Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L'ischémie cérébrale induit une réponse inflammatoire aiguë et prolongée caractérisée par la production de cytokines, l'infiltration de leukocytes dans le cerveau, ainsi que l'activation des cellules gliales résidentes dont les microglies. Les microglies sont impliquées dans l'élimination des débris cellulaires, la production de cytokines proinflammatoires et de facteurs trophiques. Un rôle neuroprotecteur des microglies suite à une dégénérescence du SNC est proposé dans la littérature. Cependant, l'activation des cellules microgliales est aussi associée avec la sécrétion de molécules toxiques et l'atténuation de l'activation microgliale est bénéfique dans certaines maladies neurodegeneratives. Dans l'ischémie cérébrale, le rôle de la prolifération microgliale et de la dynamique de la réponse inflammatoire reste méconnu. L'analyse de la souris CDllb-TKmut³⁰ après l'ischémie cérébrale, a permis de montrer que l'élimination sélective des microglies en prolifération amplifie la réponse inflammatoire après l'ischémie cérébrale et augmente la taille de la lésion ischémique. La caractérisation de cette population a permis de déterminer que les premières cellules microgliales à proliférer sont les cellules résidentes exprimant le marqueur d'activation galectine-3. De plus, après l'ischémie cérébrale, cette population sert de source endogène d'IGF-1, une molécule neurotrophique. L'inactivation génétique de la galectine 3 chez la souris a permis de confirmer le rôle bénéfique de cette population microgliale ainsi que de lien potentiel entre la galectine 3 et l'induction de la réponse mitogénique d'IGF-1. De plus, l'étude longitudinale de l'activation des microglies à l'aide la souris transgénique TLR2-Fluc-GFP a permis de montrer que l'activation microgliale après l'ischémie cérébrale est biphasique et perdure plusieurs mois après l'attaque initiale. Deux sites majeurs d'activation ont pu aussi être détectés : la région ischémique et le bulbe olfactif. D'ailleurs, l'augmentation de signal au site de la lésion ischémique est toujours précédée par une augmentation significative du signal TLR2 dans le bulbe olfactif. Par leur position anatomique particulière, les cellules microgliales du bulbe olfactif sont plus sensibles aux signaux provenant autant de l'environnement que de l'intérieur du cerveau et pourraient servir de senseurs et/ou modulateurs de l'inflammation cérébrale. Les résultats obtenus par l'étude de différents modèles de souris transgéniques ont permis de montrer la dynamique de la réponse inflammatoire, le rôle neuroprotecteur des microglies en prolifération et le lien potentiel entre la galectine 3 et le facteur neuroprotecteur IGF-1

L'ischémie myocardique est caractérisée par la survenue de désordres ioniques et métaboliques responsables de la perte de l'intégrité structurale et fonctionnelle cellulaire, notamment au niveau des mitochondries et, en conséquence, de l'altération de l'activité électromécanique cardiaque. Dans le cadre de cette thèse, nous nous sommes intéressés : 1) à l'étude des lésions d'ischémie-reperfusion (I/R) et des moyens pharmacologiques de cardioprotection avec amlodipine (antagoniste calcique), perindorpilate (Inhibiteur de l'enzyme de conversion). Après avoir mis en évidence les différentes altérations électrophyiologiques, hémodynamiques, structurales et fonctionnelles mitochondriales induite par un épisode d'I/R, les molécules précédemment citées sont administrées seules ou en association, en bolus IV, avant l'induction de l'ischémie myocardique par ligature de l'artère interventriculaire antérieure dans sa partie distale et à une minute seulement après la reperfusion (Etude I, n=36 porcelets domestiques) ; 2) à la cardiotoxicité aigue d'un anesthésique local en l'occurrence la lévobubivacaine à la suite d'une injection intravasculaire (IV). Cette toxicité a été évaluée dans deux situations distinctes : circulation coronaire préservée ou ischémie myocardique. Ces deux situations permettent de « mimer » respectivement une intoxication à la levobupivacaïne chez un sujet sain ou coronarien ; 3) à l'effet bénéfique éventuel des émulsions lipidiques (Intralipid®) dans les mêmes conditions expérimentales. Les émulsions lipidiques ont été administrées quelques minutes après l'injection (IV) de la levobupivacaïne (Etude II, n=48 porcelets domestiques). Ces études ont été menées, in vivo, sur des