Submitted by Marlene Santos (marlene.bc.ufg@gmail.com) on 2018-08-01T17:33:51Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Maythsulene Inácio de Sousa Oliveira - 2015.pdf: 3135445 bytes, checksum: a08e11c7f2df635f3ff7726cfde58f49 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2018-08-02T11:09:15Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Maythsulene Inácio de Sousa Oliveira - 2015.pdf: 3135445 bytes, checksum: a08e11c7f2df635f3ff7726cfde58f49 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-02T11:09:15Z (GMT). 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In both cases, identification at species level is an important step to manage this root pathogen complex, whose detection can be improved by molecular biology tools. Therefore, this study aimed to: 1) to develop and validate a multiplex PCR (m-PCR) method for simultaneous identification of three common bean pathogens, F. oxysporum f. sp. phaseoli, F. solani and C. flaccumfaciens pv. flaccumfaciens; and 2) develop an isothermal amplification of DNA (LAMP) method to detect of F. oxysporum f. sp. phaseoli on seeds. M-PCR method was developed for identification of isolated colonies, as well as infected seeds. In seeds, total DNA was obtained by alkaline lysis method, which inactivates nucleases during the extraction process. M-PCR allowed the identification of all pathogens, with detection of C. flaccumfaciens pv. flaccumfaciens, F. oxysporum f. sp. phaseoli and F. solani amplicons in agarose gel with respectively 306, 609 and 143 base pairs. Furthermore, m-PCR also reduced costs and time to detect Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli from 10 days to three hours. It was not possible to develop an optimized protocol for detection of F. oxysporum f. sp. phaseoli by the LAMP method, using only the tf1 gene for design of primers, since such primers were functional only for amplifying large amounts of target DNA. Based on the negative results with LAMP, it is suggested that further studies should be performed using other DNA sequences available in GenBank database. / O feijoeiro-comum (Phaseolus vulgaris L.) é cultivado durante todo o ano no território brasileiro, em três épocas distintas e em vários agroecosistemas. Nestes ambientes distintos, a cultura está exposta a diversos fatores que causam perdas de rendimento, como o ataque de patógenos. Dentre as doenças do feijoeiro-comum encontram-se a murcha-de-fusarium (Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli), a podridão-radicular-seca (Fusarium solani) e a murcha-de-curtobacterium (Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens) que apresentam sintomas semelhantes, dificultando seu diagnóstico no campo, e cuja identificação em testes de sanidade de sementes também é limitada. Em ambos os casos, a identificação em nível de espécie é uma importante etapa do manejo deste complexo de patógenos, cuja detecção pode ser aperfeiçoada com a adoção de ferramentas de biologia molecular. Portanto, este estudo teve como objetivos: 1) Desenvolver e validar um método de multiplex PCR (m-PCR) para identificação simultânea de três espécies de patógenos do feijoeiro-comum, F. oxysporum f. sp. phaseoli, F. solani e C. flaccumfaciens pv. flaccumfaciens; e 2) desenvolver a técnica de amplificação isotérmica de DNA (LAMP) para detecção de F. oxysporum f. sp. phaseoli em sementes. O método de m-PCR foi desenvolvido para identificação de colônias isoladas bem como sementes infectadas. Nas sementes, o DNA total foi obtido pela lise alcalina, método que inativa nucleases durante o processo de extração. A m-PCR possibilitou a identificação de todos os patógenos, com detecção de C. flaccumfaciens pv. flaccumfaciens, F. oxysporum f. sp. phaseoli e F. solani em bandas formadas em gel de agarose respectivamente com 306, 609 e 143 pares de base. Além disso, a extração do DNA total das sementes pela lise alcalina em combinação com a m-PCR também possibilitou redução de custos e tempo de realização do diagnóstico de Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli, de 10 dias para três horas. Não foi possível estabelecer um protocolo otimizado para detecção de F. oxysporum f. sp. phaseoli pelo método LAMP, utilizando somente o gene tf1 para desenho dos iniciadores, uma vez que, os iniciadores revelaram-se funcionais apenas para a amplificação com grandes quantidades de DNA alvo. Diante dos resultados obtidos com LAMP, sugere-se que estudos posteriores sejam realizados empregando outras sequências de DNA disponíveis no banco de dados GenBank.

