Aim: To determine the effect of diet-induced steatosis in the development of mitochondrial dysfunction in the liver and hepatic sensitivity to the partial ischemia. Methods: Male Wistar rats (361 ± 8.8 g) were fed standard (SD) or high-fat diet (HFD). Partial ischemia was induced by short-term clamp (20 min) of vein porta two days before the end of the experiment. Results: Ten-week HFD administration lead due to increased ketogenesis the altered glucose tolerance elevated serum NEFA. We demonstrated the inhibitory effect of HFD on the respiratory capacity of mitochondria in vitro. HFD negatively affected the activity of antioxidant systems and stimulated the formation of lipoperoxides. Partial ischemia had no efect on the mitochondrial oxidative capacity but significantly elevated the oxidative stress. Conclusion: HFD administration lead to the development of fatty liver that was still not accompanied by biochemical markers of liver injury. Nevertheless, we proved the impairment of to mitochondrial respiratory capacity, signs of structural damage of mitochondria and the increased sensitivity to oxidative damage of the liver. Subject words: biochemistry, physiology Keywords: mitochondria, HFD, ischemia, respiratory chain, antioxidant systém, ROS

Title: Acute neuroinflammatory reaction after focal cerebral ischemia Aim: The aim of this thesis is to evaluate neuroinflammatory response after focal cerebral cortical ischemia. Also, familiarizing with the method of displaying damage of blood brain barriers, neurons and the possibility of detection of microglia cells as a marker of acute neuroinflammatory processes. Methodology: This is an experimental study. We brought about cortical cerebral ischemia in rats using an application of photosensitive dye "bengal red," and a green laser. Two animals were were given the additional application of "Evans blue" in order to visualize the defects of the blood brain barrier. The animals were returned to their cage for the time needed before they were induced terminal anesthesia. This was followed by the process of brain perfusion, slicing the brain in sections 50 µm thick and then applied these sections onto slides. Sections with applied EB were immediately analyzed under the microscope. Sections to illustrate neuronal death were immunohistochemically stained via the Nissl method. Sections visualizing microglial activity were stained using CD11b antibody. Results: Following the induction of focal ischemia there occured brain tissue damage. In the vicinity of lesion there is degeneration of neurons and...

1 Abstract Title: Consequences of experimentally induced perinatal cerebral ischemic lesion. Aim: This thesis aims to present the issues and analyze current knowledge in the field of perinatal brain damage, particularly perinatal cerebral ischemic lesions as the most common brain infarction in children. Basic characteristics of the disease, syndromology, pathophysiological mechanisms and risk factors are emphasized. Following the theoretical background the thesis analyzes current trends as well as the limitations of the diagnostics and therapy. The aim is to highlight the need for early diagnosis and emphasize the potential of preventive treatment strategies. The practical part follows the theoretical background and expands the topic on the analysis of motor and behavioral consequences of experimentally induced perinatal ischemic stroke. Method: Cerebral focal ischemia was induced experimentally by photothrombotic method to seven days old rats. Rose Bengal intravenously followed by continual illumination of the senzorimotor cortex using a green laser beam for 10 minutes was induced platelet aggregation and subsequent thrombosis. Eight animals at age of two months were evaluated for 7 days via observational cages PhenoTyper. Results: The theoretical part collected and processed theoretical data on the...

