Le Trypanosome africain, dont Trypanosoma brucei est le prototype, est un parasite sévissant en Afrique sub-tropicale. Il est responsable de la maladie du sommeil chez l’Homme et de diverses affections chez les animaux tant sauvages que domestiques. T. brucei est un parasite extracellulaire qui se développe dans le sang de son hôte mammifère. Il est donc confronté en permanence au système immunitaire de l’hôte et a en conséquence, afin de générer un environnement plus favorable à sa croissance, établit différents mécanismes d’échappement tels que la variation antigénique ou l’immunomodulation. Dans ce contexte, il a été montré que T.brucei libère des facteurs capables d’induire la voie arginase des macrophages. Cette induction peut favoriser la croissance des trypanosomes dans le sang de leur hôte de diverses manières. Premièrement, l’arginase participe à la synthèse de composés tels que les polyamines ou la trypanothione, facteurs de croissance des cellules. Deuxièmement, l’arginase partage le même substrat que la NO synthase inductible (iNOS), ces deux enzymes sont donc en compétition et l’activation de l’arginase pourrait contribuer à diminuer la quantité de NO, composé cytostatique et cytotoxique, produit par les macrophages en limitant le substrat disponible pour l’iNOS. Troisièmement, la déplétion du milieu en arginine suite à l’activation de l’arginase inhibe la prolifération de cellules du système immunitaire dont les lymphocytes T. Nous avons identifié une chaîne lourde de kinésine chez T.brucei, TbKHC1 (Trypanosoma brucei Kinesin Heavy Chain 1), appartenant à la superfamille des kinésines, comme un candidat potentiellement capable d’induire la voie arginase des macrophages. TbKHC1 est principalement exprimée au stade sanguicole du parasite et est localisée au niveau de la région endo-exocytaire. Dans un modèle d’infection murin, une invalidation de l’expression de TbKHC1 (par ARN interférence ou par knock-out) conduit à une diminution du premier pic de parasitémie et à une prolongation de la survie des souris infectées. Nous avons montré que TbKHC1 joue un rôle dans l’interaction hôte/parasite à deux niveaux indépendants : premièrement, l’induction de la voie arginase des macrophages par TbKHC1 en début d’infection favorise la croissance du parasite et son établissement au sein de son hôte. Deuxièmement, elle joue un rôle dans l’induction de la pathologie liée à l’infection.

Les kinésines sont des protéines moteur liées au cytosquelette de microtubules. Elles convertissent l’énergie provenant de l’hydrolyse de l’ATP en un travail mécanique. Leur fonction typique est de se déplacer le long du microtubule pour véhiculer des charges. La plupart des kinésines sont des dimères. Elles comprennent un domaine moteur, qui porte à la fois les sites de liaison du nucléotide et du microtubule, un domaine intermédiaire de dimérisation et une partie dite « queue » qui confère la spécificité des charges à transporter. Mon objectif est d’établir le mécanisme moléculaire à la base de la motilité, avec un intérêt particulier pour la détermination des variations structurales du domaine moteur de la kinésine le long de son cycle mécano-chimique. Au cours de ma thèse, mon objet d’étude principal a été la kinésine-1 humaine, encore appelée kinésine conventionnelle.J’ai étudié plus particulièrement deux aspects du cycle mécano-chimique de la kinésine-1, en combinant des approches de biologie structurale et l’étude de mutants. Les deux aspects concernent l’étude de la fixation de la kinésine-ADP au microtubule, conduisant à l’éjection du nucléotide et à une liaison forte de la kinésine au microtubule. Dans un premier temps, j’ai déterminé la structure du domaine moteur de la kinésine-1, dépourvue de nucléotide, et sous forme d’un complexe avec la tubuline. La tubuline est la protéine constitutive des microtubules. Cette structure était la donnée principale qui nous manquait dans le cycle structural de la kinésine. En comparant cette structure avec celle de la kinésine dans un état ATP, on peut rendre compte des changements de conformation de la kinésine selon le mouvement de trois sous-domaines du domaine moteur. Cette analyse explique notamment le lien entre la fixation de l’ATP et l’ouverture d’une poche hydrophobe distante de 28 Å du site du nucléotide. Cette cavité va accommoder le premier résidu du neck linker, conduisant à la stabilisation de ce peptide situé en partie C-terminale du domaine moteur. En s’ordonnant, le neck linker va faire avancer la charge ainsi que l’autre domaine moteur de la kinésine dimérique. Il lie ainsi la fixation de l’ATP au mouvement. L’étude de l’effet de mutations du neck linker montre aussi comment, réciproquement, le neck linker bloque la kinésine dans la conformation active pour