porcs anesthésiés et ventilés. Les paramètres électrophysiologiques et hémodynamiques ont été déterminés tout au long de l'expérimentation à des intervalles réguliers. A la fin des expériences, les animaux ont été euthanasiés et des fragments de ventricule gauche ont été prélevés pour l'évaluation structurale cellulaire et fonctionnelle mitochondriale / Myocardial ischemia is characterized by the development of ionic and metabolic disorders that result in the loss of the structural and functional cellular integrity, especially within mitochondria and, consequently, in alterations of cardiac electromechanical activity. In the context of this thesis, the following aspects have been investigated: (1) ischemia-reperfusion (I/R) lesions and pharmacological measures of cardioprotection involving the calcium antagonist amlodipine, and the converting enzyme inhibitor perindorpilate. After describing the various electrophysiological, hemodynamic, and mitochondrial (both structural and functional) alterations induced by I/R, amlodipine and perindorpilate were administered either alone or combined, via a bolus IV injection, prior to a distal ligation of the anterior interventricular artery, and then one minute after reperfusion (Study II; n = 36 domestic piglets); (2) the acute cardiotoxicity of the local anesthetic levobupivacaine following an IV injection. Cardiotoxic effects were evaluated in two distinctive situations: preserved coronary circulation and experimental myocardial ischemia. Using both situations allows for mimicking levobupivacaine overdose in a healthy patient or a patient with coronary disease, respectively; (3) the possibly beneficial effect of lipid emulsions (Intralipid®) in both experimental conditions. Lipid emulsions were administered a few minutes following the IV injection of levobupivacaine (Study II, n=48 domestic piglets). These investigations were conducted in vivo on piglets anesthetized and ventilated. Electrophysiological and hemodynamic parameters were measured at given intervals throughout the study. At the end of the study, the animals were sacrificed and tissue samples of the left ventricles were withdrawn to measure the structure and function of mitochondria

La paralysie cérébrale (PC) affecte 3/1000 nouveau-nés. Les conditions pathologiques menant à la PC sont de natures infectieuse-inflammatoire et/ou hypoxique-ischémique (HI). Ce projet a eu comme objectif de caractériser un modèle animal de lésions cérébrales à un temps où la maturité cérébrale du raton est comparable à celle du nouveau-né humain à terme. L'hypothèse est que les cytokines pro-inflammatoires IL-1[bêta] et TNF-[alpha] jouent un rôle dans l'induction des lésions cérébrales. Matériel et Méthodes : Ce modèle animal est composé de cinq conditions expérimentales : CTL, sham , LPS, HI, et LPS+HI. Brièvement, une injection i.p de LPS à une dose de 200[micro]g/kg a été réalisée 4h avant une ligature permanente de la carotide commune droite suivie d'une hypoxie (8% O[indice inférieur 2]) pendant 2h30-3h30. Les ratons ont été sacrifiés à différents temps post-HI afin d'analyser l'expression d'IL-1[bêta], d'IL-1Ra et de TNF-[alpha] cérébrales. L'expression in situ des cellules CD68+, Iba-1+ et GFAP+ a été analysée par IF. L'IRM et l'histologie ont été utilisés afin de caractériser les dommages cérébraux. Des injections de bloquants de cytokines pro-inflammatoires ont été effectuées. Résultats : Des dommages cérébraux ont été induits dans les conditions HI«LPS, sélectivement dans l'hémisphère cérébral droit, et étaient maximaux lors de la combinaison des agression [sic]. Une surexpression des cytokines IL-1[bêta], IL-1Ra, et TNF-[alpha] a été induite dans l'hémisphère droit exposé à l'HI«LPS. Une gliose a été détectée au sein des lésions cérébrales. Certains déficits cognitifs et moteurs ont été observés dans la condition LPS+HI. L'administration systémique des bloquants de cytokines n'a pas réduit les dommages cérébraux aux doses utilisées. Conclusions : Dans ce modèle animal, l'HI«LPS a induit des dommages cérébraux similaires à ceux observés chez le nouveau-né humain à terme. Les déficits cognitifs et comportementaux induits sont caractéristiques de la PC. Bien qu'il y ait une forte induction intracérébrale d'IL-1[bêta] et de TNF-[alpha], les essais de neuroprotection ont suggérés que ces cytokines ne sont pas impliquées dans la genèse des lésions cérébrales à ce stade de développement.