Les glycosaminoglycannes : implication dans la régénération tissulaire après ischémie et utilisation de mimétiques comme agents potentialisateurs des progéniteurs endothéliaux humains pour la régénération vasculaire. Contexte scientifique : Les pathologies vasculaires représentent la première cause de décès dans le monde. Parmi elles, l'ischémie chronique des membres inférieurs conduit fréquemment à une amputation du membre et est associé à une forte mortalité. Les thérapies actuelles, incluant un meilleur mode de vie, les traitements prophylactiques et les interventions chirurgicales ne permettent pas de soigner définitivement les patients. Les progéniteurs endothéliaux circulants (PEC) présentent une capacité de prolifération très élevée, forme des vaisseaux in vivo et s'intègre naturellement à des réseaux vasculaires préexistants. C'est pourquoi, ces cellules sont actuellement considérées comme un outil thérapeutique prometteur pour la réparation vasculaire. Cependant, l'utilisation des PEC en clinique est limitée par leur rareté dans le sang. De plus, les essais cliniques en thérapie cellulaire ont jusqu'à maintenant démontré des résultats prometteurs mais systématiquement limités dans le temps, à cause d'une faible rétention et d'une mort accrue des cellules après injection. Ceci souligne l'importance d'une meilleure compréhension du microenvironnement dans lequel les cellules thérapeutiques sont injectées. Le microenvironnement est en partie constitué par des glycosaminoglycannes (GAG) sulfatés, tels que les Héparanes Sulfates (HS) ou les Chondroïtines Sulfates (CS). Les GAG interagissent avec des partenaires protéiques afin de structurer et de stabiliser la matrice extracellulaire. Les GAG ont également un rôle fonctionnel puisqu'ils régulent de nombreux processus biologiques grâce à leur capacité d'interaction avec des facteurs liant l'héparine.Objectifs: Les objectifs de cette thèse étaient (1) d'améliorer l'isolement des PEC et d'optimiser leurs fonctionnalités endothéliales in vitro à l'aide d'un mimétique de GAG, (2) de caractériser d'un point de vue structurel et fonctionnel les GAG endogènes, et en particulier les HS et les CS, dans le muscle ischémié.Résultats: (1) Nous avons démontrés que l'ajout d'un mimétique de GAG, et plus précisément le composé [OTR4131], pendant les phases d'isolement des PEC à partir du sang de cordon induisait un enrichissement par 4 du nombre de colonies. De plus, l'ajout de ce mimétique dans le milieu de culture permet d'optimiser l'adhérence, la prolifération, la migration ainsi que l'auto-renouvellement des PEC. (2) L'ischémie induit une modification de l'expression des gènes de biosynthèse des GAG, conduisant à des modifications structurelles distinctes des HS et CS. Ces modifications sont corrélées avec des changements dans la capacité des GAG à lier certains facteurs et à moduler l'activité cellulaire. De plus, les CS forment une marque cicatricielle après ischémie.Conclusion & Perspectives: (1) Le mimétique de GAG [OTR4131] devrait permettre d'optimiser les capacités d'expansion des PEC et leurs propriétés endothéliales pour une application thérapeutique. (2) Un intense remodelage des GAG suit l'accident ischémique et perturbe l'activité des facteurs de croissance. Le contrôle des CS constitue une nouvelle approche thérapeutique pour le traitement des lésions du muscle squelettique.Mots-clés : angiogenèse, progéniteurs endothéliaux circulants, glycosaminoglycannes, facteurs liant l'héparine, ischémie, régénération musculaire, réparation vasculaire / Glycosaminoglycans: involvement in tissue regeneration after ischemia and use of mimetic molecules as potentiating agents of human endothelial progenitor cells for vascular regenerationScientific background: Vascular diseases are the leading causes of death in the world. Among them, critical limb ischemia often leads to amputation of the limb and potential mortality. Current therapies including life style management, pharmacological control of risk factors and surgical revascularization do not completely reverse the pathology. Late-outgrowth endothelial colony-forming cells (ECFC) display high proliferative potential, form vessels in vivo and are incorporated into pre-existing vascular networks. Thus, these cells are considered as a promising therapeutic tools for vascular repair. However, the use of ECFC in cell therapy is limited by their rarity in blood. In addition, clinical trials using cell therapy have demonstrated promising results, but there are still a significant problem with poor cell retention and survival. This underlines the relevance to better knowing the microenvironment on which therapeutic cells are transplanted. Microenvironment is in part composed by sulfated glycosaminoglycans (GAG), such as Heparan Sulfate (HS) or Chondroitin Sulfate (CS). GAG interact with proteins to strengthen the structure and stability of the extracellular matrix. GAG have also functional roles since they regulate numerous biological processes through their abilities to interact with heparin-binding growth factors (HBGF).Objectives: The aim of this thesis was (1) to improve production of ECFC and optimize their endothelial properties in vitro using a GAG