l’hydrolyse de l’ATP. Ceci diminue la probabilité que l’ATP soit hydrolysé avant que l’étape mécanique se soit produite; cet aspect est essentiel pour rendre compte de la processivité de la kinésine-1.Ces données structurales suggèrent également comment la fixation de la kinésine-ADP au microtubule accélère l’éjection de l’ADP. Pour étudier cet aspect plus en détail, j’ai étudié l’effet de mutations sur la vitesse de largage de l’ADP. L’idée était de mimer à l’aide de mutations la fixation au microtubule. J’ai identifié ainsi deux séries de mutants qui présentent une vitesse accélérée de largage spontané de l’ADP, ce qui suggère deux voies pour interférer avec la fixation du nucléotide. J’ai ensuite déterminé la structure de deux de ces mutants dépourvus de nucléotide, ainsi que celle de la kinésine de départ également dans une forme apo, obtenue par digestion de l’ADP. En absence de microtubule, la kinésine dépourvue de nucléotide adopte une conformation soit à l’image de celle de la kinésine-ADP, ou proche de celle de la kinésine-apo liée à la tubuline. Dans un contexte naturel, seule la deuxième conformation est compatible avec la fixation au microtubule. L’ensemble de ces résultats suggère que le microtubule accélère l’éjection du nucléotide par un double mécanisme : en interférant avec la liaison du magnésium et en déstabilisant le motif P-loop de liaison du nucléotide. / Kinesins are a family of microtubule-interacting motor proteins that convert the chemical energy from ATP hydrolysis into mechanical work. Many kinesins are motile, walking along microtubules to fulfill different functions. Most kinesins are dimers, the monomer comprising a motor domain, a dimerizing stalk domain, and a tail domain. The motor domain contains both the nucleotide-binding site and the microtubule-binding site. I am interested in the molecular mechanism of kinesin's motility. In particular I want to establish the structural variations of the kinesin motor domain along with the mechanochemical cycle of this motor protein. During my thesis, I have focused my work on the human kinesin-1, also named conventional kinesin, which is the best characterized kinesin.I have studied two aspects of the kinesin mechanochemical cycle, by combining structural and mutational approaches. Both aspects rely on the binding of ADP-kinesin to a microtubule, which leads to the release of the nucleotide and to a tight kinesin-microtubule association. First I determined the crystal structure of nucleotide-free kinesin-1 motor domain in complex with a tubulin heterodimer, which is the building block of microtubule. This structure represented the main missing piece of the structural cycle of kinesin. Three subdomains in the kinesin motor domain can be identified through the comparison of my structure with ATP-analog kinesin-1-tubulin structure. The relative movements of these subdomains explain how ATP binding to apo-kinesin bound to microtubule triggers the opening of a hydrophobic cavity, 28 Å distant from the nucleotide-binding site. This cavity accommodates the first residue of the “neck linker”, a short peptide that is C-terminal to the motor domain, allowing the neck linker to dock on the motor domain. The docking of the neck linker is proposed to trigger the mechanical step, i.e. the displacement of the cargo and the stepping of the dimeric kinesin. By studying mutants of the neck linker, I have shown that, reciprocally, this peptide locks kinesin in the ATP state, which is also the conformation efficient for ATP hydrolysis. Doing so, it prevents the motor domain from switching back to the apo-state. It prevents also an untimely hydrolysis of ATP, before the mechanical step has occurred. These features are required for movement and processivity.Second, these structural data also suggest how the binding of ADP-kinesin to tubulin enhances nucleotide release from kinesin. To further study this step of the kinesin cycle, I studied the effect of kinesin-1 mutations. These mutations were designed in isolated kinesin to mimic the state when kinesin is bound to a microtubule. I identified two groups of mutations leading to a high spontaneous ADP dissociation rate, suggesting that there are two ways to interfere with ADP binding. Then I determined the crystal structures of the apo form of two mutants as well as that of the nucleotide-depleted wild type kinesin. It showed that apo-kinesin adopts either and ADP-like conformation or a tubulin-bound apo-like one. In the natural context, the second one is stabilized upon microtubule binding. Overall, the mutational and structural data suggest that microtubules accelerate ADP dissociation in kinesin by two main paths, by interfering with magnesium binding and by destabilizing the nucleotide-binding P-loop motif.