Le matériau étudié est un alliage Al A356, utilisés pour produire des têtes de cylindres pour l'industrie automobile par fonderie. Le matériau présente une microstructure dendritique assez grossière dans une matrice eutectique, avec une taille moyenne de grains de 25 microns, des précipités intermetalliques et des porosités. Les propriétés de traction sont fortement affectées par la température d'essai, avec une baisse assez sensible du module de Young, de la limite d'élasticité lorsque la température augmente. La durée de vie de fatigue isotherme chute de façon marquée (approximativement d'un facteur 10) lorsque la température d'essai est portée de 120 à 280 °C, en déformation imposée. Du essais thermomecaniques cycliques en phase, avec une température variant de 120 à 280 °C, on montré que la durée de vie en anisotherme est assez similaire à celle obtenue en conditions isothermes à 280 oC. Dans ce cas, les dommages causés par le chargement thermomécanique cyclique se produisent à la température la plus élevée du cycle. Les essais de relaxation ont montré l'existence de deux comportements distincts. À basse température, le matériau présente de l'écrouissage cyclique tandis qu'il s'adoucit cycliquement à des températures plus élevées. A partir des résultats de croissance des fissures de fatigue, on a observé que la température et la forme du cycle de fatigue a une forte influence sur la vitesse de fissuration par fatigue ainsi que sur le facteur d'intensité des contraintes seuil. Une loi de comportement élastique visco-plastique non-isotherme a été identifiée pour le matériau. Les paramètres de comportement mécanique sont statistiquement distribués du fait de la fabrication du matériau par fonderie. Toutefois, il a été démontré que le modèle était capable de se reproduire, avec une approximation raisonnable, les essais contrainte-déformation à des températures différentes, pour le cas isotherme et anisotherme. / The studied material is an A356 Al alloy, used to produce engine cylinder heads for the automotive industry by die casting process. The material displays a quite coarse dendritic microstructure in a eutectic matrix, with a mean grains size of 25 microns, intemetallic precipitates and porosities. The tensile properties are strongly affected by testing temperature, with a quite sensitive drop of the Young's modulus, the Yield stress as the temperature was raised. The isothermal fatigue life dropped of markedly (approximately 10 times) when the testing temperature is raised from 120 to 280 °C, under strain control. From the themomechanical in-phase cyclic tests, with temperature varying from (120 to 280 oC), it was possible to observe that life is quite similar to the isothermal fatigue test at 280 oC. In this case, the more sensitive damage caused the in-phase mechanical and thermal cycle take place at the highest temperature. Relaxation tests indicated two distinct behaviors, with the temperature of 240°C being a threshold. At lower temperatures, the material hardens cyclically whereas it softens cyclically at higher temperatures. From the fatigue crack growth results, it was observed that temperature and wave shape has a strong influence on the crack growth rate as well as on the stress intensity threshold. Considering sinusoidal wave shape (10 Hz), as the temperature increased the DKth decreased and the crack propagation rate increased. However, the rate as da/dN change with temperature is quite similar, as an indicative that the micromechanism of crack growth has not changed due to the high frequency used, and it was due only to loss of mechanical strength. An elastic-visco-plastic non-isothermal constitutive law was identified for the material. For the cast material studied in this work, the mechanical behavior parameters are statistically distributed. However, it was shown that the model was able to reproduce, with a reasonable approximation, the stress – strain relationship at different temperatures, for the isothermal and anisothermal cases. / Para caracterizar componentes usados em aplicações de alta responsabilidade não basta apenas conhecer a composição química e os resultados de ensaios de tração, impacto e dureza, pois estes podem não fornecer os subsídios necessários que permitam prever, de maneira confiável, o comportamento dos componentes nas condições reais de trabalho. Exemplo disto são os cabeçotes de motor automotivos, submetidos a tensões térmicas e mecânicasrelativamente altas durante seu uso normal e altíssimo em condições extremas. Durante longos tempos de funcionamento e eventuais falhas na refrigeração e ou lubrificação a temperatura pode chegar a valores próximos de 300ºC. Esta variação de temperaturas provoca choques térmicos que podem gerar trincas e/ou uma grande quantidade de deformação plástica em regiões próximas aos pistões. Desconsiderando a presença de choques térmicos provocadospor falhas, ainda assim, uma pequena quantidade de ciclos de acionamento e parada do motor, é considerada como os principais causadores de pequenas trincas. Isso indica que o surgimento de trincas em cabeçotes de motor deve ser considerado um problema de fadiga termomecânica de baixo ciclo. Outro problema é a heterogeneidade microestrutural no componente devido ao processo de fundição, levando a propriedades mecânicas e físicas diferentes em uma mesma peça. Além da presença de porosidade gerada por bolhas de gás e vazios de solidificação, que podem adquirir tamanho tal que se aproximem de pequenas trincas, diminuindo a vida para a nucleação e assim mudando o foco do problema para o de propagação de trinca por fadiga. A proposta deste trabalho foi a de determinar as propriedades de fadiga isotérmica e termomecânica através de ensaios de fadiga de baixo ciclo, bem como as propriedades de propagação de trinca por fadiga, relaxação, caracterização microestrutural e modelagem do comportamento mecânico por elementos finitos para a liga de alumínio utilizada na fabricação de cabeçotes de motores automotivos pela indústria nacional. Todos os ensaios e análises computacionais foram realizados nos laboratórios da Universidade de São Paulo (EESC-USP) e da École Normale Supérieure de Cachan (ENS-LMT). Os ensaios de fadiga isotérmica foram realizados nas temperaturas de 120ºC e 280ºC e os ensaios termomecânicos foram realizados em fase entre as temperaturas de 120ºC e 280ºC. Os ensaios de relaxação foram realizados em várias temperaturas com carregamento de onda trapezoidal, enquanto que os ensaios de propagação de trinca por fadiga foram realizados nas temperaturas de 120ºC, 200ºC e 280ºC para arregamentos de onda senoidal e trapezoidal em controle de carga e de deslocamento. Foi feita também análise microestrutural nos corpos de prova, após os ensaios de fadiga, por microscopia óptica e por microscopia eletrônica de varredura MEV.Os resultados destes ensaios mostraram que os defeitos de fundição e a falta de homogeneidade no material, aliados a longos tempos de exposição a carregamentos e em altas temperaturas, constituem um fator crítico no desempenho do componente. Estes resultados ajudarão a estabelecer modelos precisos de previsão de vida para os cabeçotes de motor.

