L’épidermolyse bulleuse simplex (EBS) est une maladie orpheline dermatologique qui a une prévalence mondiale de 1/50 000 à 1/30 000. Elle est caractérisée par des mutations transmises de manière autosomale dominante dans les gènes de la kératine 5 (KRT5) et 14 (KRT14), menant à une agrégation des filaments intermédiaires. Phénotypiquement, il y a présence d’ampoules causées par un décollement de l’épiderme. Jusqu’à présent, aucune thérapie efficace n’est disponible. Dans cette étude, des essais cellulaires évaluant le potentiel thérapeutique de deux chaperonnes chimiques, le triméthylamine N-oxyde (TMAO) et le sodium 4-phénylbutyrate (4-PBA), ont été réalisés. Pour ce faire, trois lignées immortalisées de kératinocytes de patients EBS ayant une mutation dans KRT14 et une lignée contrôle ont été utilisées pour déterminer la capacité des molécules à réduire le nombre de cellules ayant des agrégats. Les résultats ont montré un effet bénéfique significatif du TMAO seulement, et ce dans deux lignées uniquement. Ainsi, le TMAO se qualifie comme une approche thérapeutique potentielle.

L'épiderme est un tissu stratifié, majoritairement constitué de kératinocytes qui forme la première barrière de l'organisme contre les agressions extérieures. Après blessure cutanée, la migration des kératinocytes est une phase cruciale de la cicatrisation. Le comportement des kératinocytes est placé sous le contrôle des molécules de la matrice extracellulaire ainsi que par les facteurs solubles (facteurs de croissance et cytokines..) sécrétés dans le microenvironnement. Les cellules résidentes ou recrutées sur le site de lésion libèrent également des nucléotides extracellulaires (ATP, UTP) dans l'environnement des kératinocytes. Dans ce travail de thèse, nous avons examiné l'impact des nucléotides extracellulaires et du récepteur purinergique P2Y2 sur la migration des kératinocytes et sur l'activité motogénique de deux facteurs de croissance, l'IGF-I et de l'EGF. Dans un premier temps, nous avons pu montrer que l'activation de P2Y2 et de la protéine hétérotrimérique Gαq inhibe l'activité de l'isoforme p110α de la PI3K sur des cellules stimulées par l'IGF. Cette inhibition de la voie PI3K/Akt aboutit à une perturbation de la mobilisation de la cortactine et de la formation des lamellipodes ainsi qu'une diminution de la vitesse de migration des kératinocytes. Dans un second temps, nous avons mis en évidence que l'activation de P2Y2 inhibe l'activation de la voie ERK1/2 par l'EGF en inhibant la phosphorylation des protéines MEK1/2, ERK1/2 et p90RSK. Nous avons établi que la conséquence de cette inhibition est la stabilisation des hémidesmosomes / The epidermis is a stratified tissue, mainly composed of keratinocytes, that forms the first barrier of the organism. When skin injury occurs, the epidermis structure is altered and many signalling pathways are activated in order to re-establish its homeostasis. Among these signalling pathways, the PI3K and MAPK ERK1/2 pathways play key roles by controlling keratinocyte migration and proliferation. The aim of this thesis was to analyse the regulation of these two signalling pathways by extracellular nucleotides, acting through purinergic receptors P2Y2 and the heterotrimeric Gαq protein and to evaluate the impact of this receptor on keratinocyte migration. Firstly, we showed that P2Y2 receptor activation inhibits PI3K p110α isoform and consequently alters keratinocyte cell shape and migration. Additionally, we showed that purinergic signalling activation inhibits EGF-induced ERK1/2 pathway activation by inhibiting the phosphorylation of MEK1/2, ERK1/2 and p90RSK proteins. As a consequence, P2Y2 stabilizes α6β4 integrin localisation into hemidesmosome-like structures and inhibits keratinocyte migration. The involvement of purinergic signalling pathway in regulation of different signalling events suggests that it may play a central role in regulation of cellular events that occurred during skin wound healing process. Moreover, our present data in association with those of the literature show that extracellular nucleotides can act as a double-edged sword in the regulation of cell migration: either activate or block cell migration in a striking cell-specific manner.