L’effet neuroprotecteur des agents anesthésiques est maintenant établi depuis plus de 30ans. Cependant, les mécanismes impliqués restent imparfaitement élucidés. A cours de cetravail nous avons étudié deux volets de leur protection :La première partie porte sur l’implication de la transmission glutaminergique dans leurseffets neuroprotecteurs directs, c'est-à-dire lorsqu’ils sont utilisés au cours d’une l’ischémiecérébrale. Nous avons étudié deux agents anesthésiques de classe distincte: le propofol et lesévoflurane sur des co-cultures de neurones et d’astrocytes corticaux de rat soumis à uneprivation en oxygène et en glucose transitoire (POG). Nous avons ainsi observé que laprésence de propofol ou de sévoflurane pendant la POG prévenait la mort neuronale,l’accumulation de glutamate extracellulaire et la diminution de la capture du glutamateinduites par l’ischémie. Nous avons également montré que cette restauration partielle del’activité de capture du glutamate impliquait des transporteurs distincts entre le propofol et lesévoflurane.La deuxième partie a porté sur la neuroprotection obtenue par un préconditionnement (PC)pharmacologique liée à l’utilisation avant l’ischémie d’agents anesthésique volatils. Nousavons tout d’abord confirmé in vitro l’existence d’une telle protection avec le sévoflurane etmis en évidence le rôle primordial, au cours de cette protection, des canaux potassiques ATPdépendantset des radicaux libres. Puis sur un modèle in vivo d’occlusion transitoire del’artère cérébrale moyenne, le PC par sévoflurane a induit une neuroprotection supérieure àcelle obtenue avec l’utilisation de sévoflurane uniquement pendant l’ischémie. Cependantcette protection est transitoire et ne perdure pas dans le temps. Le sévoflurane ne fait queretarder, sans l’empêcher, la mort neuronale liée à l’apoptose. Il offre cependant une fenêtrethérapeutique intéressante. / The neuroprotective effect of anesthetic agents is now established for over 30 years.However, the mechanisms involved remains to be fully explored. This work focuses on twoneuroprotective strategies:The first part is on the involvement of glutamatergic transmission in their directneuroprotective effects. We studied the effect of two separate classes of anesthetic agents:propofol and sevoflurane on co-cultures of cortical neurons and astrocytes from rats subjectedto a transient oxygen and glucose deprivation (OGD) mimicking cerebral ischemia. Weobserved that the presence of propofol or sevoflurane during OGD prevented neuronal death,accumulation of extracellular glutamate and decreased uptake of glutamate induced byischemia. We also demonstrated that this partial restoration of glutamate uptake mediated bypropofol and sevoflurane involved differential transporters.The second part deals with the neuroprotection achieved by pharmacologicalpreconditioning with regard to the use of volatile anesthetic agents before ischemia. We firstconfirmed in vitro the existence of such protection with sevoflurane. We also highlighted therole of ATP-dependent potassium channels and reactive oxygen species in sevofluranepreconditioning-induced neuroprotection. Then, using an in vivo model of focal transientischemia, we showed that sevoflurane preconditioning significantly improved functionaloutcome and reduced infarct volume. However, this protection was transient. Sevofluraneonly delayed the neuronal death associated with apoptosis but offers an interesting therapeuticwindow.

