Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Una de las vías que se postula que tienen una mayor importancia en las enfermedades neurodegenerativas es la de los inositoles fosfato. Para el estudio de esta vía se ha utilizado un inhibidor farmacológico de la fosfoinositol 3 cinasa (PI3K), el LY294002, en un modelo in vitro de células granulares de cerebelo de rata (CGC). Al tratar las CGC con una dosis de 30μM de LY294002 se produce una muerte celular por apoptosis que es independiente de calpaínas y dependiente de caspasas, además no se observa la fragmentación de p35 ni de α espectrina que se da por activación de las calpaínas. Los ensayos de actividad caspasa nos muestran un incremento significativo de la actividad de las caspasas 6 y 9 pero no de la 3 como sucede en otros modelos de apoptosis como la deprivación de S/K+. Nuestros estudios muestran que aunque existen algunas similitudes entre los modelos de inhibición de la PI3K y la deprivación de S/K+ también existen importantes diferencias. En ambos se produce una desfosforilación de AKT en Ser476 y consecuentemente una desfosforilación de GSK3β en Ser9, lo que indica la activación de GSK3β. Respecto a la proteína Rb en ambos modelos se observa un incremento de su fosforilación, si bien su papel es distinto ya que en la deprivación de S/K+ conduce a la liberación del E2F y a la transcripción de proteínas relacionadas con el ciclo celular. Además, se observó un incremento de la síntesis de DNA. Por el contrario el tratamiento con LY294002, pese a provocar un incremento en la fosforilación del Rb, no lleva a la expresión de ciclinas, CDKs ni un aumento de la síntesis de DNA.. Sin embargo el uso de inhibidores de CDK como flavopiridol y roscovitina muestran una protección significativa frente a la apoptosis inducida por LY294002, nuestros estudios muestran por vez primera que, no solo flavopiridol sino también otros inhibidores de CDK como la roscovitina tienen capacidad para inhibir la actividad GSK3β. Rb puede ser fosforilado por p38, un miembro de la vía de las MAPK las cuales son inhibidas por AKT. Nuestros resultados indican que LY294002 produce un incremento de la actividad de p38, pero no de JNK. Además, los cultivos Knockout de JNK3 no muestran una protección frente al tratamiento con LY294002, lo que refuerza la idea de que JNK no juega un papel central en este modelo. El incremento de actividad de p38 fue revertido con SB203580, un inhibidor de p38, así como por SP600125, inhibidor de JNK. Ambos fármacos mostraron una protección significativa frente a la apoptosis inducida por LY294002 y una reducción de la fosforilación del factor de transcripción c‐Jun, implicado en la apoptosis. La activación de c‐Jun conduce a la expresión de genes proapoptóticos como dp5 relacionados con la vía intrínseca, la inhibición de p38 previno del aumento de expresión de dp5. Por el contrario otras proteínas implicadas en la vía como Bim no están reguladas por c‐Jun ya que la inhibición de esta vía no reduce su activación. En nuestro estudio podemos concluir que, LY294002 produce una apoptosis dependiente de caspasas 6 y 9, sin implicación ni de calpaínas ni de proteínas del ciclo celular. La inhibición de AKT lleva a la activación de GSK3β y de p38. Además, p38 es capaz de fosforilar c‐Jun que regula la expresión de genes relacionados con la apoptosis por la vía intrínseca. / The inositol pathway has been reported that plays a key role in neurodegenerative diseases We study the mechansims involved in the apoptosis induced by inhibiting the phosphoinositol 3 kinase (PI3K) using a pharmacological inhibitor named LY294002 in an in vitro model of rat cerebellar granule cells (CGC). LY294002 induced apoptotic cell death through calpain independent and caspase dependent. Furthermore, we could not observed neither fragmentation of of p35 or α espectrin which is caused by calpains. The caspase activity assays showed a significant increase in caspase 6 and 9 but not in caspasa 3, in contrast with other apoptotic models such as de S/K+ deprivation. Our studies show that although exist several common points between inhibition of PI3K and S/K+ deprivation, also exist important differences between them. In both cases it has been observed AKT dephosphorylation at Ser476 and consequently GSK3β dephosphorylation at Ser9, which indicates GSK3β activation. On the other side, it was observed an increase of Rb phosphorylation in both models. However, it seems that the role played by this protein is different since in the de S/K+ deprivation leads to E2F released which participates in the transcription of proteins related to cell cycle. Moreover, the BrdU assay showed an increase in DNA synthesis. On the contrary, the LY294002 treatment, in spite of the fact that induced an increase of Rb phosphorylation, it did not induce any change of the levels neither cell cycle proteins or However, CDK inhibitors