Afin d’assurer les échanges entre ses différents organites, la cellule eucaryote dispose d’un système ingénieux de trafic vésiculaire intracellulaire. Le transport directionnel de divers cargos tels que des organites membranaires et des complexes protéiques est assuré par des moteurs moléculaires auxquels appartiennent les protéines de la superfamille des kinésines (également appelées KIF pour KInesin Family). Celles-ci se servent des microtubules comme rails et se déplacent vers leur extrémité positive. Parmi elles, la kinésine II est composée de KIF3A et KIF3B, deux protéines motrices et de KAP3, une protéine de liaison au cargo à véhiculer. Ce moteur moléculaire est connu pour participer à l’assemblage du cil primaire à la surface des cellules ainsi qu’au trafic plus conventionnel tel que l’acheminement de protéines à la membrane. <p>Afin d’étudier le rôle précis de la kinésine II dans la glande thyroïde, nous avons invalidé spécifiquement le gène Kif3a dans cet organe chez la souris. Bien que cette inactivation ait conduit à un développement complet du tissu thyroïdien, les souris invalidées présentent une hypothyroïdie congénitale caractérisée par des concentrations sériques élevées de TSH et basses de T4. Par la suite, nous avons mis en évidence une expression fortement diminuée du transporteur d’iodure NIS chez ces souris, causant une déficience en iodure intracellulaire, une iodation insuffisante de la thyroglobuline et une sécrétion anormale de l’hormone T4 dans la circulation sanguine. De plus, ex vivo, nous avons montré que la réponse à la TSH en terme d’AMPc est altérée dans la thyroïde de ces souris. Ces observations nous ont permis d’émettre l’hypothèse que l’invalidation du gène Kif3a spécifiquement dans la glande thyroïde mène à une anomalie dans la voie de signalisation du récepteur de la TSH, en amont de la production d’AMPc. Finalement, in vitro, par l’utilisation de cellules Kif3a-/-, nous avons analysé l’expression à la membrane plasmique et la réponse à un agoniste du récepteur β2 adrénergique, un membre de la même sous-famille de récepteurs couplés aux protéines G que le récepteur de la TSH. De cette façon, nous avons obtenu des données indiquant que le transport de ce récepteur à la surface cellulaire était altéré en l’absence de Kif3a. <p>Au vu de ces éléments et de ceux de la littérature, nous suggérons que la kinésine II, et plus particulièrement sa sous-unité KIF3A, joue un rôle important dans le transport du récepteur de la TSH nouvellement synthétisé vers la membrane basale de la cellule de la thyroïde.