L’artériopathie oblitérante des membres inférieurs conduit progressivement au rétrécissement des artères qui assurent la vascularisation des membres inférieurs. Il en résulte une ischémie des tissus irrigués par ces artères et à terme, en cas d’occlusion artérielle, une ischémie critique conduisant à une amputation du membre. De nouvelles stratégies de thérapie cellulaire basées sur l’injection de cellules progénitrices capables d’induire une angiogenèse thérapeutique se sont développées ces dernières années. Cependant le faible taux d’incorporation des cellules transplantées dans le tissu ischémique limite le développement de ces nouvelles approches. Dans ce contexte, mon travail de thèse a consisté à étudier deux approches thérapeutiques distinctes pouvant améliorer les thérapies pro-angiogènes. La première étude porte sur le fucoïdane, polysaccharide sulfaté d’origine naturelle, antithrombotique favorisant la formation de nouveaux vaisseaux sanguins dans le modèle murin d’ischémie du membre inférieur. Nous avons montré qu’il induisait le recrutement de monocytes en améliorant leur adhésion à l’endothélium activé en condition dynamique, ainsi que leur adhésion à la matrice et leur transmigration in vitro. Cette action est médiée par l’activation des voies de signalisation ERK et p38 et la sécrétion de métalloprotéinases 9. De plus, le fucoïdane entraine une polarisation des macrophages de type pro-angiogènes in vitro. Il augmente leur recrutement dans le muscle ischémié permettant de réduire ainsi la phase inflammatoire post-ischémique, la nécrose et de favoriser le processus de cicatrisation. La deuxième étude porte sur le rôle des neuropilines (NRP), co-récepteurs du VEGF (facteur de croissance pro-angiogène) exprimés à la surface des ECFC, afin de comprendre leur implication au niveau moléculaire dans le mécanisme d’action pro-angiogène des ECFCs et optimiser l’efficacité de la thérapie cellulaire. A l’aide du système d’extinction par ARN interférent, nous avons découvert un mécanisme de compensation jamais étudié auparavant puisque l’inhibition de NRP1 entraine une augmentation de celle de NRP2 et une diminution de la prolifération et de la migration des ECFCs. En revanche, l’extinction de NRP2 n’a pas d’effet sur l’expression de NRP1, mais induit une augmentation de l’adhésion des ECFCs à la matrice extracellulaire associée à une augmentation de la phosphorylation des ERK1/2. / Vascular diseases such as Peripheral Arterial Disease may evolve towards critical limb ischemia, requiring revascularization or amputation. New strategies of cell therapy based on the injection of progenitor cells able to induce therapeutic angiogenesis have been recently developed. However the low level of incorporation of transplanted cells in the ischemic tissue limits the development of these new approaches. In this context, my thesis was to study two different therapeutic approaches that can improve the pro-angiogenic therapies. The first focuses on fucoidan, a marine sulphated polysaccharide with antithrombotic properties. We have previously shown promising angiogenic properties of fucoidan in vivo. We found that fucoidan increases monocyte recruitment and improves their adhesion to activated endothelium under dynamic condition. It also increases in vitro transmigration. This action is mediated by the activation of ERK and p38 signaling pathways and metalloproteinase 9 secretion. Further, fucoidan can lead macrophage polarization to the pro-angiogenic type in vitro. It increases macrophage recruitment in ischemic muscle that could reduce post-ischemic inflammatory phase and necrosis leading to healing process. The second study focuses on the role of neuropilin (NRP), co-receptors of VEGF (pro-angiogenic growth factor). The aim of this part was to understand their involvement in the pro-angiogenic properties of ECFC at molecular level and optimize the efficiency of cell therapy. Using siRNA, we found a compensation mechanism never studied before. The NRP1 inhibition leads to an increase in the NRP2 expression and a decrease of ECFC proliferation and migration. The NRP2 silencing has no impact on NRP1, but induces ECFC adhesion to the extracellular matrix correlated with an increased level of ERK1 / 2 phosphorylation.