Gradientes térmicos induzidos no interior de componentes sujeitos a variações de temperatura durante o período de funcionamento podem provocar a ocorrência de tensões e deformações internas. A repetição destes ciclos térmicos pode causar a nucleação e a propagação de trincas por um processo denominado fadiga termomecânica. Este trabalho apresenta um estudo sobre o comportamento da liga de alumínio A356-T6, processada nas condições fundida e tixoextrudada, sob fadiga isotérmica e termomecânica. Foram realizados ensaios de fadiga de baixo ciclo isotérmica para as temperaturas de 120 e 280°C, e ensaios de fadiga termomecânica em-fase e fora-de-fase para a faixa de temperatura de 120 a 280°C. O material tixoextrudado apresentou melhor desempenho em fadiga nas condições isotérmica e anisotérmica (termomecânica) devido a uma microestrutura globular com menor nível de porosidade. / Thermal gradients induced in components during service under temperature changes can cause internal stresses and strains. This cyclic thermal behavior can cause crack nucleation and propagation under a process denominated thermomechanical fatigue. Permanent mold casting and tixoextruded A356-T6 aluminum alloy behavior under isothermal and thermomechanical fatigue was study in this work. Isothermal low cycle fatigue tests were performed in temperatures of 120 and 280°C. In-phase and out-of-phase thermomechanical fatigue tests were carried out in temperature range from 120 to 280°C. The tixoextruded material presented better isothermal and thermomechanical fatigue performance due to a globular microstructure and lower porosity level.

A doença de Chagas, causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi, é uma doença tropical que enseja morte/morbidade de milhões de pessoas na América Latina. Por processos migratórios, vem-se estendendo ao sul dos Estados Unidos, Canadá, Europa, Austrália e Japão. Essa doença tem sido considerada super-negligenciada pela indústria farmacêutica, já que os dois fármacos disponíveis para o seu tratamento foram introduzidos há mais de quarenta anos e apresentam baixa eficácia com vários efeitos colaterais severos. Mais recentemente, a Organização Mundial da Saúde considerou a doença de Chagas, dentre outras, como a doença da pobreza! Com esse cenário completamente desfavorável aos portadores da doença, é necessária a descoberta, desenvolvimento e introdução de novos fármacos para o tratamento eficiente e seguro da doença de Chagas. <br />Dentro desse contexto, este trabalho representa uma importante contribuição para o entendimento das razões moleculares da ação farmacológica de substâncias químicas bioativas de interesse à farmacoterapia da doença de Chagas. Ao nível molecular, a enzima pertencente à via de síntese de novo de nucleotídeos de pirimidinas, diidroorotato desidrogenase do Trypanosoma cruzi (TcDHODH), é um alvo promissor para a descoberta e desenvolvimento de candidatos a fármacos de interesse para o tratamento da doença de Chagas. <br />Os conceitos e ferramentas da química medicinal computacional, tais como os ensaios virtuais in silico, foram usados para a identificação de inibidores da TcDHODH. Vinte e seis substâncias inéditas como inibidores da TcDHODH foram adquiridos comercialmente e avaliados experimentalmente através da Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC) para a determinação do mecanismo de inibição e da constante cinética de afinidade (Kiapp). <br />Na etapa de docagem molecular, o objetivo era identificar moléculas que apresentassem uma boa afinidade pelo sítio ativo da enzima TcDHODH. A primeira série de ligantes selecionados dos métodos in silico, apresentou inibição enzimática na concentração de micromolar com eficiência média de ligante de 0,50 kcal mol-1 átomo-1. Devido à baixa massa molecular (aproximadamente 200 kDa) e a alta eficiência de ligante, essa série foi considerada como constituída de excelentes substâncias com elevado poder de reconhecimento biomolecular. Por isso, foram caracterizadas como substâncias passíveis de otimização no processo do-ligante-para-substância matriz. <br />As enzimas TcDHODH e DHODH de Leishmania major (LmDHODH) têm sítios ativos com elevado grau de similaridade. Portanto, usando a enzima LmDHODH como padrão de substituição da TcDHODH é possível fazer a descrição do modo de interação do co-complexo TcDHODH-inibidor. O modo de ação descrito através da resolução da estrutura cristalográfica de raios-X, além de validar ortogonalmente os resultados cinéticos obtidos por ITC - que identificou as substâncias como inibidores competitivos (por interação direta no sítio ativo da enzima TcDHODH), geraram hipóteses farmacofóricas para a busca de novas moléculas (chamadas de segunda geração), agora com padrão superior de reconhecimento molecular do sítio da TcDHODH. Para validar complementarmente a hipótese, foi demonstrado que os inibidores da TcDHODH inibem, similarmente, a LmDHODH. <br />Uma análise cuidadosa da estrutura tridimensional da enzima TcDHODH, demostrou a possibilidade de ocupação do sítio S2 que se estende além da região do sítio catalítico S1, permitindo assim o aumento da afinidade biomolecular com os inibidores. Além disso, o sítio S2 não é encontrado na estrutura da proteína de humanos (HsDHODH), podendo ser uma região passível de seletividade frente à enzima TcDHODH. <br />O emprego adequado dessa hipótese resultou na otimização dos ligantes identificados previamente para substâncias mais potentes que inibiram a enzima de forma competitiva em relação ao substrato diidroorotato (DHO) em valores Kiapp de 121 &plusmn; 14 nM e 190 &plusmn; 10 nM. <br />A técnica de ITC foi fundamental no processo de descoberta de inibidores enzimáticos, pois se mostrou extremamente susceptível à determinação da interação intermolecular