mimetic molecule, (2) to characterize structurally and functionally endogenous GAG, especially HS and CS species, in ischemic muscle.Results: (1) We demonstrate that the addition of a GAG mimetic molecule, namely the [OTR4131] compound, during the isolation process of ECFC from cord blood induces a 4 fold increase the number of colonies. Moreover, addition of [OTR4131] to cell culture media improves adhesion, proliferation, migration and self-renewal of ECFC. (2) Ischemia induces modifications of expression of GAG biosynthetic enzymes in muscle, leading to changes in HS and CS structures in distinct ways. These changes are correlated with functional modifications of GAG to bind HBGF and to modulate cell activity. Moreover, CS constitute a persistent hallmark of injury after ischemia.Conclusion & Perspectives: (1) The [OTR4131] GAG mimetic should enable optimization of the expansion capacity and the endothelial properties of ECFC for further therapeutic applications. (2) Intense GAG remodeling follows ischemia and disrupts growth factors activities. The control of CS is a promising new therapeutic approach for the treatment of skeletal muscle injury.Keywords: angiogenesis, endothelial progenitor cell, glycosaminoglycans, heparin binding growth factor, ischemia, muscle regeneration, vascular repair

Les flavonoïdes sont des composés naturels appartenant à la famille des polyphénols, qui sont étudiés depuis de nombreuses années pour leur caractère antioxydant ainsi que leurs propriétés thérapeutique. La mise en évidence, pour certaines d’entre eux, d’une activité vasorelaxante variant en fonction de leur structure, en fait un modèle d’étude de choix pour la prévention des maladies cardiovasculaires. Le 3’,4’-dihydroxyflavonol (DiOHF) est le dérivé le plus décrit pour son fort potentiel en terme de propriétés cardioprotectrices et antioxydantes et est considéré comme un composé d’intérêt dans le traitement anti-ischémique, bien que sa faible solubilité dans l’eau soit un facteur limitant pour son utilisation. Dans ce contexte, notre premier objectif a été de synthétiser une trentaine de dérivés du DiOHF, fonctionnalisés par un groupement hydrophile, tout en préservant ses propriétés antioxydantes et pour certaines des structures obtenues, ses propriétés vasorelaxantes. Pour cela, nous avons développé une méthode de synthèse rapide utilisant les irradiations micro-onde, qui nous a permis d’optimiser les rendements, de réduire les temps de réaction et qui ne conduit à aucune formation de sous-produits. Notre second objectif a été de déterminer l’activité antioxydante de ces dérivés flavonoïques par des tests mettant en œuvre des réactions de compétition avec des radicaux libres. Faisant suite à ce premier screening, des études biologiques chez le rat ont été réalisées sur les composés montrant les meilleures performances. A partir d’essais in vitro et in vivo nous avons démontré, l’innocuité de ces dérivés flavonols, et le fort impact des modifications de structure sur l’activité vasorelaxante et antioxydante, ainsi que sur la récupération fonctionnelle et métabolique consécutive à une ischémie/reperfusion myocardique. Un autre champ d’action de ces flavonols hydrosolubles pourrait être d’explorer leur utilisation dans le traitement du diabète de type 2. Pour cela nous avons greffé deux motifs antidiabétiques, correspondant à des molécules actives déjà utilisées dans le traitement de l’insulinorésistance, sur les dérivés flavonols les plus cardioprotecteurs et/ou vasorelaxants de notre série, ainsi que sur des dérivés de l’acide cinnamique. Ces composés ont été testés pour leur activité antioxydante, laissant supposer un potentiel significativement supérieur aux analogues antidiabétiques non fonctionnalisés, en termes de protection antioxydante et fonctionnelle. / Flavonoids are natural polyphenolic compounds, and epidemiological and pharmacological studies have shown that flavonoids intake is associated with many beneficial effects. An important example is the 3’,4’-dihydroxyflavonol (DiOHF) which showed interesting therapeutic properties in vitro so it could be considered as an important lead compound to the treatment of cardiovascular diseases. However is poor water solubility prevents it use as a drug. Starting from this model we have synthesized a series of new flavones functionalized by a hydrophilic group in order to increase water solubility. To obtain these derivatives we have set up a fast, simple and clean method without formation of by-products, using micro-waves irradiation to optimize yield and to decrease reaction time. Our second purpose was to investigate the antioxidant activity of the synthesized compounds by undergoing several assays. The most promising compounds were tested in biological studies, in vitro and in vivo. The results showed a significant enhancement of the post-ischemic mechanical function recovery in vivo and in vitro. Another purpose was to designed new flavonols linked to selected antidiabetic moieties already used in the treatment of insulinoresistance. It was shown that these new compounds retain the antioxidant properties of the parent flavonols, and can be of interest in the development of new diabete 2 treatments.