<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le paludisme est causé par des parasites du genre Plasmodium et la gamétogenèse est une étape essentielle à sa transmission. Afin d'améliorer les connaissances sur la genèse des gamètes, nous avons mené des études protéomiques sur des gamétocytes de P. berghei sauvages ou mutants avec le gène moteur de la kinésine 8 interrompu. Le mutant est morphologiquement semblable au type sauvage mais incapable de compléter la gamétogenèse et les gamètes mâles d'exflageller. A partir d'échantillons enrichis en gamétocytes, la gamétogenèse a été suivie sur 15 min après induction par l'acide xanthurénique. Les peptides marqués par iTRAQ à partir de triplicatas biologiques ont été analysés par nanoLC/MS-MS et interprétés par les logiciels Patternlab et Blast2GO. Les phosphopeptides ont été enrichis au TiO2. Chez le parasite sauvage, 443 protéines et 206 phosphoprotéines ont été identifiées à partir de 2617 peptides et chez le mutant, 530 protéines et 218 phosphoprotéines à partir de 3198 peptides. L'induction de la gamétogenèse est marquée par une transcription, une biosynthèse de protéines et de l'ADN importantes. Chez le mutant, la formation des fuseaux mitotiques et des axonèmes des flagelles des gamètes mâles est fortement affectée. Des protéines du complexe du protéasome dépendant de l'ubiquitine, de la réponse au stress, du métabolisme énergétique sont également affectées. Cette étude apporte de nouveaux éléments de compréhension sur le rôle joué par la kinésine 8 dans la gamétogenèse de Plasmodium. / Malaria is caused by parasites from Plasmodium genus and its gametogenesis is an essential step to ensure the malaria transmission. In efforts to improve the knowledge on gamete biology we did quantitative proteomic and phosphoproteomic comparative experiments with P. berghei WT and gametocytes disrupted for the motor gene kinesin 8. The mutant is morphologically similar to wild-type parasite but impaired gametogenesis and unable to exflagellate. The Gametocytes-enriched sample from mice at time T0 were xanthurenic acid-induced to exflagellate and harvested at time T7 and T15. The iTRAQ labelled peptides from independent biological triplicate sample were analyzed overtime through nanoLC/MS-MS Orbitrap after TiO2 enrichment, and interpreted by Patternlab and Blast2GO softwares. The wild type had 443 proteins and 206 phosphoproteins identified from 2,617 peptides. The mutant had 530 proteins and 218 phosphoproteins identified from 3,198 peptides. GO biological processes related to RNA translation, DNA and protein biosynthesis were most prominent and phosphorylated proteins are mainly RNA, ATP or protein binding proteins. Within the mutant, the axoneme and mitotic spindle microtubules disorganization were strongly affected. The nucleosome components are key to nuclear division disorganization. The ubiquitin-dependent proteasome complex and stress/folding response, energy metabolism and egress proteins were affected. The Plasmodium proteomic approach brings that insight into kinesin 8 critical importance for male gametogenesis in Plasmodium with effect on protein expression, phosphorylation modulation, flagellar organization and biology.