enzima-inibidor, permitindo acompanhar a cinética da reação e obter os valores da constante de afinidade de maneira precisa e acurada. Com isso, a taxa de acerto obtida nesta tese foi de 46%, considerando-se apenas as substâncias com valores de Ki app < 100 &micro;M. Esse é um número favoravelmente apreciável, já que na literatura ele gira em torno de 1-10% quando o planejamento in silico é realizado, quando comparado às taxas de acerto dos métodos de ensaio em larga escala (HTS), entre 0-2 %, os resultados alcançados neste trabalho são ainda mais significativos. <br />Além disso, as substâncias químicas selecionadas através da integração de métodos in silico e biocalorimétricos apresentam elevado grau de complexidade no processo biomolecular de interação enzima-ligante, que permite classificá-las para as fases seguintes da gênese planejada de fármacos. / American trypanosomiasis or Chagas disease, caused by the haemoflagellate Trypanosoma cruzi, is a tropical disease that affects millions of people in Latin America. Epidemiology of Chagas disease in non-endemic countries is attained by immigration as the disease also affects people in the United States, Canada, Europe, Australia and Japan. However, the United States are not to be written off as an area of nonendemicity for Chagas disease like Europe or Asia because the southern states have enzootic T. cruzi transmission that involves triatomine species and hosts such as raccoons, opossums, and domestic dogs. Even though, this disease has been considered as a super-neglected from the big Pharma Industry viewpoint since the only available drugs for its treatment were introduced in the market more than forty years ago and worsen is that they have low efficacy and cause various severe side effects. <br />Although the current clinical scenario is of course discouraging and is far from being even a soothing treatment for those who suffer from the disease, it prompt ones to set efforts towards the need of discovering and developing new efficacious and safe drugs to treat Chagas disease. <br />Our research group covers the concept of enzymes acting as targets for the action of drugs. Once T. cruzi has many druggable targets, the dihydroorotate dehydrogenase enzyme (TcDHODH) that belongs to the de novo pyrimidine nucleotide synthetic pathway has been chosen for the search of new inhibitors that may be of use in the treatment of Chagas disease. To accomplish with this and considering that inhibitors are molecules that decrease enzyme activity leading to parasite death, we used the concepts and tools of modern computational medicinal chemistry such as in silico screening of small molecules that bind to the active site of the TcDHODH. <br />After a thoroughly program of virtually screening thousands of compounds, 26 were purchased from commercially available sources and experimentally assayed against the TcDHODH using Isothermal Titration Calorimetry (ITC) in order to determine the mechanism of inhibition and the kinetic affinity constant (Kiapp). <br />The first series of inhibitors selected from our in silico strategy were evaluated by ITC to yield compounds that inhibited the TcDHODH in the micromolar concentration range with an average of 0.50 kcal mol-1 atom-1 ligand efficiency (LE). Because the assayed compounds have low molecular weight (ca. 200 kDa) and high LE, which bring them to the specific bimolecular pattern recognition all of them were considered good inhibitors capable of being selected to enter the hit-to-lead optimization process. <br />The detailed description of the ligand-enzyme mode of binding (MOB) is thoroughly accomplished by solving the X ray crystal structure of the surrogate Leishmania major DHODH enzyme (LmDHODH), which has a high degree of similarity with the enzyme TcDHODH. The MOB credited to be in the active site of the TcDHODH orthogonally validated the ITC kinetic experimental data obtained for all ligands as competitive inhibitors that interact at the active site of the TcDHODH and helped to generate pharmacophoric hypotheses for the search of new second generation molecules acting against the enzyme TcDHODH.  Analyzing the 3D structure of the TcDHODH along with its surrogate LmDHODH, we envisaged the possibility of compounds to extend their side chain beyond the region of the catalytic site (called S1), and interacting in a region called S2, so to increase binding affinity. Moreover, the TcDHODH S2 site that is not found in the 3D protein structure of humans (HsDHODH) is likely to offer new insights for the search of inhibitors whose binding to this S2 site can pave the roads towards the needed structural basis for selective inhibition of TcDHODH. <br />The most potent compounds inhibited the enzyme competitively with respect to the substrate dihydroorotate (DHO) at Kiapp values of 121 &plusmn; 14 nM and 190 &plusmn; 10 nM, which constitutes high affinity TcDHODH inhibitors. The ITC technique was pivotal to this process of enzyme inhibitors discovery, because it proved to be extremely sensitive thus allowing to monitor the kinetics of the reaction and to obtain precise and accurate values of affinity constants. <br />The hit rate obtained in this work, considering only those compounds with Kiapp < 100 &micro;M, was 46%. This is a really high number, since literature values range from 1 to 10% when the planning new inhibitors via in silico methods when compared to the success rates obtained by the methods of testing on large scales (HTS), 0-2 %, the results achieved in this work are even more significant. Moreover, the compounds selected through the integration of in silico and calorimetric methods showed a high degree of complexity in the process of bimolecular enzyme-ligand recognition, which allows to pass them to the next phase of the drug design process.