L’artériopathie oblitérante des membres inférieurs conduit progressivement au rétrécissement des artères qui assurent la vascularisation des membres inférieurs. Il en résulte une ischémie des tissus irrigués par ces artères et à terme, en cas d’occlusion artérielle, une ischémie critique conduisant à une amputation du membre. De nouvelles stratégies de thérapie cellulaire basées sur l’injection de cellules progénitrices capables d’induire une angiogenèse thérapeutique se sont développées ces dernières années. Cependant le faible taux d’incorporation des cellules transplantées dans le tissu ischémique limite le développement de ces nouvelles approches. Dans ce contexte, mon travail de thèse a consisté à étudier deux approches thérapeutiques distinctes pouvant améliorer les thérapies pro-angiogènes. La première étude porte sur le fucoïdane, polysaccharide sulfaté d’origine naturelle, antithrombotique favorisant la formation de nouveaux vaisseaux sanguins dans le modèle murin d’ischémie du membre inférieur. Nous avons montré qu’il induisait le recrutement de monocytes en améliorant leur adhésion à l’endothélium activé en condition dynamique, ainsi que leur adhésion à la matrice et leur transmigration in vitro. Cette action est médiée par l’activation des voies de signalisation ERK et p38 et la sécrétion de métalloprotéinases 9. De plus, le fucoïdane entraine une polarisation des macrophages de type pro-angiogènes in vitro. Il augmente leur recrutement dans le muscle ischémié permettant de réduire ainsi la phase inflammatoire post-ischémique, la nécrose et de favoriser le processus de cicatrisation. La deuxième étude porte sur le rôle des neuropilines (NRP), co-récepteurs du VEGF (facteur de croissance pro-angiogène) exprimés à la surface des ECFC, afin de comprendre leur implication au niveau moléculaire dans le mécanisme d’action pro-angiogène des ECFCs et optimiser l’efficacité de la thérapie cellulaire. A l’aide du système d’extinction par ARN interférent, nous avons découvert un mécanisme de compensation jamais étudié auparavant puisque l’inhibition de NRP1 entraine une augmentation de celle de NRP2 et une diminution de la prolifération et de la migration des ECFCs. En revanche, l’extinction de NRP2 n’a pas d’effet sur l’expression de NRP1, mais induit une augmentation de l’adhésion des ECFCs à la matrice extracellulaire associée à une augmentation de la phosphorylation des ERK1/2. / Vascular diseases such as Peripheral Arterial Disease may evolve towards critical limb ischemia, requiring revascularization or amputation. New strategies of cell therapy based on the injection of progenitor cells able to induce therapeutic angiogenesis have been recently developed. However the low level of incorporation of transplanted cells in the ischemic tissue limits the development of these new approaches. In this context, my thesis was to study two different therapeutic approaches that can improve the pro-angiogenic therapies. The first focuses on fucoidan, a marine sulphated polysaccharide with antithrombotic properties. We have previously shown promising angiogenic properties of fucoidan in vivo. We found that fucoidan increases monocyte recruitment and improves their adhesion to activated endothelium under dynamic condition. It also increases in vitro transmigration. This action is mediated by the activation of ERK and p38 signaling pathways and metalloproteinase 9 secretion. Further, fucoidan can lead macrophage polarization to the pro-angiogenic type in vitro. It increases macrophage recruitment in ischemic muscle that could reduce post-ischemic inflammatory phase and necrosis leading to healing process. The second study focuses on the role of neuropilin (NRP), co-receptors of VEGF (pro-angiogenic growth factor). The aim of this part was to understand their involvement in the pro-angiogenic properties of ECFC at molecular level and optimize the efficiency of cell therapy. Using siRNA, we found a compensation mechanism never studied before. The NRP1 inhibition leads to an increase in the NRP2 expression and a decrease of ECFC proliferation and migration. The NRP2 silencing has no impact on NRP1, but induces ECFC adhesion to the extracellular matrix correlated with an increased level of ERK1 / 2 phosphorylation.