Le Trypanosome africain, dont Trypanosoma brucei est le prototype, est un parasite sévissant en Afrique sub-tropicale. Il est responsable de la maladie du sommeil chez l’Homme et de diverses affections chez les animaux tant sauvages que domestiques.<p><p>T. brucei est un parasite extracellulaire qui se développe dans le sang de son hôte mammifère. Il est donc confronté en permanence au système immunitaire de l’hôte et a en conséquence, afin de générer un environnement plus favorable à sa croissance, établit différents mécanismes d’échappement tels que la variation antigénique ou l’immunomodulation. <p><p>Dans ce contexte, il a été montré que T.brucei libère des facteurs capables d’induire la voie arginase des macrophages. Cette induction peut favoriser la croissance des trypanosomes dans le sang de leur hôte de diverses manières. Premièrement, l’arginase participe à la synthèse de composés tels que les polyamines ou la trypanothione, facteurs de croissance des cellules. Deuxièmement, l’arginase partage le même substrat que la NO synthase inductible (iNOS), ces deux enzymes sont donc en compétition et l’activation de l’arginase pourrait contribuer à diminuer la quantité de NO, composé cytostatique et cytotoxique, produit par les macrophages en limitant le substrat disponible pour l’iNOS. Troisièmement, la déplétion du milieu en arginine suite à l’activation de l’arginase inhibe la prolifération de cellules du système immunitaire dont les lymphocytes T.<p><p>Nous avons identifié une chaîne lourde de kinésine chez T.brucei, TbKHC1 (Trypanosoma brucei Kinesin Heavy Chain 1), appartenant à la superfamille des kinésines, comme un candidat potentiellement capable d’induire la voie arginase des macrophages. TbKHC1 est principalement exprimée au stade sanguicole du parasite et est localisée au niveau de la région endo-exocytaire. Dans un modèle d’infection murin, une invalidation de l’expression de TbKHC1 (par ARN interférence ou par knock-out) conduit à une diminution du premier pic de parasitémie et à une prolongation de la survie des souris infectées. Nous avons montré que TbKHC1 joue un rôle dans l’interaction hôte/parasite à deux niveaux indépendants :premièrement, l’induction de la voie arginase des macrophages par TbKHC1 en début d’infection favorise la croissance du parasite et son établissement au sein de son hôte. Deuxièmement, elle joue un rôle dans l’induction de la pathologie liée à l’infection. <p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Salmonella est un pathogène intracellulaire qui établit une niche de réplication (SCV) grâce à l’activité des toxines que la bactérie injecte dans le cytosol des cellules infectées. La Kinésine-1, une protéine moteur des microtubules, est la cible de certaines de ces toxines. Ce travail démontre le rôle critique de la kinésine-1 pour la formation de tubules membranaires induits par Salmonella et qui émanent des SCVs. Des travaux antérieurs avaient montré que la toxine PipB2 lie la kinésine-1 à la SCV. Nos résultats écartent une interaction potentielle de PipB2 avec d’autres protéines moteur et renforcent l’idée d’une activité spécifique du couple PipB2/kinésine-1. Grâce à l’utilisation de systèmes in vitro, nous avons montré que: 1) l’activité du complexe PipB2/Kinésine-1 est suffisante pour permettre la formation de tubules membranaires à partir de vésicules artificielles; 2) PipB2 lie et active le moteur moléculaire qui s’engage alors sur les microtubules. Il a été suggéré que la protéine de l’hôte SKIP activait la kinésine-1 en se liant à la toxine SifA. Ce travail met en lumière un mécanisme plus précis grâce à un partenariat entre PipB2 et SifA. / Salmonella is an intracellular pathogen that establishes a replication niche (SCV) through the activity of toxins that the bacterium injects into the cytosol of infected cells. Kinesin-1, a microtubule motor protein, is the target of some of these toxins. This work demonstrates the critical role of kinesin-1 in the formation of Salmonella-induced membrane tubules emanating from the SCVs. Previous work has shown that PipB2 toxin binds kinesin-1 to the SCVs. Our results rule out a potential interaction of PipB2 with other motor proteins and reinforce the idea of a specific activity of the PipB2/kinesin-1 pair. Through the use of in vitro systems, we have shown that: 1) the activity of the PipB2/Kinesin-1 complex is sufficient to pull membrane tubules from artificial vesicles; 2) PipB2 binds and activates the molecular motor which then engages on the microtubules. It has been suggested that the host protein SKIP activates kinesin-1 by binding to the SifA toxin. This work highlights a more precise mechanism thanks to a partnership between PipB2 and SifA.