such as flavopiridol and roscovitine protected from the apoptosis induced by LY294002, our studies showed for the first time, that not only flavopiridol, but also other CDK inhibitors such as roscovitine could inhibit the GSK3β activity. Furthermore Rb can be phosphorylated by p38, which is a protein of MAPK pathway that is down‐regulated by AKT. Our results showed that LY294002 produced an increase of p38 activity, but not of JNK. Moreover, JNK3 Knockout cultures were not significantly protected from LY294002 treatment, this reinforces the idea that JNK is not the main target involved in this model. The increase of p38 activity was prevented with SB203580, a specific p38 inhibitor, and either with SP600125, a JNK inhibitor. Both drugs shown a significant protection from the apoptosis induced by LY294002 and prevented from c‐Jun phosphorylation, a transcription factor implied in apoptosis. The activation of c‐Jun triggered the expression of proapoptotic genes such as dp5 which is related to the intrinsic pathway, p38 inhibition prevented from the increase in dp5 expression. On the contrary, other proapoptotic proteins related to this pathway such as Bim was not regulated by c‐Jun since the inhibition of p38 pathway did not reduce its expression. In our study we can conclude that LY294002 induced apoptosis mediated by caspasas 6 and 9. Neither calpains nor cell cycle proteins were involved in this apoptotic model. The inhibition of AKT leaded to GSK3β and p38 activation. Moreover, p38 was able to phosphorylate c‐Jun that triggers the expression of proapoptotic genes implied in the apoptotic intrinsic pathway.

L’athérosclérose est une maladie vasculaire inflammatoire chronique qui se développe progressivement au cours de la vie. Les mécanismes impliqués sont complexes et la recherche de nouveaux candidats impliqués dans l'athérogénèse est toujours d'actualité. L’Angiopoietine-like 2 (Angptl2) est une protéine relativement peu connue, aux propriétés pro-angiogéniques et pro-inflammatoires, qui appartient par homologie à la grande famille des angiopoietines, mais dont le récepteur n'est pas encore clairement identifié. Les situations pathologiques dans lesquelles l’Angptl2 jouerait un rôle crucial sont diverses, mais sa contribution moléculaire dans le développement de l’athérosclérose est inconnue. Par differential display, nous avons initialement identifié l'Angptl2 comme étant surexprimée dans des cellules endothéliales sénescentes, isolées et cultivées à partir d'artères mammaires internes de patients athérosclérotiques ayant subi un pontage coronarien. Cette découverte a été la à base de mon projet, et mes objectifs ont été 1) de déterminer l'implication de l’Angptl2 vasculaire en présence de facteurs de risques tels que le tabagisme et la dyslipidémie, 2) de produire et de purifier une protéine recombinante fonctionnelle de l’Angptl2 afin d'identifier in vitro de nouvelles propriétés cellulaires de l'Angptl2 et 3) d'étudier in vivo le potentiel pro-athérogénique de l'Angptl2 recombinante dans un modèle murin de dyslipidémie sévère. Nous avons montré que l’Angptl2 est sécrétée préférentiellement dans des conditions pro-oxydantes et pro-inflammatoires, avec une augmentation de son expression endothéliale de l’ordre de 6 fois chez des patients coronariens fumeurs atteints de maladie pulmonaire obstructive chronique. Suite à ces résultats, nous avons émis l’hypothèse que l’Angptl2, en plus de ses fonctions pro-inflammatoires connues, possède des propriétés pro-oxydantes. Nous avons démontré que l’Angptl2 recombinante stimule en effet la production de radicaux libres dans des HUVEC en culture, via l’inhibition partielle de la voie cytoprotectrice antioxydante Nrf2/HO-1 et potentiellement via l'activation de kinase intracellulaire de type p38. A l'aide de souris dyslipidémiques LDLr-/-; hApoB-100+/+, nous avons démontré que le niveau d’Angptl2 plasmatique, vasculaire et dans les plaques athéromateuses, augmente parallèlement avec le développement de l’athérosclérose. De plus, une stimulation avec l’Angptl2 recombinante engendre chez ces souris une réponse inflammatoire évaluée par l’expression endothéliale de cytokines et de molécules d'adhésion et par l’infiltration de leucocytes sur l’endothélium vasculaire. Finalement, l’administration intraveineuse de la protéine recombinante d’Angptl2 pendant quatre semaines à des souris LDLr-/-; hApoB-100+/+ augmente de 10 fois l'expansion de la plaque athérosclérotique et double leur taux de cholestérol circulant. Nous avons aussi montré que chez des patients athérosclérotiques, l'Angptl2 plasmatique est 6 fois plus élevée que chez des sujets sains du même âge. Nos études semblent donc définir l’Angptl2 comme un facteur contribuant directement au développement de l'athérosclérose en favorisant la sénescence, l’inflammation et l’oxydation des cellules endothéliales. Ces propriétés pourraient