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L'infarctus du myocarde (IDM) est consécutif à une occlusion coronaire provoquant une ischémie prolongée. La taille de l'infarctus est le déterminant majeur de la récupération du myocarde et de la survie du patient. La reperfusion coronaire la plus précoce (par thrombolyse ou angioplastie) est reconnue comme étant le seul traitement recommandé. Cependant, malgré les effets bénéfiques, la reperfusion s'accompagne d'effets délétères appelés « lésions de reperfusion ». Récemment, l'efficacité du postconditionnement ischémique (PostC) a été démontrée en clinique. Il permet, lorsqu'il est utilisé au cours de l'angioplastie primaire ou de sauvetage, de réduire significativement la taille de l'infarctus. L'application du protocole de PostC reste cependant limitée aux patients admis dans les centres d'angioplastie, ce qui exclut tous les patients thrombolysés. Afin d'améliorer la cardioprotection, il est nécessaire de déterminer la fenêtre thérapeutique temporelle optimale d'administration du PostC. De plus, il est nécessaire de développer des stratégies thérapeutiques nouvelles, adjuvants de la reperfusion, qui pourront être administrées dès que le diagnostic d'IDM est posé. L'objectif de notre travail a donc été d'étudier l'influence du délai d'application du PostC sur l'efficacité de cardioprotection dans un modèle murin d'ischémie-reperfusion et de rechercher des substances pharmacologiques cardioprotectrices. Nos travaux révèlent que l'efficacité du PostC est maintenue s'il est appliqué les 30 premières minutes après le début de la reperfusion. D'autre part, nous avons évalué le potentiel thérapeutique de peptides inhibiteurs ciblant l'apoptose responsable de la mort cellulaire au cours de l'ischémie-reperfusion. L'utilisation de peptides Tat-BH4 et Pip2b-BH4 pour le traitement des lésions d'ischémie-reperfusion myocardique a fait l'objet d'une étude preuve-de-concept in vivo. Les constructions peptidiques inhibant l'interaction FAS-DAXX, injectées en intraveineuse au moment de la reperfusion, induisent une diminution de 50% de la taille d'infarctus et de l'apoptose. Ils ont fait l'objet d'un dépôt de brevet car ils constituent des outils pharmacologiques à haut potentiel thérapeutique. / Myocardial infarction (MI) results from a coronary occlusion leading to severe ischemia. Infarct size is a major determinant of myocardial salvage and mortality. Prompt revascularization (either by thrombolysis or primary angioplasty) is recommended for AMI patients but leads to deleterious effects called "reperfusion injury". Recently, ischemic postconditioning (PostC) efficiency has been reported in patients. However, its application during primary angioplasty is limited to patients admitted in angioplasty centers thereby excluding thrombolysed patients. In order to improve cardioprotection, it is necessary to define the time window for optimal cardioprotection and to develop new pharmacological strategies for AMI patients. Our work, using an in vivo mouse model of ischemia-reperfusion, shows that PostC efficiency is maintained if applied the first 30 minutes after the onset of reperfusion. Furthermore, we evaluated the therapeutic potential of peptide inhibitors targeting apoptosis, which is responsible for cell death during ischemia-reperfusion. As a proof-of-concept study, the cardioprotective effects of Tat-BH4 and Pip2b-BH4 peptidic constructs have been revealed in vitro and in vivo. The peptidic constructs targeting FAS-DAXX interaction, injected intravenously as a single bolus at the time of reperfusion, reduced by 50% both infarct size and apoptosis. These pharmacological tools have been patented due to their high therapeutic potential.

Le diabète prédispose à des complications affectant divers organes comme le systémecardiovasculaire. La cardiopathie ischémique chez les patients diabétiques pourrait être liée àl'accumulation de produits avancés de glycation (AGEs). Dans les coeurs de rats ischémiques,l'expression des récepteurs aux AGEs et de ses ligands est considérablement augmentée etimpliquée dans les lésions de l'ischémie / reperfusion (I / R), même en absence de diabète. Ila été récemment rapporté que le myocarde humain diabétique ne peut pas être protégé par lepréconditionnement. Dans ce contexte, notre hypothèse était que le préconditionnement β1-adrénergique pourrait être modifié en présence d'AGE. En utilisant un modèle de coeur isolénon travaillant de rat, cette étude a pour but d’étudier les effets des AGEs sur lacardioprotection induite par la stimulation des récepteurs β1-adrénergiques (β1-ARs) par lexamotérol (xa). Les effets bénéfiques induits par le xa pendant la reperfusion ont étésupprimés par l'administration de l’albumine glyquée (Alb-Gly) pendant la perfusion du xa,tandis que l’albumine (Alb) n’a