Les tubes de membrane sont omniprésents dans les cellules vivantes eucaryotes. Ce sont des structures très dynamiques qui permettent en particulier la communication entre les différents compartiments de la cellule. Pour comprendre les mécanismes impliqués dans le trafic intracellulaire, il paraît essentiel d'isoler le rôle des différents constituants impliques. Dans ce but, un système minimal qui permet de mimer in vitro les différentes étapes d'extraction, de croissance et d'arrêt des tubes de membrane avec des éléments purifies ou artificiels (kinesines, microtubules, vésicules géantes unilamellaires) a été utilise. La comparaison des résultats expérimentaux avec ceux obtenus par une analyse théorique du système a ainsi permis de caractériser de fa¸con complète ces différentes étapes. Nous avons notamment montre l'existence d'un seuil de formation de tubes qui dépend essentiellement de deux paramètres non locaux supramoléculaires : la tension de membrane et la quantité de kin'esines 'a la surface des vésicules. Lorsque le tube est forme, nous avons évalue le nombre de moteurs qui le tirent et montre qu'ils s'accumulent de fa¸con dynamique au bout du tube. De la mesure de la longueur caractéristique d'accumulation, nous avons déduit un paramètre moléculaire : le taux d'attachement des kin'esines sur un microtubule dans une géométrie proche de celle observée in vivo. Enfin, nous avons mis en évidence un phénomène d'oscillations liées au comportement collectif de moteurs processifs pour des tubes très longs. Ce système, bien que simplifie, permet d'apporter une nouvelle approche du trafic intracellulaire, en proposant des mécanismes physiques qui sont souvent masques, dans les cellules, par des mécanismes mol'eculaires.

Les cils et les flagelles sont des organites présents à la surface cellulaire. Ils sont conservés chez les eucaryotes chez lesquels ils jouent un rôle essentiel dans la régulation de nombreux processus physiologiques. La zone de transition (ZT) est une structure complexe, localisée à la base des cils, qui assure une fonction importante dans l'assemblage et la régulation du trafic des constituants ciliaires. Trois complexes protéiques ont été identifiés à la ZT : MKS-JBTS, NPHP1-4-8 et NPHP5-CEP290. D'autres protéines sont également situées à la ZT telles que CBY et AZI1 mais leur interaction avec ces trois modules reste encore peu connue. Chez l'Homme, des mutations de gènes codant des protéines de la ZT sont associées à des maladies génétiques rares, les ciliopathies. Deux modes d'assemblage des cils ont été décrits : la ciliogenèse compartimentée et la ciliogenèse cytosolique. Alors que la fonction de la ZT au cours de la ciliogenèse compartimentée a été bien étudiée, son rôle dans la ciliogenèse cytosolique reste peu connu. La Drosophile possède deux sortes de cellules ciliées, les neurones sensoriels et les flagelles de spermatozoides dont les cils s'assemblent selon ces deux modes d'assemblage. Au cours de ma thèse, j'ai utilisé ce modèle pour analyser la fonction des protéines de la ZT dans ces deux types cellulaires. Mes résultats montrent que les protéines MKS ne jouent pas un rôle essentiel dans l'assemblage de la ZT dans ces deux types cellulaires. J'ai aussi révélé que CBY et AZI1, coopèrent pour assembler la ZT et qu'elle est nécessaire à l'ancrage du corps basal à la membrane plasmique. De plus, mes travaux ont démontré que KLP59D, une kinésine dépolymérisante des microtubules, est indispensable à la régulation de l'élongation de l'axonème au cours de la ciliogenèse cytosolique. En conclusion, ce travail apporte de nouvelles connaissances sur la dynamique d'assemblage de la ZT des cils et sur les mécanismes qui contrôlent l'élongation de l'axonème / Cilia and flagella are cellular organelles that protrude at the cell surface. They are composed of a microtubular cytoskeleton and they are highly conserved across eukaryotic species from plantae to Human. In mammals, they play essential functions during development and regulate numerous physiological processes in adults. At the ciliary base a complex structure called transition zone (TZ) is necessary for cilia assembly and regulation of ciliary components trafficking inside the cilia. Three protein complexes have been identified at the TZ : MKS-JBTS, NPHP1-4-8 and NPHP5-CEP290. Other TZ proteins such as CBY and AZI1 have been studied but their interaction with these 3 modules is not yet elucidated. In Human, mutations of genes encoding TZ proteins are associated with several genetic diseases called