A doença de Chagas, causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi, é uma doença tropical que enseja morte/morbidade de milhões de pessoas na América Latina. Por processos migratórios, vem-se estendendo ao sul dos Estados Unidos, Canadá, Europa, Austrália e Japão. Essa doença tem sido considerada super-negligenciada pela indústria farmacêutica, já que os dois fármacos disponíveis para o seu tratamento foram introduzidos há mais de quarenta anos e apresentam baixa eficácia com vários efeitos colaterais severos. Mais recentemente, a Organização Mundial da Saúde considerou a doença de Chagas, dentre outras, como a doença da pobreza! Com esse cenário completamente desfavorável aos portadores da doença, é necessária a descoberta, desenvolvimento e introdução de novos fármacos para o tratamento eficiente e seguro da doença de Chagas. <br />Dentro desse contexto, este trabalho representa uma importante contribuição para o entendimento das razões moleculares da ação farmacológica de substâncias químicas bioativas de interesse à farmacoterapia da doença de Chagas. Ao nível molecular, a enzima pertencente à via de síntese de novo de nucleotídeos de pirimidinas, diidroorotato desidrogenase do Trypanosoma cruzi (TcDHODH), é um alvo promissor para a descoberta e desenvolvimento de candidatos a fármacos de interesse para o tratamento da doença de Chagas. <br />Os conceitos e ferramentas da química medicinal computacional, tais como os ensaios virtuais in silico, foram usados para a identificação de inibidores da TcDHODH. Vinte e seis substâncias inéditas como inibidores da TcDHODH foram adquiridos comercialmente e avaliados experimentalmente através da Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC) para a determinação do mecanismo de inibição e da constante cinética de afinidade (Kiapp). <br />Na etapa de docagem molecular, o objetivo era identificar moléculas que apresentassem uma boa afinidade pelo sítio ativo da enzima TcDHODH. A primeira série de ligantes selecionados dos métodos in silico, apresentou inibição enzimática na concentração de micromolar com eficiência média de ligante de 0,50 kcal mol-1 átomo-1. Devido à baixa massa molecular (aproximadamente 200 kDa) e a alta eficiência de ligante, essa série foi considerada como constituída de excelentes substâncias com elevado poder de reconhecimento biomolecular. Por isso, foram caracterizadas como substâncias passíveis de otimização no processo do-ligante-para-substância matriz. <br />As enzimas TcDHODH e DHODH de Leishmania major (LmDHODH) têm sítios ativos com elevado grau de similaridade. Portanto, usando a enzima LmDHODH como padrão de substituição da TcDHODH é possível fazer a descrição do modo de interação do co-complexo TcDHODH-inibidor. O modo de ação descrito através da resolução da estrutura cristalográfica de raios-X, além de validar ortogonalmente os resultados cinéticos obtidos por ITC - que identificou as substâncias como inibidores competitivos (por interação direta no sítio ativo da enzima TcDHODH), geraram hipóteses farmacofóricas para a busca de novas moléculas (chamadas de segunda geração), agora com padrão superior de reconhecimento molecular do sítio da TcDHODH. Para validar complementarmente a hipótese, foi demonstrado que os inibidores da TcDHODH inibem, similarmente, a LmDHODH. <br />Uma análise cuidadosa da estrutura tridimensional da enzima TcDHODH, demostrou a possibilidade de ocupação do sítio S2 que se estende além da região do sítio catalítico S1, permitindo assim o aumento da afinidade biomolecular com os inibidores. Além disso, o sítio S2 não é encontrado na estrutura da proteína de humanos (HsDHODH), podendo ser uma região passível de seletividade frente à enzima TcDHODH. <br />O emprego adequado dessa hipótese resultou na otimização dos ligantes identificados previamente para substâncias mais potentes que inibiram a enzima de forma competitiva em relação ao substrato diidroorotato (DHO) em valores Kiapp de 121 &plusmn; 14 nM e 190 &plusmn; 10 nM. <br />A técnica de ITC foi fundamental no processo de descoberta de inibidores enzimáticos, pois se mostrou extremamente susceptível à determinação da interação intermolecular enzima-inibidor, permitindo acompanhar a cinética da reação e obter os valores da constante de afinidade de maneira precisa e acurada. Com isso, a taxa de acerto obtida nesta tese foi de 46%, considerando-se apenas as substâncias com valores de Ki app < 100 &micro;M. Esse é um número favoravelmente apreciável, já que na literatura ele gira em torno de 1-10% quando o planejamento in silico é realizado, quando comparado às taxas de acerto dos métodos de ensaio em larga escala (HTS), entre 0-2 %, os resultados alcançados neste trabalho são ainda mais significativos. <br />Além disso, as substâncias químicas selecionadas através da integração de métodos in silico e biocalorimétricos apresentam elevado grau de complexidade no processo biomolecular de interação enzima-ligante, que permite classificá-las para as fases