Le système kallicréine-kinines (SKK) est un système peptidique vasodilatateur. Les métabolites actifs du système, les kinines, sont produites par la kallicréine tissulaire (TK), et agissent via leurs deux récepteurs, B2 et B1. Le SKK a été impliqué dans les processus physiopathologiques conduisant au diabète de type 2. Son rôle est bien établi dans la protection des complications cardiovasculaires et rénales du diabète. Nous avons étudié le rôle du SKK dans le développement des anomalies métaboliques liées à l'obésité en utilisant des souris déficientes en TK dans deux modèles d'obésité (mutation ob/ob et régime gras). Nous n'avons pas mis en évidence d'effet de la déficience en TK sur les anomalies glucidiques dans ces deux modèles. Chez l'homme, nous avons étudié l'effet d'un polymorphisme génétique de la TK dans une cohorte de 4843 sujets de la population générale suivi pendant 9 ans. Nous n'avons pas observé d'effet d'un déficit partiel en activité TK sur l'apparition des troubles glucidiques.Ensuite, nous avons étudié l'effet de la stimulation du SKK par des agonistes spécifiques de chaque récepteur lors d'une ischémie reperfusion cardiaque. Chez les souris non diabétiques, l'agoniste B2 réduit la taille de l'infarctus. L'agoniste B1 n'a pas d'effet. Chez les souris diabétiques, l'agoniste B2 n'a pas d'effet. En revanche, l'agoniste B1 diminue la taille de l'infarctus. On observe une induction de la synthèse du B1R dans le c¿ur diabétique.Nos travaux clarifient le rôle du SKK dans le développement du diabète et de ses complications cardiaques. L'effet des agonistes ouvre une nouvelle piste thérapeutique dans la prise en charge des du syndrome coronarien aigu. / Kallikrein-kinin system (KKS) is a vasodilator peptide system. Kinins, the active peptides, are produced by tissue kallikrein (TK), and act via their two receptors, B1 and B2. KKS was involved in the pathophysiological process leading to type 2 diabetes. Its role is well established in the protection of cardiovascular and renal complications of diabetes. We studied the role of SKK in the development of metabolic abnormalities associated with obesity using TK deficient mice in two models of obesity (Ob/Ob and high fat diet). We did not observed any effect of TK deficiency on metabolic parameters in these two models. In humans, we studied the effect of a polymorphism of TK in a population-based cohort of 4843 subjects followed for 9 years. We did not observe any effect of a partial deficiency in TK on the occurrence of metabolic disorders. Next, we studied the effect of specific agonists of B1 and B2 receptors in cardiac ischemia reperfusion injury. In non-diabetic mice, the B2 agonist reduces infarct size. Agonist B1 has no effect. In diabetic mice, B2 agonist had no effect. In contrast, B1 agonist reduces infarct size. Overexpression of B1R is observed in the diabetic heart. Our work clarifies the role of SKK in the development of diabetes and its cardiac complications. Agonists of kinins receptors could be a new therapeutic approach in the management of acute coronary syndrome.

L’infarctus du myocarde (IDM) est une cause majeure de mortalité dans le monde. La stratégie thérapeutique actuelle repose sur la reperfusion précoce du myocarde qui contribue largement à l’amélioration du pronostic des malades. Les investigations menées chez des modèles d’ischémie/reperfusion (I/R) cardiaque ont montré que l’apoptose des cardiomyocytes était contrôlée en partie par les protéines de type Bcl-2. La production de radicaux libres (RL), en particulier par la nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADPH) oxydase, contribue aussi à l’altération de la fonction cardiaque. Récemment, les effets observés de l’érythropoïétine (Epo) sur l’I/R, sont principalement liés à ses effets anti-apoptotiques, anti-inflammatoires et à son rôle dans l’angiogénèse et le remodelage vasculaire. Ces propriétés suggèrent le potentiel de l’Epo dans la cardioprotection suite à un IDM. Dès lors, les objectifs de cette thèse ont été : 1) de confirmer les effets cardioprotecteurs d’un analogue de l’Epo, la darbepoétine-a (DA), chez un modèle d’I/R chez le rat; 2) d’étudier les voies de signalisation impliquées dans ses effets anti-apoptotiques et ; 3) de caractériser les effets antioxydants de la DA médiée par l’hème-oxygénase-1 (HO-1), et ; d’étudier le rôle de la NADPH oxydase. Dans la 1ère étude, le traitement par DA a permis de diminuer significativement la taille de l’infarctus, la production de RL et l’apoptose. La DA a activé la voie des protéines Jak2/Akt, augmenté l’expression des protéines P-Bad et P-GSK3ß et anti-apoptotiques, Bcl-2 et Bcl-xL. Ces mêmes effets bénéfiques ont été