ciliopathies. Two different modes of cilia assembly have been identified: compartimentalized and cytosolic ciliogenesis. While TZ function in compartimentalized ciliogenesis is well studied, its role in cytosolic ciliogenesis remains poorly understood. In Drosophila, there are only two types of ciliated cells, sensory neurons and sperm flagella, representative of these two ciliogenesis pathways. During my PhD, I used Drosophila to study the function of TZ proteins during cilia assembly in these two ciliated cell types. My data show that proteins of the MKS complex do not play an essential role in TZ assembly in the cilia of sensory neurons and in spermatozoon flagella. I also demonstrated that CBY and AZI1 cooperate to assemble the TZ components and that the TZ is necessary to dock the basal bodies to the plasma membrane, one of the first important step in cilia assembly. Finally, I showed that KLP59D, a microtubule-depolymerising kinesin, is required to control axoneme elongation during the cytosolic ciliogenesis. In conclusion, this work brings new insights into the understanding of the dynamic assembly of TZ proteins and the mechanisms that regulate flagella elongation

(I) J'ai étudié les mécanismes contrôlant la congression des noyaux pendant la conjugaison de la levure S. pombe. A l'aide d'imagerie à long terme basée sur la microfluidique, j'ai mesuré la durée précise de la congression nucléaire et démontré que deux moteurs moléculaires des MTs, la dynéine et la kinésine-14 Klp2 contribuent à ce processus, dans des voies parallèles. La dynéine s’associe aux SPBs. Son niveau au SPB dépend de la chaine légère intermédiaire Dli1 qui pourrait potentiellement stabiliser le complexe dynéine et est requise pour la congression. Klp2 se localise sur les MTs. La localisation différentielle des deux moteurs suggère des rôles distincts pour tirer les noyaux l'un vers l'autre. Klp2 pourrait induire le glissement de MTs antiparallèles émanant des SPBs, alors que la dynéine localisée au SPB pourrait tirer sur des MTs émanant du SPB opposé.(II) J'ai caractérisé un nouveau facteur morphogénétique, l’AAA+-ATPase Knk1, qui promeut la croissance linéaire chez S. pombe. L’absence de Knk1 provoque la formation d’un coude à proximité des extrémités cellulaires. Ce défaut ne résulte pas de défauts des MTs, qui participent à la linéarité de la croissance. Knk1 se localise aux extrémités de la cellule indépendamment des MTs et des câbles d’actine. Cette localisation requiert son N-terminus et est renforcée quand le domaine ATPase C-terminal lie l’ATP. La concentration de Knk1 aux extrémités est aussi contrôlée par Sla2 et Cdc42, de manière anti-correlée, et indépendamment de l’endocytose. Enfin, Knk1 oscille périodiquement entre les deux extrémités, indépendamment des oscillations de Cdc42, suggérant l'existence d'au moins deux systèmes oscillatoires séparés. / (I) I studied the molecular mechanisms underlying nuclear congression during fission yeast conjugation. Using microfluidic-based long-term imaging, I defined the precise timing of nuclear congression compared to cell mating and found that two MT molecular motors, dynein and the kinesin-14 Klp2 promote nuclear congression in parallel pathways. Dynein associates with SPBs. Dynein level at SPBs is controlled by the light intermediate chain Dli1 that may promote stabilization of the dynein complex and is essential for dynein-dependent nuclear congression, while dynactin is surprisingly not required for this process. Klp2 localizes along MTs. These differential localization patterns suggest distinct roles for the two motors in pulling the nuclei together: Klp2 may slide anti-parallel MTs emanating from the SPBs, while dynein at the SPB may pull on MTs emanating from the opposite SPB.(II) I characterized a novel morphogenetic factor, the AAA+-ATPase Knk1, supporting linear growth in fission yeast. knk1Δ cells display a kink close to cell tips, a unique shape phenotype that is neither caused by defects in behavior of MTs that promote linear extension. Knk1 localizes to cell tip independently of MTs and actin cables. This localization is mediated by Knk1 N-terminus and enhanced upon ATP binding to Knk1 C-terminal ATPase domain. Knk1 tip levels are enhanced in a sla2 or cdc42, independently of Sla2 role in endocytosis. Finally, Knk1 oscillates between the two cell tips in an anti-correlated periodic manner possibly uncoupled from Cdc42 oscillations suggesting the existence of at least two separated oscillatory systems contributing to fission yeast morphogenesis.