seguintes da gênese planejada de fármacos. / American trypanosomiasis or Chagas disease, caused by the haemoflagellate Trypanosoma cruzi, is a tropical disease that affects millions of people in Latin America. Epidemiology of Chagas disease in non-endemic countries is attained by immigration as the disease also affects people in the United States, Canada, Europe, Australia and Japan. However, the United States are not to be written off as an area of nonendemicity for Chagas disease like Europe or Asia because the southern states have enzootic T. cruzi transmission that involves triatomine species and hosts such as raccoons, opossums, and domestic dogs. Even though, this disease has been considered as a super-neglected from the big Pharma Industry viewpoint since the only available drugs for its treatment were introduced in the market more than forty years ago and worsen is that they have low efficacy and cause various severe side effects. <br />Although the current clinical scenario is of course discouraging and is far from being even a soothing treatment for those who suffer from the disease, it prompt ones to set efforts towards the need of discovering and developing new efficacious and safe drugs to treat Chagas disease. <br />Our research group covers the concept of enzymes acting as targets for the action of drugs. Once T. cruzi has many druggable targets, the dihydroorotate dehydrogenase enzyme (TcDHODH) that belongs to the de novo pyrimidine nucleotide synthetic pathway has been chosen for the search of new inhibitors that may be of use in the treatment of Chagas disease. To accomplish with this and considering that inhibitors are molecules that decrease enzyme activity leading to parasite death, we used the concepts and tools of modern computational medicinal chemistry such as in silico screening of small molecules that bind to the active site of the TcDHODH. <br />After a thoroughly program of virtually screening thousands of compounds, 26 were purchased from commercially available sources and experimentally assayed against the TcDHODH using Isothermal Titration Calorimetry (ITC) in order to determine the mechanism of inhibition and the kinetic affinity constant (Kiapp). <br />The first series of inhibitors selected from our in silico strategy were evaluated by ITC to yield compounds that inhibited the TcDHODH in the micromolar concentration range with an average of 0.50 kcal mol-1 atom-1 ligand efficiency (LE). Because the assayed compounds have low molecular weight (ca. 200 kDa) and high LE, which bring them to the specific bimolecular pattern recognition all of them were considered good inhibitors capable of being selected to enter the hit-to-lead optimization process. <br />The detailed description of the ligand-enzyme mode of binding (MOB) is thoroughly accomplished by solving the X ray crystal structure of the surrogate Leishmania major DHODH enzyme (LmDHODH), which has a high degree of similarity with the enzyme TcDHODH. The MOB credited to be in the active site of the TcDHODH orthogonally validated the ITC kinetic experimental data obtained for all ligands as competitive inhibitors that interact at the active site of the TcDHODH and helped to generate pharmacophoric hypotheses for the search of new second generation molecules acting against the enzyme TcDHODH.  Analyzing the 3D structure of the TcDHODH along with its surrogate LmDHODH, we envisaged the possibility of compounds to extend their side chain beyond the region of the catalytic site (called S1), and interacting in a region called S2, so to increase binding affinity. Moreover, the TcDHODH S2 site that is not found in the 3D protein structure of humans (HsDHODH) is likely to offer new insights for the search of inhibitors whose binding to this S2 site can pave the roads towards the needed structural basis for selective inhibition of TcDHODH. <br />The most potent compounds inhibited the enzyme competitively with respect to the substrate dihydroorotate (DHO) at Kiapp values of 121 &plusmn; 14 nM and 190 &plusmn; 10 nM, which constitutes high affinity TcDHODH inhibitors. The ITC technique was pivotal to this process of enzyme inhibitors discovery, because it proved to be extremely sensitive thus allowing to monitor the kinetics of the reaction and to obtain precise and accurate values of affinity constants. <br />The hit rate obtained in this work, considering only those compounds with Kiapp < 100 &micro;M, was 46%. This is a really high number, since literature values range from 1 to 10% when the planning new inhibitors via in silico methods when compared to the success rates obtained by the methods of testing on large scales (HTS), 0-2 %, the results achieved in this work are even more significant. Moreover, the compounds selected through the integration of in silico and calorimetric methods showed a high degree of complexity in the process of bimolecular enzyme-ligand recognition, which allows to pass them to the next phase of the drug design process.