confirmés à plus long terme avec la réduction des lésions fibrotiques et l’augmentation du nombre da capillaires sanguins, suggérant une meilleure perfusion du ventricule gauche. La seconde étude, a confirmé les effets cardioprotecteurs de la DA. Parallèlement, la DA a induit l’expression et l’activité de l’HO-1 et régulé l’expression des sous-unités p47phox et Rac1 nécessaires à l’activation de la NADPH oxydase. Ces résultats sont concordants avec la baisse de la production des RL observés dans le groupe DA. Les effets bénéfiques de la DA ont été annihilés en présence de ZnPP, inhibiteur de l’HO-1. Des essais cliniques sont actuellement en cours pour démontrer que les bénéfices observés chez l’animal, peuvent être retrouvés chez l’homme. / Cardiovascular disease remains a leading cause of mortality in industrialized countries. Loss of cardiomyocytes via apoptosis is believed to contribute to the continuous decline of the ventricular function in heart failure. Several investigations revealed that following ischemia-reperfusion (I/R), cardiomyocytes apoptosis is controlled, at least, by the Bcl-2 proteins family members. The excessive reactive oxygen species (ROS) production, through NADPH oxidase, contributes also to cellular damages and death. Recently, erythropoietin (EPO), a hematopoietic cytokine, has been shown to protect heart exposed to ischemia or ischemia-reperfusion, limiting infarct size and cardiac remodeling. However, to date the precise cellular mechanism of DA-induced cardioprotection remains incompletely understood. Thus, the aims of this work were 1) to assess the short and long term cardioprotective effects of darbepoetin-a (DA), an Epo analog, in an in vivo rat model of I/R ; 2) to investigate the signaling pathway through which DA potentially limits apoptosis and ; 3) to elucidate whether its cardioprotective effect, and more particularly its antioxidative effect, is linked to an HO-1-dependent inhibition of the NADPH activity. In the first study, left ventricle infarct size (LV) was smaller than that in the control rats, in agreement with echocardiographics parameters. DA-treatment activated the JAK2/Akt signaling pathway, lowered cleaved caspase-3 and increased both P-Bad and P-GSK-3ß proteins. This was consistent with the decrease of ROS production and the lowered binding of Bad to Bcl-xL and Bcl-. Similarly, in long term study, histology alterations implicated lower LV cardiac fibrosis and greater capillary density; furthermore both Bcl-xL and Bcl-2 were upregulated. In the second study, both LVSF and LVEF were higher versus control and DA+ZnPP, a heme-oxygenase-1 (HO-1) inhibitor, matching with the decreased LV infarct size in DA rats. DA induced HO-1 and down regulated the expression of p47phox and the activation of Rac1, both regulatory subunits of the NADPH-oxidase. This was consistent with the decrease of ROS production and these DA effects were inhibited by ZnPP. Further experiments in humans are now required to prove benefits effects of DA and to promote the use of EPO as therapeutics in heart infarction.

La doxorubicine (DOX) est un médicament très efficace utilisé en chimiothérapie pour traiter de nombreuses tumeurs. Cependant, son utilisation clinique est limitée par des effets secondaires cardiotoxiques sévères causés par une augmentation de production de radicaux libres de l'oxygène (RLO) et de l'apoptose. De surcroit, une chimiothérapie pourrait être indiquée alors qu'une ischémie cardiaque est déjà installée. Dans cette thèse, nous avons donc examiné au niveau du cœur isolé de lapin et des cardiomyocytes en culture; d'une part, la cardiotoxicité de la DOX dans les conditions de l'ischémie/reperfusion (IR) myocardique et d'autre part, la cardioprotection assurée dans ces conditions par un antioxydant naturel puissant, le safran (SAF).D'abord nous avons procédé à une extraction méthanol-Eau des stigmates du safran cultivé au Liban. Une analyse par HPLC des principaux constituants a été réalisée afin de s'assurer de la qualité des extraits, suivie par des tests (xanthine/xanthine oxydase et électrolyse) comme sources de RLO pour rechercher le pouvoir antioxydant de ces extraits.La toxicité du SAF a été évaluée sur des cœurs isolés de lapin selon la technique de Langendorff et la dose thérapeutique optimale établie est de 10 μg/mL. Ensuite, la toxicité aigüe de la DOX a été testée sur des cœurs isolés sains traités ou non par la DOX et le SAF en comparaison avec des cœurs soumis à l'électrolyse ou à une période d'ischémie globale. La toxicité chronique de la DOX a été évaluée chez des lapins traités pendant 21 jours avec des extraits de SAF (par voie orale) et la DOX (par voie ip). Les