Le parasite Trypanosoma brucei est retrouvé en Afrique sub-Saharienne et est responsable de la maladie du sommeil chez l’homme et de la Nagana chez les animaux. Il cause de graves problèmes sanitaires et économiques car il affecte le bétail. La vaccination est impossible à cause de la variation antigénique. Les traitements actuels sont difficiles à mettre en place avec des effets secondaires importants. Il est donc urgent de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques afin de développer de nouveaux médicaments. T. brucei possède un flagelle unique qui émerge de la cellule par une structure appelée la poche flagellaire (FP). Cette FP est une invagination de la membrane plasmique. Elle est nécessaire à la survie du parasite car c’est le seul site d’endo- et d’exocytose. Au cou de la FP on trouve le collier de la poche flagellaire (FPC) en forme d’anneau. Le FPC est composé de nombreuses protéines dont BILBO1 qui est nécessaire à la biogenèse de la FP et du FPC. De nombreux partenaires de BILBO1 ont été identifiés. Dans cette thèse, je caractérise deux d’entre eux : FPC5, une kinésine putative et FPC9, une synaptotagmine putative. J’ai pu montrer que FPC5 est localisée aux corps basaux mais aussi au FPC. Cette protéine n’est pas essentielle à la survie des parasites bien que des phénotypes de croissance et de ségrégation de la FP apparaissent après induction de l’ARNi. Nous ne sommes pas parvenus à prouver sa fonctionnalité, cependant j’ai pu montrer que son domaine moteur est capable de lier les microtubules. FPC9 est trouvée au niveau de la zone de transition du flagelle. L’ARNi contre cette protéine n’étant pas effectif, nous ne pouvons pas conclure quant à sa fonction dans la cellule. / Trypanosoma brucei is a parasite found in sub-Saharan Africa and is responsible for sleeping sickness in humans and Nagana in animals. It is the source of serious health and economic problems because it kills livestock. Vaccination is not possible because of antigenic variation and current treatments are difficult to implement or have toxic side effects. For these reasons it is urgent to find new therapeutic targets in order to develop effective treatments. T. brucei has a single copy flagellum that emerges from the cytoplasm through a unique structure called the Flagellar Pocket (FP). This pocket is an invagination of the pellicular membrane and because it is the sole site of endo- and exocytosis, it is essential for parasite survival. At the neck of the FP there is a cytoskeletal structure: the Flagellar Pocket Collar (FPC) that forms a “ring” around the flagellum. The FPC consists of numerous proteins, including the first to be identified - BILBO1, which is necessary for FP and FPC biogenesis. A number of potential BILBO1 partners were identified. In this thesis I characterize two of these proteins: FPC5, a putative kinesin and FPC9, a putative synaptotagmin. I show that FPC5 localizes mainly in the basal body area, but also at the FPC. This protein is not essential for parasite survival although reduced FP segregation and growth phenotypes appear after RNAi induction. We are not able to prove its functionality, however I could show its motor domain is able to bind microtubules. FPC9 is found in the transition zone of the flagellum. However RNAi knockdown against this protein was not efficient, so we are currently unable to define a function for this protein.