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les protéasomes jouent un rôle majeur dans la protéolyse intracellulaire non-lysosomale et interviennent de ce fait dans la régulation de toutes les voies biologiques intracellulaires ainsi que dans la production des peptides antigéniques présentés au système immunitaire. La biosynthèse du protéasome 20S (le cœur protéolytique) est un processus complexe qui met en œuvre plusieurs protéines chaperonnes qui facilitent l'assemblage des sous-unités entre elles pour former d’abord des « hémi-protéasomes ». Ces hémi-protéasomes s'unissent ensuite deux à deux pour créer le protéasome 20S. La Protéine de Maturation du Protéasome (POMP) est une chaperonne « clé » de l’assemblage du protéasome: son hyperexpression induit une augmentation des activités protéolytiques du protéasome et une augmentation d’expression de plusieurs de ses sous-unités. Cette surexpression augmente également la longévité de la levure Saccharomyces cerevisiae, et augmente ses capacités de résistance au stress oxydant. L’activité protéolytique et l’expression des sous-unités des protéasomes sont augmentées dans l’épiderme psoriasique. Nos précédents résultats étaient en faveur d’une régulation post-transcriptionnelle de cette expression. Nous avons émis l’hypothèse que POMP était impliquée dans la biosynthèse accrue du protéasome dans la peau psoriasique. L'objectif de cette thèse a donc été d’étudier l’assemblage du protéasome et l’expression de POMP dans la peau psoriasique et au cours de la différenciation kératinocytaire. L'expression des protéasomes et de POMP a été évaluée au niveau protéique et au niveau des ARN messagers par Immuno-Histochimie, Western-blots et RT-PCR. L’assemblage du protéasome a été étudié par électrophorèse en conditions non dénaturantes, à partir de lysats de peaux psoriasiques ou de kératinocytes. L’expression de POMP a été modulée avec des ARN interférents dans des lignées HaCaT. Nous avons observé que les protéasomes 26S et 20S (et leur activité protéolytique) étaient augmentés dans la peau psoriasique lésée, de même que les régulateurs PA28β, PA28γ, PA200 et la sous-unité RPT4 du 19S. Ces résultats suggèrent que toutes les formes majeures des protéasomes sont augmentées dans la peau psoriasique. POMP est surexprimée dans l’épiderme psoriasique et associée à des précurseurs du protéasome. Au cours de la différenciation des cellules HaCaT, l’assemblage des protéasomes 20S et 26S et l’expression de POMP augmentent aux temps précoces (3 premiers jours) alors qu’aux temps plus tardifs les protéasomes 26S se désassemblent. Ce profil de désassemblage (marqué par la diminution du protéasome 26S, l’augmentation du protéasome 20S et l'accumulation du complexe régulateur 19S) est très similaire à celui observé au cours du stress oxydatif. L’inhibition forte de l'expression de POMP a un effet anti-proliferatif et pro-apoptotique via l’inhibition de l’assemblage du protéasome dans les lignées kératinocytaires. Une inhibition plus modérée diminue l’expression des marqueurs de différenciation kératine 10 et involucrine au cours de la différenciation calcium-induite des HaCaT. L’ensemble de ces résultats suggère que l’augmentation de l’assemblage, de l’activité et de la quantité des protéasomes dans l’épiderme psoriasique est liée (au moins en partie) à la surexpression de POMP et que la dérégulation de POMP pourrait altérer la prolifération et la différenciation kératinocytaires. Nos travaux sont donc en faveur de l’implication de POMP et de l’assemblage du protéasome dans la pathogénie du psoriasis. Le ciblage thérapeutique de POMP pourrait potentiellement avoir une action anti-proliférative et anti-inflammatoire (via notamment l’inhibition de NF-κB) et représente donc une perspective thérapeutique intéressante dans le psoriasis. / Proteasomes play a major role in non-lysosomal intracellular proteolysis and thereby are involved in the regulation of all intracellular biological pathways as well as in the production of antigenic peptides presented to the immune system. The biosynthesis of the 20S proteasome (proteolytic core) is a complex process that requires several chaperone proteins that facilitate the assembly of the subunits to form "hemi-proteasomes" that then combine in pairs to create the 20S proteasome. Proteasome Maturation Protein (POMP) is a key chaperone for proteasome assembly: its overexpression induces an increase in proteolytic activities of the proteasome and an increase in expression of several of its subunits. This overexpression also increases the longevity of the yeast Saccharomyces cerevisiae and increases its capabilities of resistance against oxidative stress. The proteolytic activity and expression of the proteasome subunits are increased in psoriatic epidermis. Our previous findings suggested a post-transcriptional regulation of this expression. We hypothesized that POMP was involved in the increased biosynthesis of proteasome in psoriatic skin. The objective of the thesis project was to study proteasome assembly and POMP expression in psoriatic skin and during keratinocyte differentiation. The expression of proteasomes and POMP has been evaluated at the protein and mRNA levels by immunohistochemistry, Western blots and RT-PCR. Proteasome assembly was studied by electrophoresis under non-denaturing conditions, from lysates