cœurs ont été par suite isolés et soumis à une ischémie globale. D'après les études cardiodynamiques, anatomopathologiques et biochimiques; il apparaît que les extraits de safran protègent le cœur de la toxicité aigüe et chronique de la doxorubicine et assurent une protection optimale lors de la reperfusion. De plus, le SAF a inhibé l'apoptose induite par IR et DOX en activant la voie de survie AKT/mTOR, en augmentant le niveau de Troponine T et en inhibant l'expression de p-P38 tel que montré par les analyses de Western blot. Le safran contribuerai donc à améliorer nettement le retour des fonctions myocardiques vers la normale suite à l'IR et au traitement par la DOX.Les effets de la DOX et du SAF ont aussi été étudiés dans les cardiomyocytes H9c2 soumis à une IR simulée. Les effets des différents traitements ont été évalués par les tests MTT, LDH, Western blot, TMRM et caspases. Nos données prouvent que DOX et IR diminuent significativement la viabilité cellulaire ; inhibent la voie RISK ; réduisent les protéines contractiles ; activent les caspases 3 et provoquent la perte du potentiel de membrane mitochondrial. Ces effets ont été remarquablement inhibés par le traitement avec le SAF à la reperfusion. Les résultats suggèrent que le SAF a un effet protecteur contre la DOX et l'IR par un mécanisme impliquant la réduction de l'apoptose cardiaque, des RLO et du stress oxydatif. La cardioprotection du SAF est médiée par l'activation des voies de survie AKT/P70S6K et ERK ; augmentation de l'expression des protéines contractiles ; inhibition de la perméabilité des pores de transition mitochondrial et diminution de l'activité des caspases 3. En outre, nous avons montré que l'effet protecteur du SAF serait attribué à la crocine, son métabolite actif principal. Pris ensemble, nos résultats indiquent que la DOX exacerbe les lésions myocardiques de l'IR. Le traitement par le SAF à la reperfusion pourrait exercer des effets cardioprotecteurs contre la toxicité induite par la DOX via son activité antioxydante. Ainsi, nos travaux sur le safran se révèlent fort intéressants dans le développement d'une stratégie thérapeutique antioxydante potentielle afin de limiter la toxicité cardiaque de la DOX, ouvrant la voie à de futurs essais cliniques. / Doxorubicin (DOX) is a highly active chemotherapeutic drug used to treat many tumors. However, its clinical use is limited by severe cardiotoxic side effects. Previous studies have shown that DOX-Induced cardiotoxicity is mainly mediated through increased oxidative stress and apoptosis. In addition, DOX could be indicated in case of pre-Established myocardial ischemia. In this thesis we investigated, in isolated rabbit heart and cultured cardiomyocytes, the cardiotoxic effects of DOX in conditions of ischemia/reperfusion (IR). We also studied whether saffron (SAF), a natural compound that showed potent antioxidant activity, could exert cardioprotection against DOX and IR toxicity.First, the extraction of saffron stigmas grown in Lebanon was performed using methanol-Water mixture. HPLC analysis of the main components (safranal and crocines) was used to ensure the quality of the extracts; followed by tests (xanthine/xanthine oxidase and electrolysis) as sources of free radicals to determine the antioxidant activity of the sample.The toxicity of SAF was evaluated on isolated rabbit hearts according to Langendorff technique and the optimal therapeutic dose established is 10 μg/mL. Then, the acute toxicity of DOX was tested on isolated hearts treated with or without DOX and SAF compared with hearts subjected to electrolysis or a period of global ischemia (I 30 min/R 40 min). The chronic toxicity of DOX was evaluated in rabbits treated for 21 days with SAF extracts (orally) and DOX (ip). The hearts were afterward isolated and subjected to global ischemia (I 30 min/R 30 min). According to cardiodynamic, pathological and biochemical studies, it appears that saffron extracts protect the heart from the acute and chronic toxicity of doxorubicin, and ensure optimal protection during reperfusion. Furthermore, SAF inhibited IR and DOX-Induced apoptosis by activating the AKT/mTOR survival pathway, increasing Troponine T and inhibiting p-P38 expression as shown by Western blot analysis. Saffron could therefore significantly improve myocardial function to normal state following IR and DOX treatment.The effects of DOX and SAF were also investigated in H9c2 cardiomyocytes subjected to simulated IR injury. We evaluated the effects of the treatments by MTT assay, LDH release measurements and Western blot analysis. Apoptosis was assessed by Hoechst 33258 staining, TMRM probes and caspase activity. The results proved that