globalement définir l'Angptl2, non seulement comme un nouveau biomarqueur circulant de l’athérosclérose, mais également comme l'un de ses promoteurs. / Atherosclerosis is a chronic vascular inflammatory disease that develops gradually during life. While the control mechanisms of this disease are complex and variable, research continues to identify new protein candidates involved in atherogenesis. Angiopoietin-like2 (Angptl2) is a relatively unknown protein, recently shown to display angiogenic and pro-inflammatory properties. Based upon structural homology, Angptl2 is a member of the angiopoietin family; however, the Angptl2 receptor has not yet been clearly identified. The reported pathological situations in which Angptl2 may play a crucial role are multiple, but its molecular contribution in the development of atherosclerosis remains unknown. By differential display, we initially identified Angptl2 as being overexpressed in senescent endothelial cells, isolated and cultivated from internal mammary arteries of atherosclerotic patients undergoing coronary bypass. This observation was at the basis of my project. My specific objectives were 1) to determine the abundance of vascular Angptl2 in the presence of risk factors such as smoking and dyslipidemia, 2) to produce and purify a functional recombinant human Angptl2 protein in order to examine its effects on cellular function in vitro, and 3) to study the pro-atherogenic potential of Angptl2 in vivo using a mouse model of severe dyslipidemia. We showed that Angptl2 is preferentially secreted under pro-oxidant and pro-inflammatory conditions, with a 6-fold increase in endothelial Angptl2 expression in smoker coronary patients with chronic obstructive pulmonary disease. Based on these results, we hypothesized that, in addition to its known pro-inflammatory functions, Angptl2 has pro-oxidant properties. Accordingly, we demonstrated that recombinant Angptl2 stimulates the production of free radicals by HUVEC, an action exerted, at least in part, by the inhibition of the cytoprotective antioxidant pathway, Nrf2/HO-1, and potentially via the activation of the intracellular p38 MAPK pathway. In dyslipidemic LDLr-/-; hApoB-100+/+ mice, we showed that the levels of endogenous Angptl2 in plasma, vascular tissue and atherosclerotic lesions increase in parallel with the development of atherosclerosis. In addition, stimulation with recombinant Angptl2 induces an inflammatory response, as assessed by the expression of cytokines and adhesion molecules and by infiltration of leukocytes into the vascular endothelium. Furthermore, intravenous infusion of purified recombinant Angptl2 for four weeks promoted a 10-fold increase in the formation of atherosclerotic plaques in LDLr-/-; hApoB-100+/+ mice and doubled their circulating cholesterol levels. Finally, we also demonstrated that plasma Angptl2 is 6-fold higher in atherosclerotic patients than in age-matched healthy subjects. These studies therefore strongly suggest that Angptl2 could directly contribute to the development of atherosclerosis by promoting senescence, inflammation and oxidation in endothelial cells. Such properties indicate that Angptl2 may be both a new biomarker of atherosclerosis, as well as one of its contributors.

L’athérosclérose est une maladie vasculaire inflammatoire chronique qui se développe progressivement au cours de la vie. Les mécanismes impliqués sont complexes et la recherche de nouveaux candidats impliqués dans l'athérogénèse est toujours d'actualité. L’Angiopoietine-like 2 (Angptl2) est une protéine relativement peu connue, aux propriétés pro-angiogéniques et pro-inflammatoires, qui appartient par homologie à la grande famille des angiopoietines, mais dont le récepteur n'est pas encore clairement identifié. Les situations pathologiques dans lesquelles l’Angptl2 jouerait un rôle crucial sont diverses, mais sa contribution moléculaire dans le développement de l’athérosclérose est inconnue. Par differential display, nous avons initialement identifié l'Angptl2 comme étant surexprimée dans des cellules endothéliales sénescentes, isolées et cultivées à partir d'artères mammaires internes de patients athérosclérotiques ayant subi un pontage coronarien. Cette découverte a été la à base de mon projet, et mes objectifs ont été 1) de déterminer l'implication de l’Angptl2 vasculaire en présence de facteurs de risques tels que le tabagisme et la dyslipidémie, 2) de produire et de purifier une protéine recombinante fonctionnelle de l’Angptl2 afin d'identifier in vitro de nouvelles propriétés cellulaires de l'Angptl2 et 3) d'étudier in vivo le potentiel pro-athérogénique de l'Angptl2 recombinante dans un modèle murin de dyslipidémie sévère. Nous avons montré que l’Angptl2 est sécrétée préférentiellement dans des conditions pro-oxydantes et pro-inflammatoires, avec une augmentation de son expression endothéliale de l’ordre