of psoriatic skin or keratinocytes. POMP expression was modulated by RNA interference in HaCaT cell lines. We observed that proteasomes 26S and 20S (and their proteolytic activity) were increased in the lesional psoriatic skin, as well as the proteasome regulators PA28β, PA28γ, PA200 and the 19S subunit RPT4. These results suggest that all the major proteasomal forms are increased in psoriatic skin. POMP is overexpressed in psoriatic epidermis and associated with precursors of the proteasome. During the differentiation of HaCaT cells, the assembly of 20S and 26S proteasomes and POMP expression increases at early time (first 3 days), while in later times 26S proteasomes disassemble. This disassembly profile (marked by the decrease of the 26S proteasome, the increase of the 20S proteasome complex and the accumulation of its 19S regulator) is very similar to that observed during oxidative stress. The strong inhibition of POMP expression has an anti-proliferative and pro-apoptotic effect via inhibition of proteasome assembly in the HaCaT keratinocyte cell line. However a moderate inhibition decreases the expression of differentiation markers keratin 10 and involucrin during calcium-induced differentiation of these cells. All these results suggest that the increase of the assembly, the activity and amount of proteasomes in psoriatic epidermis are linked (at least partially) to the overexpression of POMP and that deregulation of POMP could alter keratinocyte proliferation and differentiation. Our work is therefore in favor of the involvement of POMP and assembly of the proteasome in the pathogenesis of psoriasis. Therapeutic targeting of POMP could potentially have anti-proliferative and anti-inflammatory effects (particularly through the inhibition of NF-κB) and therefore represents an interesting therapeutic perspective in psoriasis.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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L’épidermolyse bulleuse simplex (EBS) est caractérisée par un décollement intra-épidermique au niveau de la couche basale de l’épiderme aboutissant à la formation de bulles et de cloques cutanées. L’EBS est causée par des mutations au niveau des gènes qui codent pour la kératine 5 (K5) ou la kératine (K14), qui sont transmises majoritairement selon un mode autosomique dominant. L’EBS affecte environ 1/50 000 à 1/30 000 personnes dans le monde et elle est considérée comme une maladie orpheline. Dans cette étude, les kératinocytes ont été isolés de biopsies de la peau de patients atteints d’EBS ayant des mutations dans le gène KRT14 et de témoins non atteints. Des essais thérapeutiques utilisant l’interféron gamma (IFN-γ) ont été réalisés afin de stimuler la production de la K15. Les résultats ont révélé que l’IFN-γ réduit l’expression et la production de la K15 contrairement à ce que suggérait la littérature. Cette discordance pourrait s’expliquer par un effet « régulateur » de l’IFN-γ sur la K15 lorsque les cellules seraient activées. Cette hypothèse a été validée par l’augmentation de l’expression de la KRT16 qui est considérée comme un marqueur de préactivation des kératinocytes. Ainsi, l’IFN-γ ne semble pas être une cible thérapeutique potentielle pour l’EBS causée par une mutation de KTR14 (R125S).

Le traitement des maladies de la peau ainsi que des plaies étendues chroniques ou aiguës par thérapie cellulaire sont révolutionnaires. La préservation des cellules souches épithéliales dans les cultures de kératinocytes et lors de la production de substituts cutanés est cruciale au succès clinique de ces traitements. L'objectif général de ce projet de doctorat était d'approfondir les connaissances sur la préservation de ces cellules souches. D'abord, les travaux décrits dans cette thèse ont permis de mieux comprendre quels facteurs contribuent à l'établissement d'une niche et donc à la préservation des cellules souches épithéliales dans des substituts cutanés. Ceci a été accompli par une revue systématique des études cliniques décrivant la greffe de substituts cutanés bilamellaires sur des sujets humains au cours des dernières décennies. J'ai trouvé que, bien que plusieurs combinaisons de conditions de culture et de méthodes de production de substituts cutanés puissent mener à l'établissement d'une niche, deux facteurs semblent avoir plus d'importance. Mes résultats indiquent effectivement que l'utilisation d'une couche nourricière ainsi que de sérum - ou d'un remplacement de sérum, tel que de l'extrait de glande pituitaire bovine - dans le milieu de culture sont associés à une meilleure persistance de greffe à long terme. Par la suite, j'ai démontré que l'utilisation d'une couche nourricière d'origine humaine plutôt que murine permettait de maximiser le potentiel prolifératif et la clonogénicité