pas modifié cette protection. Ces résultats suggèrent que lesAGEs suppriment la cardioprotection résultant de l'activation de la voie β1-AR ce quicontribue à des dommages cardio-vasculaires chez les patients diabétiques.D’ autre part, le pyridoxal 5’-phosphate (PLP), un métabolite naturel de la pyridoxine qui estun antagoniste des récepteurs purinergiques, empêche la surcharge cellulaire en calcium etpeut réduire les dommages d'ischémie-reperfusion. Plusieurs travaux ont mis en evidence unediminution des taux du PLP chez les patients souffrant d'un infarctus du myocarde par rapportà un groupe témoin sain. Plus récemment, il a été signalé qu’un taux bas de PLP confère unrisque indépendant de maladie coronaire. Cette corrélation de la réduction du PLP chez lespatients souffrant d’infarctus est soutenue par les effets préventifs de la vitamine B6 sur lesmaladies coronaires et le diabète. Plusieurs travaux ont montré que le PLP et la pyridoxaminepréviennent la progression de la néphropathie induite par la STZ chez les rats diabétiques eninhibant la formation des AGEs. En utilisant un modèle de coeur isolé non-travaillant de rat,cette étude a examiné les mécanismes de préconditionnement pharmacologique (PC) induitpar la stimulation des récepteurs P2Y par le pyridoxal-5'-phosphate (PLP). La suppression del'effet cardioprotecteur du PLP par le MRS2578, antagoniste des récepteurs P2Y6 et parl’U73122 qui bloque la phospholipase C est en accord avec l’implication du récepteur P2Y6dans le préconditionnement. La suppression de l'effet cardioprotecteur du PLP par l'AMPαS,antagoniste des récepteurs P2Y11, l’H89 inhibiteur de la PKA et par l’U73122 démontrel’implication aussi des récepteurs P2Y11 dans ce préconditionnement. L’exposition préischémique à des concentrations nanomolaires de PLP protège contre les lésions de l’ I / R.P2Y11 et P2Y6 représentent ainsi les récepteurs candidats les plus probables pour le PCcardiaque induit par le PLP. / Diabetes predisposes to complications affecting various organs such as cardiovascular system.Ischemic heart disease in diabetic patients might be linked to the accumulation ofadvanced-glycation end products (AGEs). In ischemic rat hearts, expression of receptor forAGEs and its ligands is significantly enhanced and involved in cardiac ischemia/reperfusion(I/R) injury even in the absence of diabetes. It has recently been reported that diabetic humanmyocardium cannot be protected by preconditioning. In this context, our hypothesis was thatβ1-adrenergic preconditioning might be altered in the presence of AGEs. Using an isolatednon-working rat heart model, this study investigated the effect of AGEs on cardioprotectioninduced by transient β1-adrenoceptor (β1-AR) stimulation with xamoterol (xa). The beneficialeffects induced by xa during reperfusion were suppressed by the administration of glycatedalbumin (Gly-Alb) during xa infusion, whereas albumin (Alb) did not hamper xa inducedprotection. These results suggest that AGEs suppress the cardioprotection resulting from theactivation of β1-ARs and thus might contribute to cardiovascular damages seen in diabeticpatients.Pyridoxal 5'-phosphate (PLP), a natural metabolite of pyridoxine which is an antagonist ofpurinergic receptors prevents cellular calcium overload and may reduce ischemia-reperfusioninjury. Low plasma pyridoxal-5′-phosphate levels have been observed in patients sufferingfrom myocardial infarction, when compared with a healthy control group. More recently, lowPLP level has been reported to confer an independent risk for coronary artery disease. Thefact that this correlation of PLP reduction in infarct patients has functional importance issupported by the preventive effects of vitamin B6 on coronary heart disease and diabetes. PLPprevented progression of nephropathy in STZ-induced diabetic rats by inhibiting formation ofAGEs. Using an isolated non-working rat heart model, this study investigated the mechanismsof pharmacological pre-conditioning (PC) induced by P2Y receptor stimulation withpyridoxal-5’-phosphate (PLP). The suppression of the cardioprotective effects of PLP byMRS2578 and U73122 is in agreement with the P2Y6 receptor as a receptor for PLP-inducedPC.The suppression of the cardioprotective effects of PLP by AMPαS, the PKA inhibitor (H89),and (U73122) is in agreement with the P2Y11 receptor as a receptor for PLP-induced PC.Pre-ischemic exposure to nanomolar concentrations of PLP is protective against I/R. P2Y11and P2Y6 represent the most likely candidate receptors for PLP-induced cardiac PC.