de 6 fois chez des patients coronariens fumeurs atteints de maladie pulmonaire obstructive chronique. Suite à ces résultats, nous avons émis l’hypothèse que l’Angptl2, en plus de ses fonctions pro-inflammatoires connues, possède des propriétés pro-oxydantes. Nous avons démontré que l’Angptl2 recombinante stimule en effet la production de radicaux libres dans des HUVEC en culture, via l’inhibition partielle de la voie cytoprotectrice antioxydante Nrf2/HO-1 et potentiellement via l'activation de kinase intracellulaire de type p38. A l'aide de souris dyslipidémiques LDLr-/-; hApoB-100+/+, nous avons démontré que le niveau d’Angptl2 plasmatique, vasculaire et dans les plaques athéromateuses, augmente parallèlement avec le développement de l’athérosclérose. De plus, une stimulation avec l’Angptl2 recombinante engendre chez ces souris une réponse inflammatoire évaluée par l’expression endothéliale de cytokines et de molécules d'adhésion et par l’infiltration de leucocytes sur l’endothélium vasculaire. Finalement, l’administration intraveineuse de la protéine recombinante d’Angptl2 pendant quatre semaines à des souris LDLr-/-; hApoB-100+/+ augmente de 10 fois l'expansion de la plaque athérosclérotique et double leur taux de cholestérol circulant. Nous avons aussi montré que chez des patients athérosclérotiques, l'Angptl2 plasmatique est 6 fois plus élevée que chez des sujets sains du même âge. Nos études semblent donc définir l’Angptl2 comme un facteur contribuant directement au développement de l'athérosclérose en favorisant la sénescence, l’inflammation et l’oxydation des cellules endothéliales. Ces propriétés pourraient globalement définir l'Angptl2, non seulement comme un nouveau biomarqueur circulant de l’athérosclérose, mais également comme l'un de ses promoteurs. / Atherosclerosis is a chronic vascular inflammatory disease that develops gradually during life. While the control mechanisms of this disease are complex and variable, research continues to identify new protein candidates involved in atherogenesis. Angiopoietin-like2 (Angptl2) is a relatively unknown protein, recently shown to display angiogenic and pro-inflammatory properties. Based upon structural homology, Angptl2 is a member of the angiopoietin family; however, the Angptl2 receptor has not yet been clearly identified. The reported pathological situations in which Angptl2 may play a crucial role are multiple, but its molecular contribution in the development of atherosclerosis remains unknown. By differential display, we initially identified Angptl2 as being overexpressed in senescent endothelial cells, isolated and cultivated from internal mammary arteries of atherosclerotic patients undergoing coronary bypass. This observation was at the basis of my project. My specific objectives were 1) to determine the abundance of vascular Angptl2 in the presence of risk factors such as smoking and dyslipidemia, 2) to produce and purify a functional recombinant human Angptl2 protein in order to examine its effects on cellular function in vitro, and 3) to study the pro-atherogenic potential of Angptl2 in vivo using a mouse model of severe dyslipidemia. We showed that Angptl2 is preferentially secreted under pro-oxidant and pro-inflammatory conditions, with a 6-fold increase in endothelial Angptl2 expression in smoker coronary patients with chronic obstructive pulmonary disease. Based on these results, we hypothesized that, in addition to its known pro-inflammatory functions, Angptl2 has pro-oxidant properties. Accordingly, we demonstrated that recombinant Angptl2 stimulates the production of free radicals by HUVEC, an action exerted, at least in part, by the inhibition of the cytoprotective antioxidant pathway, Nrf2/HO-1, and potentially via the activation of the intracellular p38 MAPK pathway. In dyslipidemic LDLr-/-; hApoB-100+/+ mice, we showed that the levels of endogenous Angptl2 in plasma, vascular tissue and atherosclerotic lesions increase in parallel with the development of atherosclerosis. In addition, stimulation with recombinant Angptl2 induces an inflammatory response, as assessed by the expression of cytokines and adhesion molecules and by infiltration of leukocytes into the vascular endothelium. Furthermore, intravenous infusion of purified recombinant Angptl2 for four weeks promoted a 10-fold increase in the formation of atherosclerotic plaques in LDLr-/-; hApoB-100+/+ mice and doubled their circulating cholesterol levels. Finally, we also demonstrated that plasma Angptl2 is 6-fold higher in atherosclerotic patients than in age-matched healthy subjects. These studies therefore strongly suggest that Angptl2 could directly contribute to the development of atherosclerosis by promoting senescence, inflammation and oxidation in endothelial cells. Such properties indicate that Angptl2 may be both a new biomarker of atherosclerosis, as well as one of its contributors.