de kératinocytes primaires humains en culture. Cette divergence pourrait s'expliquer par l'activation des voies signalétiques impliquant Akt, STAT5, p53 et AMPKα1. J'ai aussi investigué l'effet du type d'inducteur d'AMP cyclique sur les cultures de kératinocytes et étudié s'il était dépendant du type de couche nourricière employé. Bien que je n'aie pas détecté d'effet d'interaction entre ces facteurs, mes travaux ont cimenté l'isoprotérénol plutôt que la toxine du choléra comme inducteur d'AMP cyclique de choix pour les applications de recherche fondamentale au LOEX. Mes travaux ont ensuite mené à la mise au point d'un système de culture de kératinocytes et de production de substituts cutanés humains avec un milieu sans sérum. En effet, en l'absence d'un milieu sans sérum commercial capable de préserver efficacement les cellules souches épithéliales en culture, mon équipe et moi avons développé ab initio notre propre milieu de culture que nous avons appelé Surge SFM. Contrairement à la norme, ce milieu a été développé pour être utilisé conjointement à une couche nourricière humaine. J'ai démontré que Surge SFM peut être utilisé pour cultiver des kératinocytes fraîchement isolés ainsi que pour amplifier des kératinocytes ayant préalablement été cryopréservés après avoir été cultivés avec du sérum. De plus, mes résultats suggèrent qu'il y a très peu de différences au niveau transcriptomique entre des kératinocytes cultivés avec Surge SFM et le milieu conventionnel avec sérum. D'ailleurs, selon des analyses in silico, ces quelques différences pourraient s'expliquer par une modulation en amont de l'expression d'EHF, un facteur de transcription régulant plus de 400 gènes impliqués dans la différentiation des kératinocytes humains et la formation de l'épiderme. J'ai ensuite montré que ce milieu permet de préserver les populations de cellules souches épithéliales en culture par des essais de clonogénicité et de cytométrie en flux. Finalement, j'ai démontré que ce nouveau milieu chimiquement défini peut être utilisé pour la production de substituts cutanés par autoassemblage et que ces derniers persistent au moins jusqu'à 6 mois après leur greffe sur des souris athymiques, démontrant encore une fois que les cellules souches épithéliales peuvent être préservées avec ce nouveau milieu. Dans l'ensemble, les travaux de cette thèse ont permis de mieux comprendre les facteurs et les conditions favorables à la préservation des populations de cellules souches épithéliales dans les cultures de kératinocytes primaires humains. Ceci a mené au développement d'un nouveau milieu de culture sans sérum permettant la préservation des cellules souches épithéliales lors de la culture de kératinocytes en monocouche et lors de la production de substituts cutanés bilamellaires, ce qui représente une avancée importante dans le domaine du génie tissulaire cutané.

La régulation de l'expression des gènes est à la base de tous processus cellulaires tels que la différenciation, la migration, la réponse aux dommages, la survie et l'apoptose. La compréhension globale des mécanismes cellulaires passe donc par l'étude de la transcription. Définir les rôles, fonctions ainsi que les voies de signalisation pour chacun des facteurs de transcription d'une cellule est maintenant un incontournable dans la poursuite de la compréhension du génome humain. Les travaux de cette thèse cadrent dans cette optique en concentrant nos efforts sur la caractérisation des facteurs de transcription ± nuclear factor I ¿ (NFI). Nous démontrons, entre autre, la première preuve de liaison directe d'un répresseur au promoteur du gène p21. Cette répression exercée par les NFI est essentielle à la bonne progression du cycle cellulaire dans les cellules en prolifération, tout en permettant l'expression basale de p21. Nous avons aussi caractérisé les mécanismes de régulation des facteurs de transcription Spl, Sp3 et NFI sur le promoteur de l'intégrine α6, en présence de laminine et de la fibronectine. Nos résultats suggèrent une répression de l'expression de l'intégrine a6 par la liaison de NFI et la diminution des facteurs Spl et Sp3 en présence de laminine, pour ainsi expliquer les mécanismes de migration et prolifération cellulaire dans un modèle de cicatrisation cornéenne. Finalement, nous examinons l'étendue de la liaison des facteurs NFI dans les kératinocytes humains de peau, par une analyse globale d'immunoprécipitation de chromatine couplée aux puces à ADN îlots CpG, dans le but d'établir une meilleure compréhension des voies de signalisation dans lesquelles les facteurs de transcription NFI sont impliqués. Ces analyses permettront de mieux comprendre les mécanismes de régulation de la transcription, particulièrement en ce qui a trait à la régulation par les facteurs de transcription NFI