DOX exacerbates cardiac cell injury when an underlying IR heart condition is present. Our data showed that DOX and IR significantly decreased cardiac cells viability; inhibited RISK cardioprotective pathway; reduced contractile proteins (α-Actinine, Troponine C and MLC); increased caspase 3 expression and induced loss of mitochondrial membrane potential. These effects were remarkably inhibited by treatment with SAF (10 μg/mL) at reperfusion. Our data suggested that SAF has a protective effect against DOX and IR induced cardiac apoptosis through a mechanism involving scavenging free radicals and reducing oxidative stress. SAF cardioprotection is mediated by activating survival pathways including AKT/P70S6K and ERK; increasing the expression of contractile proteins; inhibiting of mitochondrial permeability transition pore and decreasing caspase 3 activity. In addition, studies showed that protective activities of SAF belong to crocin, its major active metabolite.Taken together, our findings indicate that DOX exacerbates IR myocardial injury. The SAF treatment at reperfusion could exert cardioprotective effects against DOX induced toxicity by its antioxidant activity. Thereby, saffron offers a potential novel antioxidant therapeutic strategy to counteract doxorubicin cardiotoxicity, paving the way for future clinical trials.

OBJECTIF : L’intégrité vasculaire est une pierre angulaire de la viabilité des organes solides, notamment en cas de transplantation. L’objectif de ce travail est de décrire les modifications du réseau vasculaire du cortex rénal dues à une séquence d’ischémie-reperfusion (IR) induite dans un modèle préclinique porcin d’autotransplantation rénale. MATÉRIELS ET MÉTHODES : Nous avions mis en place une technique d’analyse de la microvascularisation corticale rénale après acquisition microscanner et traitement des images de reins de porc perfusés avec un polymère de silicone radio-opaque.RÉSULTATS : L’ischémie-reperfusion rénale induit une diminution corticale du volume du segment vasculaire associée à une raréfaction des microvaisseaux inférieurs à 30 µm en particulier dans la corticale interne. Dans le cortex, une augmentation de la connectivité caractérisée par une augmentation des bifurcations et une diminution du facteur d’arborescence a été observée. L’hypercholestérolémie associée à l’ischémie-reperfusion entraine une raréfaction microvasculaire dans la corticale moyenne. Trois mois post-autotransplantation, l’augmentation de la durée de conservation des greffons induit une augmentation significative de l’épaisseur de la zone corticale, un effondrement du pourcentage de microvaisseaux. CONCLUSION : Trois mois après autotransplantation rénale, l’ischémie-reperfusion induit une raréfaction des microvaisseaux de la corticale interne. Nos résultats suggéreraient que l’altération de la fonction rénale chez des greffons pourrait être liée à une hypoxie chronique et une fibrose induite par une raréfaction microvasculaire proportionnelle à la durée de la conservation. / Purpose:Vascular integrity is a cornerstone of organ viability, particularly in cases of transplantation. The aim of this study is to describe the modifications of renal cortex vascular network due to an ischemia-reperfusion sequence in a preclinical pig kidney autotransplantation model.MATERIALS AND METHODS: Porcine kidneys were perfused with a radio-opaque silicone polymer and the cortex studied by X-ray micro-computed tomography. RESULTS: Renal ischemia-reperfusion led to decreased vascular segment volume associated with the rarefaction of vessels less than 30 µm diameter, particularly in the inner cortex. Vessels showed higher connectivity throughout the cortex. The decrease in microvasculature correlated with a deterioration of renal function, proteinuria, and tubular dysfunction, and was associated with the development of fibrous tissue. The hypercholesterolemia associated with ischemia-reperfusion promoted concomitant microvascular rarefaction for small vascular segments particularly in the middle cortex. At M3, the hypothermic preservation for 48 H of grafts compared to 24 H induced a significant increase in the cortical area thickness, associated with a drastic decrease of microvessels. CONCLUSION: Three months after renal autotransplantation, ischemia reperfusion induces a rarefaction of microvessels of the internal cortex. The hypercholesterolemia leads to a renal microvascular rarefaction which accentuates vascular remodeling due to ischemia reperfusion. Our results suggest that long preservation duration impacting the renal function in grafts could be associated with chronic hypoxia and fibrosis related to microvascular rarefaction.