Tesis por compendio / [ES] Debido a la preocupación por la contaminación derivada del uso de los plásticos y la gran cantidad de residuos generados a nivel mundial, se desarrollaron diferentes compuestos plásticos reforzados con fibras naturales respetuosos con el medio ambiente (WPC) para su caracterización y optimización. En primer lugar, se utilizó polietileno de alta densidad de base biológica (BioHDPE) como matriz polimérica y diferentes fibras cortas naturales como el cáñamo, el lino y el yute. Se mezclaron mediante extrusión de doble husillo y se moldearon en piezas mediante moldeo por inyección, se añadió un copolímero de injerto de etileno con anhídrido maleico (PE-g-MA) a dos partes por cien de resina al WPC durante el proceso de extrusión para reducir la falta de compatibilidad entre las fibras lignocelulósicas y la matriz polimérica. Como resultado, se observó en el análisis térmico, una ligera mejora de la estabilidad térmica de los compuestos reforzados con las tres fibras, aumentado la temperatura de fusión y de degradación del compuesto. Además, también aumentó la absorción de agua de los compuestos. Se obtuvo, especialmente, un aumento drástico del módulo de Young y de la resistencia al impacto de los compuestos con refuerzo de fibra de cáñamo. Debido a estos resultados, a continuación, se realizó un estudio con la misma matriz polimérica (BioHDPE) y diferentes porcentajes (2,5 a 40,0% en peso) de fibras cortas de cáñamo (HF) como refuerzo natural, utilizando la misma técnica por fusión y extrusión de doble husillo del compuesto que se moldeo por inyección. También se utilizó como agente compatibilizante, el copolímero maleinizado, de injerto de etileno con anhídrido maleico (PE-g-MA) para mejorar la escasa compatibilidad entre la matriz de BioHDPE altamente no polar y las fibras lignocelulósicas altamente hidrofílicas. El 40% en peso de fibra dio como resultado un aumento importante del módulo de Young y la resistencia al impacto del BioHDPE, obteniendo valores de 5275 MPa y 3,6 kJ/m2, respectivamente, en comparación con el bioHDPE puro de 826 MPa y 2,0 kJ/m2. En cuanto al cambio de color de las muestras inyectadas, se observó que el aumento de fibra generó una clara modificación en las tonalidades finales de las piezas, alcanzando colores muy similares a las maderas oscuras para porcentajes superiores al 20%.Finalmente, se desarrollaron nuevos composites de alto rendimiento mediomabiental utilizando un 30% de fibra corta de cáñamo y como matriz polimérica copolímero de polibutilén succinato-co-adipato paracialmente de origen renovable (BioPBSA). En este caso, para mejorar la interacción entre la fibra y la matriz no solo se empleó el injerto copolímero de PBSA injertado con anhídrido maleico (PBSA-g-MA), sino que se utilizaron diferentes aditivos por extrusión reactiva al composite como aditivos derivados del ácido itacónico de base biológica, como el dibutil itaconato (DBI) y un copolímero de PBSA injertado con ácido itacónico (PBSA-g-IA). La introducción de fibras de cáñamo, dieron como resultado una mejora en la rigidez del polímero base, el módulo de tracción del BioPBSA puro 281 MPa aumentó considerablemente alcanzando valores de 3482 MPa. Los compuestos con DBI obtuvieron una mejora en la ductilidad y una disminución en las propiedades de tracción, en contraste con las muestras compatibles con copolímeros que mejoraron la resistencia a la tracción. / [CA] Degut a la preocupació per la contaminació derivada de l'us dels plàstics i la gran quantitat de residus generats a nivell mundial, es desenvoluparen diferents compostos reforçats amb fibres naturals respectuoses amb el medi ambient (WPC) per a la seva caracterització i optimització. En primer lloc, es va utilitzar polietilè d'alta densitat de base biològica (BioHDPE) com a matriu polimèrica i diferents fibres curtes naturals com el cànem, el lli i jute. Es van fondre mitjançant extrusió de doble tornavís i es moldejaren en peces mitjançant moldejat per injecció, es va afegir un copolímer d'empelt d'etlé i anhídrid maleic (PE-g-MA) a dues parts per cent de resina al WPC durant el procés d'extrusió per a reduir la falta de compatibilitat entre les fibres lignocel·lulòsiques i la matriu polimèrica. Com a resultat, es va observar en l'anàlisis tèrmica, una lleugera millora de l'estabilitat tèrmica dels compostos reforçats amb les tres fibres , augmentant la temperatura de fusió i de degradació dels compostos. Es va obtenir, especialment, un augment dràstic del mòdul de Young i de la resistència a l'impacte dels compostos amb reforç de fibra de cànem. Degut a aquestos resultats, a continuació es va realitzar un estudi amb la mateixa matriu polimèrica (BioHDPE) i diferents percentatges (2,5 a 40,0% en pes) de fibra curta de cànem (HF) com a reforç natural, utilitzant la mateixa tècnica per fusió i extrusió de doble tornavís del compost que es va moldejar per injecció. També es va utilitzar com agent compatibilitzant, el copolímer meleinitzat, anhídrid maleic d'empelt de polietilè (PE-g-MA) per millorar l'escassa compatibilitat entre la matriu de BioHDPE altament no polar i les fibres lignocel·lulòsiques