorate lung function with sometimes fatal necrotizing pneumonia and septicaemia (Cepacia Syndrome). These intrinsically multi resistant bacteria are also emerging as the culprit of serious infections in non-CF settings, both in- and outside the hospital. B. cenocepacia, one of the more prevalent species in the complex, is able to avoid degradation by host macrophages by arresting (auto)phagosome maturation. We have recently shown that macrophages provide a critical site for intracellular replication of B. cenocepacia K56-2 and development of acute fatal pro-inflammatory infection in zebrafish larvae. This study further explores the zebrafish infection model to better understand bacterial and host factors involved in the difference between persistent and acute infection, and the transition between these stages.ShvR, a LysR-type transcriptional regulator of B. cenocepacia K56-2, has been shown to play an important role in the induction of pro-inflammatory responses in a rat lung infection model, but not in persistent infection. We used bioinformatics, the zebrafish infection model, and host transcriptome profiling to gain more insight into the role of ShvR in virulence, and in transition between persistent and pro-inflammatory responses. Our bioinformatics study suggests that shvR has adapted by divergent evolution, and has been lost in a subclade of the Bcc. Using the zebrafish embryo model, we demonstrate that ShvR is not important for intramacrophage stages, but is required for dissemination of B. cenocepacia K56-2 from infected macrophages and the development of pro-inflammatory fatal disease. The persistent character of the infection was confirmed by host transcriptomic analysis, giving insight into the differential host response towards the mutant compared to wildtype infection. This thesis contributes to a better understanding of the role of ShvR and its possible target genes that play an important role in acute infection and to future perspectives of development of new targets for the treatment of Bcc infections.

Les bactéries appartenant au complexe Burkholderia cepacia (Bcc) peuvent causer des infections pulmonaires dévastatrices chez les patients atteints de mucoviscidose. Les bactéries Bcc sont capables de survivre et se multiplier dans les macrophages in vitro. Des études cliniques ont confirmé que ces bactéries opportunistes se localisent au niveau des cellules phagocytaires et ne forment pas des biofilms dans les poumons des patients infectés comme on le croyait généralement. En utilisant le modèle d'infection zebrafish, nous avons établi précédemment que les macrophages constituent un site clé pour la réplication bactérienne et le développement de l'infection aiguë mortelle. Dans la présente étude, nous avons étudié le rôle des stades intracellulaires de B. cenocepacia en développant des nouvelles lignées transgéniques reportrices pour les études d’imagerie en temps réel, nous avons étudié le rôle de l'autophagie in vivo et analysé le profil « transcriptomique » des macrophages lors de l'infection par B. cenocepacia chez le poisson zèbre.En accord avec les études in vitro, nous avons constaté que la protéine « Microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3 » (Lc3), protéine clé dans l’autophagie, a été recrutée au niveau des vacuoles contenant B.cenocepacia K56-2. Nous avons observé en temps réel que les bactéries étaient capables de se répliquer dans ces organelles. Cependant la modulation de l'autophagie par voie génétique et pharmacologique n'a pas changé de manière significative le profil de réplication de B.cenocepacia K56-2 lors de l'infection. En dépit de la charge bactérienne inchangée, une baisse de l’autophagie était reliée avec une augmentation de la mortalité par rapport aux embryons de type sauvage. Ceci suggère une corrélation entre l'autophagie et l'inflammation, et nous proposons que la capacité de B. cenocepacia à arrêter la maturation des (auto) phagosomes et la présence de « cross-talk » entre l’autophagie d’une part et l’inflammasome de l’autre jouent un rôle important dans les réactions inflammatoires observées. Pour approfondir les connaissances sur le rôle des macrophages lors de l'infection aiguë, nous avons déterminé le profil transcriptomique des macrophages isolés à partir d'embryons de poisson zèbre infectés par B. cenocepacia après l'infection. Notre analyse bio-informatique a montré que la plupart des gènes surexprimés sont impliqués dans la signalisation de la réponse immunitaire, tandis que la plupart des gènes sous exprimés sont associés à la transcription et à la traduction. Nous avons confirmé l’activation de l’expression de tnfa dans les macrophages, et nous avons constaté que l'expression des cytokines cxcl8 et Il1b, induite par l'infection, ne dépendait pas de la signalisation par le récepteur TNFa, TNFRSF1A.Nos résultats contribuent à une meilleure compréhension de l'interaction entre B. cenocepacia et les macrophages in vivo, et peuvent contribuer à l’identification de nouvelles cibles pour le développement de thérapies anti-infectieuses pour lutter contre ces bactéries intracellulaires. / Opportunistic bacteria belonging to Burkholderia cepacia complex (Bcc) can cause devastating pulmonary infections in cystic fibrosis patients. These bacteria can survive and replicate in macrophages in vitro. Clinical evidence confirmed that the bacteria localize in phagocytic cells, and do not form biofilms in the lungs of infected patients as generally believed. Using a zebrafish infection model we established previously that macrophages are a critical site for bacterial replication and development of acute fatal infection. In the present study, we further explored the role of the intracellular stages of B. cenocepacia by developing new transgenic reporter lines for real time imaging of subcellular trafficking, studying in detail the role of autophagy in vivo, and performing host transcriptome analysis of FACS-sorted macrophages from zebrafish larvae infected with B. cenocepacia.In agreement with in vitro studies, we found that the autophagy related protein Microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3 (Lc3) was recruited to B. cenocepacia K56-2-containing vacuoles. Although not critical, using real time confocal microscopy, we observed that the bacteria were able to replicate in such organelles. Both genetic and pharmacological modulation of autophagy did not significantly change the replication profile of B. cenocepacia K56-2 during infection. However, reduction in autophagy resulted in more rapid embryo death compared to wild type embryos. This suggests an inverse correlation between autophagy and fatal inflammation, and we hypothesize that the ability of B. cenocepacia to arrest maturation of (auto)phagosomes, and cross talk between autophagy and inflammasome signaling pathways during B. cenocepacia infection play an important role in the observed inflammatory responses. This study further describes the host transcriptome profile of macrophages isolated from infected zebrafish embryos. Our bio-informatics analysis showed that most of the genes up-regulated during infection were involved in immune response signaling, while the major group of down-regulated genes was associated with transcription and translation. We experimentally confirmed rapidly increased expression of tnfa in macrophages, and found that infection-induced expression of the cytokines cxcl8 and il1b did not depend on signalling through the Tnfa receptor, Tnfrsf1a.Our results contribute to a better understanding of the interaction between B. cenocepacia and macrophages in vivo, and the zebrafish may help finding new targets for development of anti-infectious therapies to combat these intracellular bacteria.