altament hidrofíliques. El 40% en pes de fibra va donar com a resultat un augment important del mòdul de Young i la resistència a l'impacte del BioHDPE, obtenint valors de 5275 MPa i 3,6 kJ/m2, respectivament, en comparació amb el bioHDPE pur de 826 MPa i 2,0 kJ/m2. En quant al canvi de color de les mostres injectades, es va observar que l'augment de fibra va generar una clara modificació en les tonalitats finals de les peces, aconseguint colors molt similars a les fustes fosques per a percentatges superiors al 20%.Finalment, es van desenvolupar nous composites d'alt rendiment medioambiental utilitzant un 30% de fibra curta de cànem i com a matriu polimèrica copolímer de polibutilèn succinat-co-adipat paracialment d'origen renovable (BioPBSA). En aquest cas, per millorar la interacció entre la fibra i la matriu no només es va emprar l'empelt copolímer de PBSA empeltat amb anhídrid maleic (PBSA-g-MA), sinó que es van utilitzar diferents additius per extrusió reactiva al composite com a additius derivats de l'àcid itacònic de base biològica, com el dibutil itaconat (DBI) i un copolímer de PBSA empeltat amb àcid itacònic (PBSA-g-IA). La introducció de fibres de cànem, van donar com a resultat una millora en la rigidesa del polímer base, el mòdul de tracció del BioPBSA pur 281 MPa va augmentar considerablement aconseguint valors de 3482 MPa. Els compostos amb DBI van obtenir una millora en la ductilitat i una disminució en les propietats de tracció, en contrast amb les mostres compatibles amb copolímers que van millorar la resistència a la tracció. / [EN] Due to the concern about the pollution derived from the use of plastics and the large amount of waste generated worldwide, different environmentally friendly natural fiber reinforced plastic compounds (WPC) were developed for their characterization and optimization. First, bio-based high-density polyethylene (BioHDPE) was used as the polymer matrix and different natural short fibers such as hemp, flax and jute. They were fused by twin screw extrusion and molded into pieces by injection molding. Polyethylene graft maleic anhydride (PE-g-MA) was added at two parts per hundred resin to the WPC during the extrusion process to reduce the lack of compatibility between the lignocellulosic fibers and the polymeric matrix. As a result, a slight improvement in the thermal stability of the composites reinforced with the three fibers was observed in the thermal analysis, increasing the melting temperature and degradation of the composite. In addition, it also increased the water absorption of the compounds. In particular, a drastic increase in the Young's modulus and the impact resistance of the hemp fiber reinforced composites was obtained. Due to these results, a study was then carried out with the same polymeric matrix (bioHDPE) and different percentages (2,5 to 40,0% by weight) of short hemp fibers (HF) as natural reinforcement, using the same technique by melt compunding and extrusion with a twin screw extruder, followed by injection moulding. The maleinized copolymer, polyethylene graft maleic anhydride (PE-g-MA) was also used as a compatibilizing agent to improve the poor compatibility between the highly non-polar BioHDPE matrix and the highly hydrophilic lignocellulosic fibers. The 40 wt% fiber resulted in a significant increase in Young's modulus and impact strength of BioHDPE, obtaining values of 5275 MPa and 3.6 kJ/m2, respectively, compared to pure bioHDPE of 826 MPa and 826 MPa. 2.0kJ/m2. Regarding the color change of the injected samples, it was observed that the increase in fiber generated a clear change in the final shades of the pieces, reaching colors very similar to dark wood for percentages greater than 20%.Finally, new green composites were developed using 30% short hemp fiber and a partically biobased polybutylene succinate-co-adipate copolymer (BioPBSA) as polymeric matrix. In this case, to improve the interaction between the fiber and the matrix, not only was the PBSA graft copolymer grafted with maleic anhydride (PBSA-g-MA) used, but different additives were used by reactive extrusion to the composite as additives derived from the Bio-based itaconic acid, such as dibutyl itaconate (DBI) and a copolymer of PBSA grafted with itaconic acid (PBSA-g-IA). The introduction of hemp fibers resulted in an improvement in the stiffness of the base polymer, the tensile modulus of pure BioPBSA 281 MPa increased considerably, reaching values of 3482 MPa. Composites with DBI obtained an improvement in ductility and a decrease in tensile properties, in contrast to samples compatible with copolymers that improved tensile strength. / Agradecer al Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER) de la Unión Europea por cofinanciar el proyecto “NABITEX—Textiles técnicos innovadores basados en fibras naturales SUDOE para ser aplicados en el Sector del Hábitat” a través del Programa SUDOE de Interreg (SOE2/P1/ P0524). / Dolçà Camáñez, C. (2022). Desarrollo y optimización de wood plastic composites con matriz biopolimérica y fibras naturales [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/185679 / Compendio